PGE2-EP4-Ca2+ 信号轴在创伤后骨关节炎中的潜在作用

摘要

本文介绍了一种系统建立和评估骨关节炎大鼠模型的实验方案，通过对比提供科学依据，阐明由急性机械性损伤诱导的骨关节炎与由慢性代谢/环境因素诱导的骨关节炎在发病机制上的差异。重点聚焦于前交叉韧带切断（ACLT）模型，强调EP4-Ca²⁺-线粒体功能障碍信号通路的变化。

摘要

创伤后骨关节炎（PTOA）是一种由创伤或强烈机械应力引发的退行性关节疾病，可导致关节软骨退化及功能障碍。前列腺素 E2（PGE₂）在机械性损伤后通过激活软骨细胞膜上的前列腺素 E 受体 4（EP4），显著促进软骨降解。关节软骨的稳态主要依赖于软骨降解与修复之间的动态平衡，这一过程由软骨细胞精细调控。研究表明，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II（Ca²⁺/CaMKII）信号通路在介导软骨细胞功能恢复中发挥关键作用。在本研究中，我们观察到白细胞介素-1β（IL-1β）刺激的软骨细胞中 EP4、1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R）以及磷酸化 CaMKII 的表达升高，提示 EP4 信号可能与钙离子稳态失调存在关联。然而，目前仍缺乏直接证据证实 EP4-Ca²⁺/CaMKII 轴在 PTOA 中的参与作用。尚需通过遗传学或药理学干预手段进一步研究以阐明这一潜在机制。这些发现为探索钙稳态与 EP4 信号通路作为 PTOA 治疗靶点提供了初步依据。

引言

尽管体育活动因其健康益处而被广泛提倡，但它仍是下肢肌肉骨骼损伤的主要原因，可能导致多种不良后果¹。其中，创伤后骨关节炎（PTOA）已成为青少年和年轻成年人中因年轻时发生关节损伤而日益加重的健康负担²。令人担忧的是，约48%-52%的运动相关关节损伤者在受伤后11-17年内会发展为PTOA^3,4。膝关节是青少年体育运动和休闲活动中最常受伤的关节之一，在从关节损伤进展为PTOA的过程中尤为脆弱。一项前瞻性研究报道，与未受伤者相比，膝关节损伤者在受伤后12-20年内发生影像学确诊的膝骨关节炎的风险高出10倍⁵。此外，在年轻成年人中，影像学评估显示，前交叉韧带断裂（ACLT）的女性足球运动员在12年内发展为PTOA的风险为51%，而男性运动员在14年内的风险为41%⁵。这些发现凸显了运动相关关节损伤对肌肉骨骼健康的长期负面影响。因此，深入了解PTOA发展过程中不可逆的病理机制，对于确定旨在减缓疾病进展的适当干预策略至关重要。

早期钙离子（Ca²⁺）稳态失调是PTOA发生的关键指标之一⁶。Ca²⁺与钙调蛋白（calmodulin, CaM）结合形成Ca²⁺/CaM复合物，该复合物可作用于CaMKII，解除其自抑制构象，从而调控激酶活性⁷。在人和小鼠的骨关节炎（OA）中，磷酸化CaMKII（CaMKII的活化形式）的表达均升高；而使用CaMKII抑制剂可阻断这种磷酸化水平的上升，并导致关节软骨破坏⁸，表明Ca²⁺/CaMKII通路在调控OA软骨稳态中具有重要作用。通常，这些变化在PTOA发展过程中受到炎症机制激活的显著影响。作为关键的促炎性疼痛介质，高水平的PGE₂通过激活EP4受体影响OA的进展。具体而言，在关节软骨中条件性敲除EP4可促进软骨形成和合成代谢，同时抑制软骨细胞肥大和分解代谢，从而促进稳定、成熟关节软骨而非纤维软骨的再生，并缓解关节疼痛⁹。鉴于Ca²⁺/CaMKII信号通路在软骨细胞生理中的关键作用，以及EP4受体在骨关节炎进展中已被确认的参与，本研究旨在探讨EP4的激活是否与PTOA发展过程中钙信号改变及线粒体功能障碍相关。尽管EP4与Ca²⁺稳态失调之间的因果关系仍有待明确，但本文数据提示二者之间可能存在机制上的关联，值得进一步研究。

