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一种用于研究磷脂酰肌醇磷酸基团对毒液PLA2膜向性作用影响的脂质体膜通透性检测方法

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DOI：

10.3791/68594

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2025年9月26日

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1Advanced STEM Research Center, Beijing Chaoyang KaiWen Academy, 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Department of Pharmacology, University of Nevada Reno, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University

本文内容

摘要

我们提出了一种经济高效的方法，用于评估脂质体膜通透性，其灵敏度和分辨率优于传统技术。该方法利用一种新型的包封配体取代反应，可检测磷脂酶A2诱导的模型膜变化。此方法易于与标准分析整合，是一种便捷的技术，可提高研究膜生物物理学及毒素相互作用的分辨率。

摘要

我们开发了一种基于脂质体内腔包封配体的配体置换反应的新型、低成本且高灵敏度的检测方法，用于评估脂质体膜的通透性，并将该方法与水解活性检测（利用辅酶A酰化）及分子模拟相结合，以研究磷脂酰肌醇肌醇环上的磷酸基团是否能够保护膜免受异常表达酶的损伤作用。磷脂酶A2（PLA2）的异常表达会导致轴突脱髓鞘，进而引发多发性硬化症和阿尔茨海默病。为模拟异常表达PLA2的作用，我们采用了蝰蛇毒液PLA2的基本亚基HDP-2P。该HDP-2P被用于测试含有磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI-4-P）或磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI-4,5-P2）的磷脂酰胆碱（PC）脂质体。尽管HDP-2P在PC脂质体中表现出极低的水解活性且仅轻微增加通透性，但在PC脂质体中添加PI则显著增强了水解作用和通透性。值得注意的是，PI-4-P和PI-4,5-P2 显著抑制了HDP-2P的水解活性，并完全降低了膜通透性。分子模拟结果显示，磷脂酰肌醇肌醇环上的磷酸基团通过空间位阻阻碍磷脂进入HDP-2P的活性位点，从而阻止水解反应的发生。体外（in vitro）和计算机模拟（in silico）数据均表明，磷酸化的磷脂酰肌醇与PLA2 活性降低相关，提示其可能作为一种减轻过度PLA2活性的潜在机制——可能是保护细胞膜免于退化的生理手段。

引言

磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）是一种阴离子磷脂，由磷脂酸骨架通过磷酸基团连接肌醇（一种六羟基六元碳环）构成。肌醇可在2、3、4、5和6位碳原子上通过可逆的磷酸化反应转化为磷脂酰肌醇磷酸酯（phosphoinositides）1磷脂酰肌醇及其磷脂酰肌醇衍生物存在于动物、植物和微生物等多种细胞的质膜和细胞器中。自Mable和Lowell Hokin发现这些物质以来已有七十年2,3,4，PI及磷脂酰肌醇类分子仍是广泛研究的对象，旨在阐明其分子机制及其在人类健康中的作用5,6,7.

除了脑组织外，磷脂酰肌醇通常含量较低，约占质膜内小叶总脂质的0.5%至1%。已有研究数据表明，在生理条件下，磷脂酰肌醇（PI）不太可能发挥主要的结构作用1。然而，在疾病状态下，PI和磷脂酰肌醇的水平会升高，并翻转至质膜的外小叶，提示这些磷脂可能与疾病抵抗相关1。尽管长期以来认为PI在生理功能中的作用较磷脂酰肌醇次要，但新出现的证据强调了PI-4-P和PI-4,5-P2在多种生理过程中的重要性1。这些过程包括细胞内信号传导、细胞间信号转导8,9,10、膜运输11,12,13、基因表达的调控1，以及细胞增殖14和存活1。尽管如此，PI和磷脂酰肌醇驱动这些过程的分子机制仍不清楚。

磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰肌醇磷酸酯在脑组织细胞中含量丰富，约占总磷脂的10%，尽管其水平可能在脑部疾病的早期阶段短暂升高，提示磷脂酰肌醇磷酸酯可能对抗由异常PLA2活性引发的轴突脱髓鞘所导致的神经病理学变化1，例如多发性硬化症和阿尔茨海默病15,16,17。这些酶属于多个类别和组别，包括IIA型分泌型磷脂酶A2（sPLA2）15。在多发性硬化症和阿尔茨海默病患者的脑脊液中可检测到该类酶水平升高，其参与髓鞘膜的降解，导致脱髓鞘15。另有报道指出，蛇毒中的sPLA2可抑制神经肌肉突触的信号传递18,19，引起中枢神经系统紊乱，并对周围神经肌肉系统产生不利影响20。

本研究探讨了磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰肌醇磷酸盐是否能够保护模型磷脂膜免受异常表达的sPLA2酶的影响。模型膜由磷脂酰胆碱（PC）构成，PC是所有哺乳动物细胞膜中最丰富的磷脂21，并添加了摩尔比为20%的PI、PI-4-P或PI-4,5-P2。为了模拟异常表达的sPLA2酶对模型膜的作用，我们采用了IIA型分泌型蝰蛇毒液神经毒性PLA2酶的基本亚基HDP-2P22，其水解活性此前已在模型髓鞘膜上进行过研究23。

在本研究中，我们开发了一种新方法，用于研究HDP-2P对脂质体膜通透性的影响。该新方法基于脂质体外CuSO4溶液中发生的配体置换反应，其中脂质体内包裹有NH3配体。若HDP-2P诱导的膜通透性导致NH3从脂质体中泄漏，释放出的氨将通过以下反应定量取代水合铜离子中的四个水分子：[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) 静态平衡；ΣFx=0；矢量图；力，平衡，物理，分析。 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)。该配体交换反应会产生特征性的溶液光密度升高，可通过分光光度法（λ = 600 nm）进行测量，作为我们定量评估膜通透性变化的读数。与传统的1H-NMR23,24,25,26,27,28和离子转运实验29等技术相比，我们基于配体置换的方法在评估膜通透性方面表现出更高的灵敏度，同时还具有无需昂贵仪器的优点。这一简单且经济高效的方法，结合HDP-2P水解活性的测定以及PI、PI-4-P和PI-4,5-P2与HDP-2P分子表面结合的in silico模拟，使我们得出结论：PI肌醇环上的磷酸基团可消除HDP-2P对富含PI-4-P或PI-4,5-P2的PC膜的破坏作用。若该发现能在后续研究中得到证实，则PI肌醇环磷酸基团抵御异常活性细胞蛋白有害影响的能力，可能有助于在涉及蛋白质异常活性的疾病状态下维持膜的稳定性，从而为开发治疗阿尔茨海默病和多发性硬化等神经系统疾病的新药铺平道路。