本研究聚焦于EP4受体激活在PTOA发展过程中与Ca²⁺信号传导及线粒体功能障碍之间关联的潜在机制。与传统的诊断方法（如用于检测PTOA进展的影像学技术）以及当前的治疗手段（如用于缓解症状的非甾体抗炎药，NSAIDs）相比，我们的研究旨在揭示PTOA发病机制中早期的细胞内信号紊乱。这种机制性认识有助于更精确地理解疾病的发生与发展，为早期诊断和靶向干预提供新的途径。因此，本研究建立了通过前交叉韧带切断术（ACLT）诱导的PTOA大鼠模型，以模拟运动员在急性或慢性体力活动中因运动控制受损而常见的机械性损伤。该模型能够很好地代表创伤后机械性关节损伤，为研究组织病理学变化及潜在的分子机制提供了一个可重复的实验平台。高脂饮食联合潮湿环境暴露（FD）组作为阳性对照，旨在模拟与慢性骨关节炎相关的代谢和环境风险因素。前者模拟由机械性创伤引起的急性损伤，后者则代表由代谢紊乱和环境因素诱导的自然发病疾病模型，尽管该组最终的发病机制可能并不遵循EP4-Ca²⁺-线粒体轴。

方案

所有涉及动物的实验程序均经广东省中医院动物伦理委员会审查和批准（伦理批准编号：2024014-2）。本研究遵循中华人民共和国国务院规定的实验动物伦理使用规范进行。

1. 动物

1. 使用非近交系 Sprague-Dawley (SD) SPF 级大鼠，以减少与动情周期相关的潜在混杂因素。本实验共选用 9 只雄性 SD 大鼠，年龄为 4 周，体重介于 90 g 至 100 g 之间。
   注：这些大鼠来源于中国一家持有许可证的实验动物供应商（许可证编号：20240410Aazz0619000774）。
2. 将所有动物饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中。维持受控环境，温度为 24 ± 2 °C，平均湿度为 60 ± 1%，并保持 12 小时光照/12 小时黑暗的循环周期。
3. 确保大鼠可自由获取酸化水和标准啮齿类动物饲料。

2. 动物模型构建与干预

1. 将大鼠在饲养中心进行为期2周的适应性饲养。在6周龄时将大鼠随机分为三组：对照组、PTOA组和FD组，每组3只大鼠。
2. 对照组大鼠在标准条件下饲养。
3. 使用异氟烷（诱导浓度4%，维持浓度1%–2%）对PTOA组大鼠进行麻醉。
4. 采用髌骨内侧入路，通过纵向皮肤切口暴露双侧膝关节。
5. 使用手术刀进行前交叉韧带切断术（ACLT），并通过前抽屉试验阳性结果确认韧带完全切断。
   注：进行双侧前交叉韧带切断以确保模型一致性并减少个体差异。分析时将每只动物双侧膝关节的数据取平均值，得到一个代表该动物的数值。
6. 将FD组大鼠定期转移至同一设施内的温控环境舱中，并给予高脂饮食。
   注：高脂饮食成分包括20%蔗糖、15%猪油、1.2%胆固醇、0.2%牛磺胆酸钠、10%酪蛋白、0.6%磷酸氢钙、0.4%石灰石粉、0.4%预混料和52.2%基础饲料。对照饲料的营养成分为：19%蛋白质、31%脂肪和50%碳水化合物，热量比例为17%蛋白质、37%脂肪和46%碳水化合物。
7. 将环境舱内的条件维持在温度24 ± 2 °C、湿度90 ± 4%、每日12小时光照循环。
   注：由于高温高湿环境会增加细菌生长风险，需对饮用水和食物进行灭菌处理，并每日更换以减少污染。实验干预总持续时间为12周。

3. 步态分析（足迹）

1. 在造模大鼠开始治疗后12周，采用先前所述方法¹⁰进行足印分析。
2. 将大鼠后肢足底涂抹红色印泥，使其沿一条长100 cm、宽8 cm并铺有白纸的路径行走。
3. 为促使大鼠向前移动，可在路径末端放置一个暗室以诱导其前行。
4. 连续测量三次，取各参数（包括步长和跨步长）的平均值，用于评估步态不规则性。
5. 通过测量同一后肢足在连续两次踏步间所移动的距离，确定跨步长（cm）。
6. 将步长（cm）定义为左右后肢足之间的水平距离。
7. 测量足印角度（°），即第二趾与跟骨连线相对于水平线的夹角¹¹。
8. 使用Image-Pro Plus软件（6.0版本）及其内置的距离和角度测量工具，在扫描获得的足印图像上直接测量跨步长、步长和足印角度。
   注意：这些步态参数对于识别骨关节炎早期阶段的细微功能障碍至关重要。患者可能通过缩短跨步长和步长来保护疼痛关节，而足外展角增大及步态不对称则常作为对疼痛所致关节不稳定的代偿性反应。

4. 关节直径测量

1. 使用校准的螺旋测微器（mm）测量各组建模后关节的直径。
   注意：随着骨关节炎的发展，患者通常会出现关节肿胀和疼痛。肿胀程度越高，可能提示疾病处于更严重的阶段。

5. 握力测量

1. 使用配备牵引网（90 mm × 90 mm）的数字式握力计测量后肢握力。
   1. 轻轻抓住大鼠的尾巴和颈部背侧皮肤。
   2. 将动物缓慢下放，使其后肢牢固抓住网格，然后沿力传感器轴线方向水平匀速拉动动物，直至其松开抓握。
   3. 每只动物重复测试三次，记录其中最高值作为最大握力。
      注意：在进行后肢握力测试时，应用胶带将前肢固定于纸板表面，以防止前肢意外接触牵引网。握力下降提示肌肉功能减退，可能与骨关节炎进展相关的疼痛性运动功能障碍有关。

6. 原代软骨细胞的分离与培养

1. 从6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠中分离原代软骨细胞。
2. 解剖股骨头和胫骨平台，收集约100–150 mg软骨组织。
3. 用含1%青霉素-链霉素的PBS洗涤组织两次。
4. 将软骨组织在5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液中于3 °C消化30分钟。
5. 将软骨切成1–2 mm³大小的组织块，再在10 mL 0.2% II型胶原酶溶液中于37 °C恒温摇床上消化4小时。
6. 用70 µm细胞筛过滤细胞悬液，300 × g离心5分钟，弃去上清液。
7. 将细胞沉淀重悬于添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中。
8. 将细胞置于含5% CO₂的湿润环境中，于3 °C孵育。

7. 细胞处理

1. 使用血细胞计数板对分离的软骨细胞进行计数。
2. 将软骨细胞以 2 × 10 的密度接种至 6 孔板中⁵ 每孔0.1 mL完全培养基（DMEM/F12添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素）中接种细胞。
3. 在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育细胞24 h，以促进贴壁。
4. 建立一个 体外 炎症性PTOA模型中，当软骨细胞融合度达到约80%时，用IL-1β（10 ng/mL）处理贴壁软骨细胞48小时。
5. 对于FD阳性对照，将棕榈酸（PA，CAS号 57-11-4）用氯仿按1:1000比例稀释，配制500 µM的储备液。
   1. 当细胞融合度达到约80%时，向每1 mL培养基中加入1 µL PA储备液，使PA终浓度为500 nM。用该溶液处理软骨细胞48小时。
6. 向不含棕榈酸（PA）的对照细胞中，每1 mL培养基加入1 µL氯仿（溶剂对照）。