方案

1. 计算机模拟 使用分子建模软件模拟HDP-2P与PI及磷脂酰肌醇类分子的相互作用

  1. 软件安装与准备
    1. 安装指定的化学绘图编辑器，用于构建配体分子，如补充文件1-补充图S1A所示。
    2. 安装分子建模软件，用于配体与受体的分子对接。
    3. 安装用于配体和受体准备的自动化对接工具。
    4. 由于分子建模模拟软件依赖于Python环境，需安装Python。
  2. 配体准备
    1. 首先，使用化学绘图编辑器构建PI、PI-4-P、PI-4,5-P2、心磷脂和磷脂酰丝氨酸分子结构的原子坐标。
      ​注意：后续配体准备步骤中的示例方案仅以PI为例进行说明。
    2. 使用化学绘图编辑器构建PI的分子结构，如补充文件1-补充图S1B所示，并将文件保存为PDB格式，如补充文件1-补充图S2所示。
    3. 在自动化对接工具软件中打开该PDB文件，如补充文件1-补充图S3A所示。
    4. 添加氢原子，如补充文件1-补充图S3B所示，并选择极性氢或全部氢原子，如补充文件1-补充图S4A所示。
      注意：在完成PI与HDP-2P的对接后，仅选择极性氢原子，以便简化极性键或氢键的可视化。
    5. 将PI分子设置为自动化对接工具软件中的配体，如补充文件1-补充图S4B所示。
    6. 将配体保存为PDBQT文件，如补充文件1-补充图S5A所示。确保所有键均可旋转。
  3. 受体准备
    1. 下载磷脂酶A2 HDP-2的PDB文件（PDB编号2I0U），该结构包含两个单体，其中一个是酸性、无酶活性的A单体，另一个是碱性、有酶活性的E单体。为删除无酶活性的A单体，将2I0U文件导入分子建模软件（补充文件1-补充图S5B），选中A单体的所有原子（补充文件1-补充图S6A），然后进入编辑菜单并删除A单体的所有原子（补充文件1-补充图S6B）。保留具有酶活性的E单体，该单体现被指定为受体。
    2. 在自动化对接工具软件中打开HDP-2P受体的PDB文件，如补充文件1-补充图S7所示。
    3. 移除所有水分子，如补充文件1-补充图S8A所示。
    4. 添加氢原子，如补充文件1-补充图S8B所示。请注意，在完成HDP-2P与PI的对接后，仅选择极性氢原子，以便简化极性和氢键的可视化。
    5. 将HDP-2P设置为受体，如补充文件1-补充图S9A所示，并将其保存为PDBQT文件。确保受体设置中不含可旋转键。
  4. 对接参数设置
    1. 同时打开配体和受体的PDBQT文件。
    2. 进入网格框设置界面，如补充文件1-补充图S9B所示，定义网格框尺寸（x尺寸 = 44.644；y尺寸 = 74.939；z尺寸 = 43.050）和中心坐标（x中心 = 25.626；y中心 = 9.582；z中心 = 41.825），确保完全覆盖受体分子的整个表面，如补充文件1-补充图S10A所示。
    3. 使用当前设置关闭网格框设置界面，如补充文件1-补充图S10B所示，并将对接参数保存为config.txt文件，如补充文件1-补充图S11A所示。
  5. 运行分子对接软件
    1. 使用config.txt文件启动分子对接软件，如补充文件1-补充图S11B所示。
    2. 执行对接计算（约30-90分钟；补充文件1-补充图S12）。
    3. 检查docking_log.txt文件，查看对接得分（结合亲和力）。
    4. 选择能量最低构象的对接结果。
  6. 对接数据分析
    1. 使用自动化对接工具软件打开对接结果的PDBQT文件。
    2. 分析配体-受体结合位点，重点关注受体的活性中心以及分子间相互作用，包括离子、离子-极性、极性和氢键相互作用。制作PI和磷脂酰肌醇的表格，描述其与受体活性位点相互作用时的结合位点亲和力（kcal/mol）、PI/磷脂酰肌醇极性头部的带电和极性基团、参与分子间键合的HDP-2P残基及键的类型，如表1和表2所示。对每一对受体-配体组合重复对接3次，以确保结合位点、结合亲和力、PI/磷脂酰肌醇的带电和极性基团、HDP-2P残基以及键的类型无偏差。

2. 使用与游离脂肪酸酰化的辅酶A监测HDP-2P在富含PI、PI-4-P、PI-4,5-P2、PS或CL的PC脂质体中的水解活性

注意：氯仿、甲醇、NH3 和 CuSO4 具有危害性。操作时务必佩戴腈类手套、护目镜和实验服。所有涉及这些试剂的实验步骤均应在通风橱内进行。氯仿应储存于棕色玻璃瓶中。甲醇应储存于易燃品专用柜中，远离氧化剂，并避免接触火焰和火花。所有盛装这些试剂的废液容器均应贴上标签，并根据当地危险废物处理规定进行处置。