8. 样本采集、脱钙及包埋制备

1. 干预后12周，通过在密闭容器中吸入过量异氟烷（≥5%）至少5分钟处死动物，并确认呼吸和心跳完全停止。
   注意：该方法已获得动物伦理委员会批准，符合国家关于实验动物人道处死的指导原则。
2. 每组取三只大鼠的双侧膝关节（n = 3，共6个膝关节）用于组织学评估。
3. 将样本置于4%多聚甲醛（PFA）中固定，组织与固定液体积比大于1:20，在摇床上4°C条件下固定超过48小时。
4. 用流动自来水冲洗组织1–2小时，以去除残留固定剂。
5. 在0.5 M EDTA溶液（pH 7.4，约15%）中脱钙，组织与溶液体积比为1:20，在4°C条件下持续21天，每3天更换新鲜溶液。
6. 通过针头探触骨组织是否软化，评估脱钙是否完成。
7. 将脱钙后的组织用流动自来水冲洗2小时，并放入包埋盒中。
8. 依次通过梯度乙醇进行脱水：75%乙醇2小时（或过夜），80%乙醇2小时，95%乙醇0.5小时，无水乙醇两次各60分钟；然后浸入1:1二甲苯:乙醇混合液中20分钟。
9. 用二甲苯透明两次（分别为10分钟和60分钟）。
10. 按以下顺序进行石蜡浸润：二甲苯:石蜡（1:1）15分钟，软石蜡（52–56°C）1小时（两次），硬石蜡（56–60°C）30分钟。
11. 使用石蜡包埋系统（例如Leica，设定温度为60°C）进行包埋，并将蜡块转移至-2°C冷板上冷却2小时。
12. 使用切片机对石蜡块进行矢状面切片，厚度为4 µm。
13. 将切片带漂浮于4°C水浴中，然后展平并贴附于洁净载玻片上。
14. 将贴好的切片自然晾干，并在60°C烘箱中烘烤2小时，以去除残留石蜡。
15. 依次将切片浸入二甲苯（10分钟）、新鲜二甲苯（10分钟）、无水乙醇（5分钟）、新鲜无水乙醇（5分钟）、90%乙醇（5分钟）和75%乙醇（5分钟）中进行脱蜡，然后在染色前用自来水冲洗。

9. 苏木精-伊红（HE）染色

1. 将脱蜡并复水的组织切片浸入0.5%苏木精染色液中，在室温（RT；~2 °C）下染色3-5分钟，随后用流动的自来水彻底冲洗。
2. 用苏木精分化液处理切片2-5秒，然后在流动的自来水中冲洗。
3. 将切片浸入苏木精蓝化液中2-5秒进行蓝化，随后进行冲洗。
4. 依次在85%和95%乙醇中各脱水5分钟，然后用0.05%伊红Y（醇溶）染色5分钟。
5. 在无水乙醇中脱水两次，每次5分钟，接着在二甲苯中透明5分钟，再换新鲜二甲苯中处理5分钟。
6. 用中性树胶封片，并加盖盖玻片。
   注：在保存良好的软骨中，苏木精将细胞核染成蓝色，伊红将基质染成粉红色。受损软骨则表现为软骨细胞丢失、纤维化及基质结构紊乱。

10. 沙黄O-快绿（SOFG）染色

1. 在室温下用2%快绿溶液染色切片1-5分钟。用流动自来水冲洗，直至软骨变为无色。
2. 用1%盐酸对切片进行短暂分化，时间为10-15秒，然后用流水彻底冲洗。
3. 用0.2%沙黄O溶液染色切片5-10秒，随后通过四次更换无水乙醇快速脱水（每次3-5秒）。
4. 在二甲苯中透明化切片（5分钟），再转入新鲜二甲苯中（5分钟）。
5. 用中性树胶封片，并加盖盖玻片。
   注：沙黄O将软骨蛋白聚糖染成红色，而快绿将骨/纤维组织染成绿色。红色减弱或消失提示蛋白聚糖减少及组织退变。
6. 采用国际骨关节炎研究学会（Osteoarthritis Research Society International, OARSI）评分系统评估组织学变化。测量关节间隙宽度和软骨厚度以评价结构退变情况。在光学显微镜（如ECLIPSE Ti2-E）下以4×（比例尺 = 50 µm）和20×（比例尺 = 10 µm）采集图像。
   注：使用系统配套成像软件进行图像采集，用ImageJ（v1.48v）进行分析。通过分析 > 设定比例尺功能，依据显微测微尺对图像进行校准。对每个关节，从三个矢状面切片中随机选取五个视野，由三位独立观察者采用盲法分析进行定量评估。