  1. 通过将 5.55 mg 的 CaCl2 溶解于 0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）中，配制 100 mL 用于 HDP-2P 催化磷脂水解的缓冲溶液。
  2. 将 7.31 g EDTA 溶解于去离子蒸馏水（ddH2O）中，配制 50 mL 的 1.0 M EDTA 储备液。
  3. 在 0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）中配制 0.54 mM 的 HDP-2P 储备液。HDP-2P 的摩尔质量为 13.827 kDa。
  4. 在氯仿/甲醇混合液（体积比 2:1）中配制以下磷脂的 10.0 M 储备液：蛋黄 L-α-磷脂酰胆碱（PC）、牛心 心磷脂（CL）、牛脑 L-α-磷脂酰-L-丝氨酸（PS）、PI、PI-4-P 和 PI-4,5-P2。PC、CL、PS、PI、PI-4-P 和 PI-4,5-P2 的摩尔质量分别为 768 Da、1,466 Da、792 Da、867 Da、962 Da 和 1,057 Da，具体如下所述。
  5. 制备五份 PC 脂质体样品。为制备一份 PC 脂质体样品，将 75 µL 的 PC 氯仿/甲醇储备液加入玻璃试管中，在 10 Pa 真空条件下于 25 °C 干燥 1 小时，直至形成脂质膜。在恒温器中于 25 °C 下用 15 mL 磷脂水解缓冲液水合脂质膜 1 小时。然后，将功率为 100–150 W 的超声波分散仪的钛探头插入置于冰浴中的玻璃试管内的脂质悬浮液中，在 22 kHz 频率下超声处理 10 分钟，功率不超过最大功率的 50%。为去除钛“粉尘”颗粒，在室温下以 200 × g（使用 10 cm 转子时为 1,270 rpm）离心 10 分钟以纯化脂质体。
  6. 通过将氯仿/甲醇磷脂储备液在玻璃试管中混合（PC 60 µL 与 CL、PS、PI、PI-4-P 或 PI-4,5-P2 各 15 µL），按 PC 与其他磷脂摩尔比 4:1 制备含 CL、PS、PI、PI-4-P 或 PI-4,5-P2 的 PC 脂质体样品。随后，在 10 Pa 真空下干燥脂质，或在室温下干燥 3 小时，再用磷脂水解缓冲液水合脂质膜，并按上述方法进行超声处理。
    注：每种类型的脂质体制备五份样品。
  7. 从上述每种类型的五份脂质体样品中各取 1.0 mL 分别加入不同的试管中，向每支试管中加入 10 µL NEFA 试剂盒中的无色辅酶 A 溶液，然后分别向不同试管中加入 0.00、0.93、1.86、2.79 或 3.72 µL 的 0.54 mM HDP-2P 储备液，使脂质体样品中的 HDP-2P/磷脂摩尔比分别为 0.000、0.001、0.002、0.003 和 0.004。
  8. 在向脂质体中加入 HDP-2P 后立即于 37 °C 恒温条件下孵育 15 分钟，然后加入 100 µL EDTA 储备液终止 HDP-2P 诱导的磷脂水解反应。随后，将样品涡旋振荡 1 分钟。
  9. 通过分光光度计在 550 nm 处测定脂质体样品的光密度，以量化 HDP-2P 的水解活性，该检测反映无色辅酶 A 溶液在与游离脂肪酸发生酰化后变为紫色的程度。
  10. 重复上述步骤两次，使平均光密度值来自三次独立实验。
    注：本实验中获得的每个数据点均为光密度的平均值。理想情况下，实验数据点的标准偏差应在平均值的 ±5% 范围内。

3. 通过CuSO​4溶液中包埋于脂质体内的NH3配体参与的配体置换反应，测定HDP-2P对富含PI、PI-4-P、PI-4,5-P2、PS或CL的PC脂质体膜通透性的影响

注意：氯仿、甲醇、NH3 和 CuSO4 具有危害性。操作时务必佩戴腈类手套、护目镜和实验服。所有涉及这些试剂的实验步骤均须在通风橱内进行。氯仿应储存于棕色玻璃瓶中。甲醇应储存于易燃品专用柜中，远离氧化剂，并避免接触火焰或火花。所有盛装这些试剂的废液容器均需贴上标签，并依照当地危险废物处理法规进行处置。

  1. 分别用氯仿/甲醇（2:1 体积比）配制 20 mL 的 0.03 M 六种磷脂储备液——PC、CL、PS、PI、PI-4-P 和 PI-4,5-P2。PC、CL、PS、PI、PI-4-P 和 PI-4,5-P2 的分子量分别为 768、1466、792、867、962 和 1057 Da。
  2. 配制 100 mL 含 0.05 M CuSO4 的 0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）。
  3. 用含 0.05 M CuSO4 的 0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）配制 4 mL 的 1.5 × 10-3 M HDP-2P 储备液。HDP-2P 的摩尔质量为 13.827 kDa。
  4. 配制 100 mL 的 0.5 M NH3 溶液时，使用 25% NH3 溶液（密度为 905 g/L30，相当于 13.30 M [905 g/L × 0.25 M ÷ 17.00 g/L = 13.30 M]）。因此，配制 100 mL 的 0.5 M NH3 溶液需取 3.76 mL 的 25% NH3 溶液：(0.5 M × 1,000 mL ÷ 13.30 M) ÷ 10 = 3.76 mL 的 25% NH3 溶液。将 3.76 mL 的 25% NH3 溶液加入 100 mL 容量瓶中，并用 0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）定容至 100 mL。
  5. 为制备内腔含有 NH3 的脂质体，取 12.5 mL 氯仿/甲醇中的 0.03 M 磷脂储备液置于试管中，在 10 Pa 真空条件下或室温下干燥 3 小时以除去溶剂。将所得磷脂膜在 25 °C 恒温条件下，用 12.5 mL 的 0.5 M NH3、0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）水化 1 小时；然后按照步骤 2.5 所述条件，在 22 kHz 频率下对脂质悬浮液进行超声处理，以制备超声处理后的脂质体。
    注意：在超声处理后的脂质体溶液中，NH3 存在于脂质体内外两侧。
  6. 为去除脂质体外部的 NH3，使用截留分子量为 1.0 kDa 的透析膜，在室温下以磁力搅拌方式，用 0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）对脂质体进行 5 小时透析。
    注意：透析 5 小时足以完全去除 NH3，因为将 0.5 mL 透析后的脂质体加入 0.5 mL 的 0.10 M Tris-HCl、0.05 M CuSO4 缓冲液后，在 600 nm 处测得的光密度值与未含 NH3 制备的脂质体混合相同缓冲液后的光密度值一致。
  7. 透析完成后，按照步骤 2.5 所述方法，在 200 × g 条件下离心 90 分钟以沉淀脂质体。弃去上清液，用 5.0 mL 的 0.10 M Tris-HCl、0.05 M CuSO4 缓冲液（pH 7.4）重悬脂质体沉淀，并将重悬后的脂质体均分为五个 1.0 mL 的样品。分别向这五个 1.0 mL 样品中加入 80、60、40、20 和 0 µL 的 0.10 M Tris-HCl、0.05 M CuSO4 缓冲液（pH 7.4），再分别加入 0、20、40、60 和 80 µL 的 HDP-2P 储备液，使各脂质体样品中的 HDP-2P/磷脂摩尔比分别为 0.000、0.001、0.002、0.003 和 0.004。
  8. 将脂质体样品在 37 °C 恒温条件下孵育 30 分钟；然后使用分光光度计在 600 nm 处测定各样品的光密度值。对全部六个脂质体样品均按照第 3 节所述步骤进行操作，并重复三次，以确保每个数据点均有三个重复的光密度读数。
    注意：实验数据点的标准偏差应始终控制在平均值的 ±5% 范围内。

结果

HDP-2P 与磷脂酰肌醇及磷脂酰肌醇磷酸酯相互作用的分子模拟
分子模拟程序可计算受体（较大分子）分子表面上由配体（较小分子）靶向的最优九个结合位点。这些位点由释放出的九个最高焓值确定，代表具有最佳结合亲和力的位点。结合亲和力以负值表示，表明分子间结合是一个放热过程。在 HDP-2P 与 PI 相互作用的情况下，模拟预测在 HDP-2P 分子表面的活性中心内存在四个 PI 结合位点（#3、#6、#7 和 #8）（表 1）。此外，在 HDP-2P 活性中心外还发现了五个 PI 结合位点。PI 极性头部中带电和极性基团的标注见 图 1。

HDP-2P 的活性中心由五个关键氨基酸残基组成：Gly30、Gly32、His48、Asp49 和 Lys69，这些残基有助于磷脂底物在活性中心内的正确排列，从而确保催化水解反应的进行。一些典型的对接结构显示，磷脂酰肌醇（PI）与活性中心的某些氨基酸残基结合；而在结合位点 #6 中，PI 通过离子键、离子-极性相互作用以及氢键与活性中心全部五个关键氨基酸残基发生相互作用（表 1）。图 2 展示了在结合位点 #6 中，PI 与 HDP-2P 活性中心内全部五个关键氨基酸残基的相互作用方式。

HDP-2P 与含肌醇环4位磷酸基团的 PI-4-P 之间相互作用的对接模拟预测，PI-4-P 仅在结合位点#1处与 HDP-2P 的活性中心结合。具体而言，在该位点，PI-4-P 通过离子键、离子-极性键和氢键与活性中心的三个关键氨基酸残基——Gly30、Gly32 和 Lys69——发生相互作用（表2）。图3展示了 PI-4-P 与 HDP-2P 活性中心的相互作用。在 HDP-2P 分子表面其余的八个结合位点上，PI-4-P 结合于活性中心以外的位置。

HDP-2P与PI-4,5-P相互作用的分子对接模拟2 （在肌醇环的第4位和第5位含有磷酸基团）在所有九个预测的结合位点中均未显示出与酶活性中心的结合。相反，PI-4,5-P2 始终结合于活性中心附近的一个沟状空腔图4），与HDP-2P的三个残基Trp31、Gly33和Gln34形成离子-极性键和氢键。

尽管 PI-4,5-P2 与细胞或蛇毒 PLA2 活性中心附近类沟槽状空腔的结合此前尚未见报道，但类似结构特征在 Pleckstrin 同源31（PH）和 Epsin N 端同源32（ENTH）结构域中已有明确记载。这些信号结构域虽无酶活性，却利用类似的疏水-极性-阳离子沟槽结构特异性识别 PI-4,5-P231,32。HDP-2P 中存在类似的结构模体，提示其可能通过进化模拟或趋同进化机制实现对膜结构域的识别，这一现象引人关注。若经其他方法进一步验证，本研究可能代表首个报道的蛇毒 PLA2 利用此类机制识别磷脂酰肌醇的实例。

有趣的是，CL 和 PS 与 HDP-2P 相互作用的分子对接模拟预测，在九个结合位点中有八个位点中，这两种磷脂均结合于 HDP-2P 的活性中心；而唯一位于活性中心外部的 CL 和 PS 结合位点并未处于沟状空腔内（数据未显示）。同样值得注意的是，与 PI 相似，PC 在九个结合位点中有四个结合于 HDP-2P 的活性中心，且 PI 和 PC 与 CL 和 PS 一样，均不结合于沟状空腔（数据未显示）。这些结果表明，PI 肌醇环上的磷酸基团对位于活性中心邻近的沟状空腔具有较高的结合亲和力。结构分析已在细胞33和蛇毒34 PLA2酶的催化中心附近发现类似的沟状空腔，其表面具有疏水-极性-阳离子型的斑块结构。磷脂酰肌醇类物质与这些空腔的结合可能诱导产生具有生理意义的构象变化，进而可能抑制酶活性。值得注意的是，在磷脂酰肌醇类物质中，PI-4,5-P2 表现出特别差的底物特性——人 PLA2 同工型（胞质型、钙非依赖型和分泌型）对 PI-4,5-P2 几乎无或检测不到水解活性35。这提示，磷脂酰肌醇类物质与这些保守结构特征的结合可能在 PLA2 超家族中发挥不同于催化功能的特定生理作用（例如变构抑制），但尚需未来的实验验证。

使用与游离脂肪酸酰化的辅酶A监测HDP-2P在富含PI、PI-4-P、PI-4,5-P2、PS或CL的PC脂质体中的水解活性
通过辅酶A溶液评估HDP-2P对脂质体样品的水解活性。辅酶A溶液本身无色，但在HDP-2P催化的磷脂水解过程中释放的游离脂肪酸作用下发生酰化，变为紫色。由此产生的光密度增加反映了辅酶A酰化的程度，并在550 nm处通过分光光度法进行测定。因此，经辅酶A和HDP-2P处理的脂质体样品中光密度的增加与HDP-2P的水解活性成正比。

图5 展示了在不同脂质体样品中，HDP-2P/磷脂摩尔比对水解活性的影响曲线。HDP-2P的水解活性以在550 nm处测得的光密度（OD）的任意单位（a.u.）表示。我们未建立校准曲线将a.u.值与游离脂肪酸的摩尔浓度关联，因为实验结果显示，当有机溶剂中的脂肪酸加入含有辅酶A和酰基辅酶A合成酶的水溶液时，在550 nm处未产生可检测的OD变化。这表明此类脂肪酸形成胶束，而非与辅酶A结合。相比之下，只有由膜生成的脂肪酸（由PLA2活性产生）才能与膜结合的辅酶A结合，从而引起可测量的OD变化。辅酶A具有两亲性——其分子表面同时具有疏水和亲水区域——使其优先定位于膜-水界面，从而促进由PLA2活性产生的脂肪酸与辅酶A的结合。然而，在本实验条件下，无法确定脂肪酸的摩尔浓度。因此，使用辅酶A检测法的研究人员通常将PLA2的水解活性表示为在550 nm处测得的光密度的任意单位20。

在富含心磷脂（CL）或磷脂酰丝氨酸（PS）的磷脂酰胆碱（PC）脂质体中，HDP-2P 的水解活性最高，表现为光密度增加最为显著。该结果与 HDP-2P 活性中心对 CL 和 PS 具有最多结合位点的发现高度一致。在富含磷脂酰肌醇（PI）的 PC 脂质体中，HDP-2P 的水解活性分别比富含 CL 或 PS 的脂质体低 3.0 倍和 2.5 倍，但高于纯 PC 脂质体。这表明尽管 PI 与 PC 在活性中心具有相同数量的结合位点，PI 对 HDP-2P 活性中心的结合亲和力仍高于 PC。

这种明显的差异可能由磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰胆碱（PC）极性头部基团的结构差异所解释。尽管PC是一种中性分子，但其带正电荷的三甲基铵基团向外伸展进入溶液，而其带负电荷的磷酸基团则更靠近膜的疏水区域。PC头部基团中的这种电荷分布可能对带正电的HDP-2P产生静电排斥，从而降低其结合亲和力。相比之下，PI的酸性特性使其成为与带正电的HDP-2P相互作用更有利的脂质种类，这可以解释为何其水解活性高于纯PC脂质体。

如图5所示，HDP-2P在富含PI-4-P的PC脂质体中的水解活性表明其对磷脂的催化水解作用极弱。值得注意的是，从富含PI-4,5-P的PC脂质体获得的光密度曲线显示，HDP-2P在此类脂质体样品中完全丧失了水解活性。这些结果与分子对接模拟高度一致：模拟预测PI-4-P可在HDP-2P的活性中心处结合，而PI-4,5-P2则完全无法与活性中心结合。这表明肌醇环上连接的磷酸基团阻碍了磷脂与HDP-2P活性中心的结合。我们推测，肌醇环上的磷酸基团向外伸展至溶液中，通过离子及离子-极性分子间相互作用与HDP-2P结合，使HDP-2P远离膜表面，从而保护膜免受HDP-2P的水解作用。该机制与近期研究结果一致，后者发现人源胞质型、钙离子非依赖性及分泌型PLA2酶对PI-4-P和PI-4,5-P2底物几乎检测不到或完全无水解活性35。

富含PI、PI-4-P、PI-4,5-P2、PS或CL的PC脂质体膜中HDP-2P诱导的通透性变化：通过CuSO4溶液中包封NH3的配体置换反应进行评估

通过在复合离子体系中使用配体置换反应，研究了HDP-2P水解活性对富含PI、PI-4-P、PI-4,5-P2、PS或CL的PC脂质体膜通透性的影响，其中置换配体被封装在脂质体的内腔中。该方法简单可靠，其原理基于NH3取代复合离子[Cu(H2O)6]2+中作为配体的四个水分子

[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) 静态平衡；ΣFx=0；矢量图；力，平衡，物理，分析。 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)

在 NH3 取代络离子 [Cu(H2O)6]2+ 中水分子的过程中，[Cu(H2O)6]2+ 的浅蓝色会转变为 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ 的深蓝色。在一个 NH3 被包封于脂质体内部空间而 [Cu(H2O)6]2+ 存在于外部溶液的体系中，这种颜色变化——通过分光光度法监测——表明脂质体膜对 NH3 的通透性增加。

为了建立该系统，我们在含有 NH3 的 Tris-HCl 缓冲液中对磷脂分散液进行超声处理，形成内外均含有 NH3 的超声处理脂质体。通过透析去除外部的 NH3 后，向内部含有 NH3 的脂质体样品中加入 CuSO4 溶液。随后，用 HDP-2P 处理脂质体，并通过分光光度法监测光密度的变化。

为了确定测量光密度变化的最佳波长，我们记录了在500 nm至900 nm可见光范围内，0.025 M CuSO4、0.100 M NH3溶液中的[Cu(H2O)2(NH3)4]2+以及0.025 M CuSO4溶液中的[Cu(H2O)6]2+的吸收光谱。如图6所示，在600 nm处，[Cu(H2O)2(NH3)4]2+的吸光度达到最大值，而[Cu(H2O)6]2+的吸光度达到最小值，因此我们选择600 nm作为膜通透性实验的最佳波长。

图7 显示，富含阴离子型心磷脂（CL）和磷脂酰丝氨酸（PS）的磷脂酰胆碱（PC）脂质体对 NH3 的膜通透性最高。该观察结果与我们先前报道的数据一致：HDP-2P（一种IIA型磷脂酶A2）能够有效与阴离子磷脂棕榈酰油酰-甘油磷脂酰甘油发生相互作用，从而导致底物水解；而该效应在中性磷脂棕榈酰油酰-甘油磷脂酰胆碱中未被观察到36。通常情况下，大多数IIA型磷脂酶A2酶对阴离子磷脂表现出显著更高的水解活性33,37,38。PC+PI脂质体的通透性低于PC+CL和PC+PS脂质体，但仍高于纯PC脂质体。这些发现与分子对接模拟和HDP-2P水解活性实验的结果高度一致。换言之，由于HDP-2P无法有效水解磷脂，且分子对接数据预测HDP-2P与PI及磷脂酰肌醇类分子的结合亲和力较低，因此通透性较低的脂质体样品预期具有较高的结构稳定性（图2、图3 和 图4）。因此，HDP-2P的酶水解活性（图5）与 图7 所示的膜通透性之间应呈正相关关系。

然而，在含PC+PI-4-P和PC+PI-4,5-P2的脂质体中，经HDP-2P处理后通透性并未增加。尽管PC+PI-4,5-P2脂质体的通透性结果与分子对接模拟结果以及HDP-2P对相同脂质体的水解活性数据高度一致，但PC+PI-4-P脂质体中通透性未增加的现象与水解活性结果并不完全吻合，因为在这些脂质体中检测到了一定程度的水解活性。这些发现表明，PC+PI-4-P脂质体中轻微的局部水解活性增加并未显著干扰磷脂双分子层的排列，不足以引起膜对NH3通透性的改变。

分子结构、磷酸二酯键示意图、核苷酸相互作用、标记的化学基团。
图 1：磷脂酰肌醇极性头部带电基团与极性基团的标注。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示氨基酸残基Lys69、His48、Asp49的蛋白质结构相互作用示意图。
图 2：分子对接软件预测PI与HDP-2P活性中心在结合位点#6处的相互作用。 PI以棍状模型表示，HDP-2P以线条（左图）和分子表面（右图）模型表示。在棍状模型中，翠绿色代表碳，橙色代表磷，红色代表氧，白色代表氢。在线条和分子表面模型中，绿色代表碳，蓝色代表氮，红色代表氧，白色代表氢，黄色代表硫。黄色虚线表示分子间键。箭头指向活性中心中的氨基酸残基。缩写：PI = 磷脂酰肌醇；HDP-2P = 蝰蛇毒磷脂酶的碱性亚基。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质-配体相互作用示意图，显示分子结构分析中的 Lys69、Gly32 和 Gly30。
图 3：分子对接软件预测的 PI-4-P 与 HDP-2P 活性中心在结合位点 #1 的相互作用。 PI-4-P 以棍状模型表示，HDP-2P 以线条（左图）和分子表面（右图）模型表示。在棍状模型中，翠绿色代表碳，橙色代表磷，红色代表氧，白色代表氢。在线条和分子表面模型中，绿色代表碳，蓝色代表氮，红色代表氧，白色代表氢，黄色代表硫。黄色虚线表示分子间键。箭头指向活性中心中的氨基酸残基。缩写：PI-4-P = 磷脂酰肌醇-4-磷酸；HDP-2P = 蝰蛇毒磷脂酶的碱性亚基。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质结构可视化；显示氨基酸和表面模型的分子图示。
图 4：分子对接软件预测的PI-4,5-P2与HDP-2P分子表面在结合位点#6处的相互作用。 PI-4,5-P2结合于HDP-2P活性中心下方的一个沟状凹陷区域。活性中心的五个关键氨基酸残基以三字母符号表示。PI-4,5-P2以棍状模型表示，HDP-2P则以线条模型（左图）和分子表面模型（右图）表示。在棍状模型中，翠绿色代表碳，橙色代表磷，红色代表氧，白色代表氢。在线条和分子表面模型中，绿色代表碳，蓝色代表氮，红色代表氧，白色代表氢，黄色代表硫。缩写：PI-4,5-P2 = 磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸；HDP-2P = 蝰蛇毒磷脂酶的基本亚基。 请点击此处查看该图的放大版本。

水解活性图；磷脂比例与活性关系；实验数据分析。
图 5：不同 HDP-2P/磷脂摩尔比下脂质体样品的水解活性曲线。 脂质体由以下成分构成：PC+CL（深绿色）、PC+PS（橙色）、PC+PI（深蓝色）、PC+PI-4-P（蓝色）、PC+PI-4,5-P2（绿色）和 PC（紫色）。以任意单位表示的光密度值为在 550 nm 处三次重复读数的平均值。误差线表示三次重复读数的标准差（SD）。使用单因素方差分析（ANOVA）评估各脂质体样品间光密度值差异的统计学显著性，所有 p 值均远低于 0.05。缩写：PC = 磷脂酰胆碱；CL = 牛心 心磷脂；PS = 磷脂酰丝氨酸；PI = 磷脂酰肌醇；PI-4-P = 磷脂酰肌醇-4-磷酸；PI-4,5-P2 = 磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸；a.u. = 任意单位；HDP-2P = 蝰蛇毒磷脂酶的基本亚基。请点击此处查看该图的放大版本。

Absorbance vs. wavelength graph showing Cu complex spectral analysis with peak transitions, nm scale.
图6铜配合物水溶液的吸收光谱 铜配合物 [Cu(H2O6]2+ （橙色线条）和 [Cu(H2O2(NH3)4]2+ （蓝线），在500 nm至900 nm波长范围的可见光照射下。铜配合物[Cu(H2O6]2+ 在0.025 M CuSO₄溶液中制备4 和铜配合物 [Cu(H2O2(NH3)4]2+ 在含有 0.100 M NH₃ 的 0.025 M CuSO₄ 溶液中进行3该图中每个数据点的吸光度值均为三次重复测量读数的平均值。误差线表示三次重复读数的标准差。 请点击此处以查看该图的放大版本。

膜通透性曲线图，HDP-2P/脂质比例，不同脂质类型，实验结果。
图 7：脂质体样品的膜通透性曲线。由PC+CL（紫色）、PC+PS（蓝色）、PC+PI（深蓝色）、PC+PI-4-P（深绿色）、PC+PI-4,5-P2（橙色）和PC（绿色）组成的脂质体，在不同HDP-2P/磷脂摩尔比条件下的膜通透性。膜通透性值以600 nm处测得的光密度值表示，单位为任意单位（a.u.）。每个数据点代表三次重复测量的平均值。误差线表示三次重复测量的标准差（SD）。采用单因素方差分析（ANOVA）评估各脂质体样品间光密度值差异的统计学显著性，所有p值均远低于0.05。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：HDP-2P与PI候选分子复合物的预测结合亲和力。采用分子建模模拟预测了键的类型和结合位点亲和力，以及参与分子间相互作用的磷脂酰肌醇头部基团和HDP2P氨基酸残基中的带电基团和极性基团。磷脂酰肌醇中的带电和极性基团在图1中高亮显示。注意，NHpbδ+中的Pb表示肽键。缩写：PI = 磷脂酰肌醇；HDP-2P = 蝰蛇毒磷脂酶的碱性亚基。请点击此处下载该表格。

表2：HDP-2P与PI-4-P候选分子复合物的预测结合亲和力能量。采用分子建模模拟预测了磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI-4-P）头部基团与HDP2P氨基酸残基之间分子间相互作用所涉及的键类型、结合位点亲和力，以及带电和极性基团的特性。注意，NHpbδ+中的Pb表示肽键。请点击此处下载该表格。

补充文件1：分子对接工作流程。 使用AutoDock进行分子对接的流程概述，包括配体构建、受体准备、格点盒子设置以及对接模拟的执行，以预测PI-HDP-2P的相互作用。请点击此处下载该文件。

讨论

在本研究中，我们探究了磷脂酰肌醇（PI）中与肌醇环共价结合的磷酸基团是否能够阻止磷脂酶A2（PLA2）对磷脂膜的降解作用。为了评估PLA2水解活性引起的磷脂膜降解进程，我们设计了一种简单但高度敏感且准确的方法，用于测量膜通透性的变化，随着结构降解的进行，膜通透性应会增加。

该方法基于配体取代反应，涉及六水合铜(II)配合物[Cu(H2O)6]2+，其悬浮于磷脂脂质体外的水相环境中，而氨（NH3）则被包封在脂质体内部。氨对Cu2+的亲和力高于水分子，但NH3必须透过脂质体膜进入外部水相，才能取代[Cu(H2O)6]2+中的H2O分子。若脂质体膜的结构完整性因PLA2催化的磷脂水解反应而受损，膜对NH3的通透性将增加，从而促进配体取代反应，导致溶液颜色由[Cu(H2O)6]2+的浅蓝色转变为[Cu(H2O)2(NH3)4]2+的深蓝色。我们通过分光光度法定量监测了该转变过程，记录了600 nm处光密度的变化。

我们先前曾使用1H-NMR结合顺磁性离子铁氰化物[Fe(CN)6]3-，研究HDP-2P24和眼镜蛇毒心脏毒素24,25,26,27,28,39对膜通透性的影响。我们也曾使用一系列荧光和磷光探针，研究眼镜蛇毒心脏毒素对脂质体膜通透性的作用20,23,40。然而，铁氰化物以及荧光/磷光探针均为体积较大的非生理分子实体，仅在膜完整性受到显著破坏时才能穿透脂质膜。相比之下，我们新建立的配体置换检测方法利用NH3 ——一种体积小、天然存在的细胞代谢物，可在脂质排列发生微小扰动时即穿透脂质膜。该新型膜通透性检测方法的灵敏度更高，其可在HDP-2P/脂质摩尔比低至0.001时检测到膜通透性的变化，而¹H-NMR/铁氰化物法检测所需的最低摩尔比为0.00423。

在同一项研究中，我们利用二茂铁对赤藓红磷光的猝灭效应，通过检测测试样品中赤藓红寿命（τn）与对照样品中寿命（τ0）的比值变化，评估HDP-2P对膜间脂质交换的影响23。当HDP-2P/脂质摩尔比为0.004时，τn/τ0值下降至0.423，表明膜处于对二价阳离子具有通透性的流动性状态24。因此，我们基于NH3的配体置换实验可在HDP-2P/脂质摩尔比为0.001时检测到膜通透性，而传统实验方法（1H-NMR/铁氰化物法和磷光探针猝灭法）仅在摩尔比为0.004时才能检测到膜通透性。这表明，我们基于NH3的实验方法比传统方法灵敏度高四倍。

基于NH3的检测方法具有极高的灵敏度，所得通透性数据与水解活性测量结果高度一致，仅有一个明显例外：PC+PI-4-P脂质体在未发生通透性变化的情况下表现出可忽略的水解作用，表明局部产生的微量溶血磷脂/脂肪酸并不影响整体脂质排列，因而不会破坏膜的结构完整性和通透性。因此，本研究证明，在复合离子体系中发生的配体取代反应——其中配体被包裹在脂质体内部腔室中——所得结果与HDP-2P的水解活性数据高度吻合。这些发现也与关于PI及磷脂酰肌醇类分子与HDP-2P分子表面结合的计算机模拟（in-silico）研究结果高度一致。

总体而言，本研究中的 AutoDock 模拟结果显示，在已鉴定的九个结合位点中，PI 在其中四个位点与活性中心结合，而 PI-4-P 仅在一个预测位点与活性中心结合。HDP-2P 在 PC+PI-4-P 脂质体中的水解活性比在 PC+PI 脂质体中低约 5 倍。此外， 计算机模拟 研究预测PI-4,5-P无结合能力2 到HDP-2P的活性中心。一致地，PLA2 活性测定和配体取代反应实验表明，PI-4,5-P2 完全抑制了磷脂水解和膜通透性的增加，而PI-4-P的水解活性较低，且无显著性，完全阻止了膜通透性的改变。这些观察结果与 体外 人细胞质型、钙非依赖型及分泌型磷脂酶A2活性研究2 酶对PI、PI-4-P和PI-4,5-P的特异性235这些研究表明，只有IVA型胞质PLA2 对PI和PI-4-P表现出相对较高的催化活性，而对PI-4,5-P的活性较低2 几乎无法检测到。所有其他测试的PLA2 酶对PI-4,5-P无活性235这种活性的缺乏归因于肌醇环上高度亲水的磷酸基团，这些基团干扰了膜表面与PLA之间的有效相互作用2 酶35我们推测，肌醇环上的磷酸基团向外延伸至溶液中，并能够与HDP-2P沟槽状空腔中的残基形成离子-极性相互作用和氢键，这很可能阻碍HDP-2P足够接近膜表面，从而抑制其水解活性，稳定细胞膜，减少HDP-2P对磷脂膜的降解作用。而HDP-2P介导的膜降解可能通过激活细胞死亡通路对细胞造成损害。该机制似乎与磷脂酰肌醇在涉及异常酶活性的疾病状态下可能发挥的保护作用相一致。

膜通透性检测、水解活性测定与in silico分子对接研究所得结果之间存在强相关性，这凸显了配体取代反应方法的可靠性。该方法利用包裹在脂质体内的配体，被证明是一种准确且有效的工具，可用于评估由磷脂稳定双层结构发生结构扰动所引起的膜通透性变化。尽管我们承认本文中采用AutoDock进行的分子对接研究尚不能全面揭示磷脂如何以动态和纵向方式与HDP-2P相互作用，未来仍需开展分子动力学研究，以进一步阐明HDP-2如何使由不同磷脂组成的磷脂双层发生通透化的其他分子机制。需要注意的是，开展分子动力学研究需要高性能计算机和计算集群等高算力资源，而许多资源有限、科研经费不足的学术机构尚不具备此类条件。最后，我们承认本技术论文中采用了刚性受体（HDP-2P），且缺乏溶剂/膜环境。然而，我们希望强调的是，使用刚性受体对HDP-2P与多种磷脂进行分子对接是开展初步对接研究的常规方法，可用于初步筛选出可能的结合构象；待未来确定催化位点中与底物结合的关键氨基酸残基后，可进一步聚焦于这些可被设为柔性的分子区域，在溶剂化环境中开展基于柔性受体的后续分子对接研究。因此，与拥有更丰富资源的其他机构开展合作，有助于验证AutoDock提供的部分初步发现，并进一步揭示底物-酶相互作用的其他分子机制。

总之，本研究的结果表明，配体取代反应方法利用封装在脂质体内的配体，可有效应用于多种膜介导过程中膜通透性的研究。这些过程包括配体-受体相互作用、脂质-蛋白质相互作用、膜间交换、膜融合与裂变以及神经肌肉收缩等。此外，该方法在研究膜靶向药物方面也具有重要潜力。与此同时，我们认识到，尽管模型膜中的新方法对于解析膜相互作用的特定机制极为宝贵，但其固有的简化特性限制了其完全复制生物膜在结构、组成和功能上的复杂性。 体内因此，必须谨慎解读来自模型系统的数据，并尽可能利用细胞或整体生物模型对研究结果进行验证。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本文所述研究得到了北京朝阳凯文学校启动基金（E.S.G.）以及美国国家卫生研究院SEPA奖（项目编号：5R25MD019151-03，R.K.D.）的资助。与HDP-2制备相关的工作得到了俄罗斯科学基金会项目（项目编号：24-15-00280，Y.N.U.）的支持。 作者感谢Maryam Barancheshmeh博士在撰写分子对接模拟应用的脚本及制作相关视频过程中所做的贡献，该视频是在本研究论文发表后制作完成的。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
来自 V. nikolskii 蝰蛇毒液 PLA2 的基本亚基 HDP-2P，HDP-2，纯度 98.5% 莫斯科生物有机化学研究所根据 PMID:18083205 中的方案分离得到 HDP-2。HDP-2P 通过 DEAE Sephadex A-50 从 HDP-2 中纯化获得  
心磷脂（心脏来源，牛）（钠盐），>99%麦克林C916138
辅酶 A，FUJIFILM Wako’s NEFA 试剂盒 美国马萨诸塞州列克星敦
截留分子量为 1.0 kDa 的透析袋纤维素膜Sigma Aldrich 贸易有限公司，中国上海 
数字控制水浴恒温器 中国北京永光明医疗仪器有限公司 
电子高精度分析天平 FA2004 中国上海迈伊有限公司
精华 752 紫外-可见分光光度计 中国上海精华仪器有限公司，上海
L-α-磷脂酰胆碱（卵来源，鸡），≥95%麦克林L799415
L-α-磷脂酰肌醇（肝脏来源，牛）（钠盐），≥99%麦克林L780292
L-α-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（脑组织来源，猪）（铵盐），≥99%麦克林L996223
L-α-磷脂酰肌醇-4-磷酸（脑组织来源，猪）（铵盐），99%麦克林L970250
L-α-磷脂酰丝氨酸（脑组织来源，猪）（钠盐），>99%麦克林L864755
磁力搅拌器 JB-3 上海雷磁 JB-3
pH 计 PHS-3C 中国上海仪电科学仪器股份有限公司
TGL-16B 微量离心机 中国上海三安亭公司，上海
超声波分散仪 Yt-JY96-IIN 中国上海叶拓科技有限公司
真空泵 TW-1M中国温岭挺威有限公司

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