11. 微型 µCT

1. 干预后12周处死大鼠并取出膝关节，立即在室温下用4%多聚甲醛固定24小时，以保存组织形态。
2. 用PBS冲洗固定后的样本，并将其保存在70%乙醇中直至进行扫描。
3. 扫描前将每个膝关节样本安装在专用样品架上，沿其长轴对齐，以最大限度减少运动伪影。
4. 使用显微µCT系统进行显微µCT扫描，扫描参数如下：X射线电压70 kV，电流100 µA，功率7 W。
5. 每投影采集4帧图像并进行叠加以提高图像质量，旋转步长为0.72°，完成360°完整旋转。
6. 将最终体素尺寸（切片厚度）设为15 µm，以获得适用于骨小梁分析的高分辨率图像。
7. 在胫骨近端生长板与胫骨平台之间定义感兴趣区域（ROI），重点关注股骨和胫骨的软骨下骨。
8. 使用重建软件将原始扫描数据重建为横断面图像。
9. 将重建后的图像序列导入适当的软件中，进行定量形态计量分析。
10. 评估关键参数，包括骨体积分数（BV/TV，%）、骨矿物密度（BMD，g/cm³）和骨小梁分离度（Tb.Sp，mm）。
11. 为实现定性分析和三维可视化，使用三维可视化软件生成骨微结构的容积渲染图像。
12. 进行视觉评估，以确认定量数据中观察到的结构完整性和形态学变化。
    注意：所有图像处理与分析均由经过设盲的操作人员完成，以确保结果无偏倚。

12. 酶联免疫吸附测定（ELISA）

1. 干预后12周对大鼠进行麻醉。小心暴露并分离腹主动脉以采集血样。
2. 将采集的血液在室温下静置凝固30分钟，然后在°C条件下以755 ×g（相当于3000 rpm，使用转子半径为7.5 cm的离心机）离心15分钟。
3. 分离血清并储存，用于后续使用商用ELISA试剂盒检测PGE₂水平。
4. 同时，接种原代软骨细胞并培养24小时，随后根据既定的细胞处理方案，用IL-1β和PA处理48小时。干预后，收集培养上清液，并使用相同的ELISA试剂盒分析PGE₂浓度。

13. 定量RT-PCR

1. 使用商业RNA提取试剂（TRIzol）从细胞样品中提取总RNA。
2. 使用反转录试剂盒（含基因组DNA去除剂）合成cDNA，并将所得cDNA储存于-8 °C，用于后续分析。
3. 使用SYBR Green进行定量PCR，并采用2−ΔΔCt法计算相对表达水平。
   注意：所用引物序列如下：β-actin 正向：ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC；β-actin 反向：CTGACCCATACCCACCATCAC；EP4 正向：GGCACATTGTTGGTAAGCCC；EP4 反向：GGCTGTAGAAGTAGGCGTGG；COX-2 正向：GATGACGAGCGACTGTTCCA；COX-2 反向：TGGTAACCGCTCAGGTGTTG。

14. 蛋白质印迹分析

1. 在冰上用 RIPA 缓冲液裂解细胞 30 分钟。
2. 将蛋白质样品进行 SDS-PAGE 电泳分离 90 分钟，然后转至硝酸纤维素膜上 2 小时。
3. 用 5% BSA 封闭膜，并用磷酸盐缓冲液洗涤。
4. 使用特异性抗体进行免疫印迹。
   注意：所用抗体及其稀释比例分别为：抗 MMP9 抗体（1:1000）、抗胶原蛋白 II 抗体（1:1000）、抗 COX2 抗体（1:1000）、抗 CaMKII 抗体（1:1000）、抗 p-CaMKII 抗体（1:1000）、抗 IP3R 抗体（1:1000）、抗 Cyt-C 抗体（1:1000）和抗 β-actin 抗体（1:2000）。
5. 与一抗在 4°C 孵育过夜后，用 TBST 洗涤膜，再在避光条件下与二抗（鼠源 HRP 标记抗体或兔源 HRP 标记抗体，1:2000）孵育 1 小时。
6. 再次用 TBST 洗涤后，使用增强型化学发光试剂盒进行蛋白检测。
7. 使用 ImageJ 软件（版本 1.48v）分析数据。

15. 免疫荧光染色

1. 将软骨细胞在12孔板中的盖玻片上培养至80%融合度。
2. 用IL-1β和PA处理48小时，或不进行处理作为对照，随后在室温下用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞15分钟。
3. 用含0.2% Triton X-100的PBS对细胞进行15分钟的通透处理。
4. 用PBS洗涤细胞三次（每次5分钟），然后在抗体稀释缓冲液中加入一抗（抗-IP3R，1:200稀释），4°C下孵育过夜。
5. 加入1:500稀释的异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育1小时。
6. 用5 µg/mL的DAPI溶液对细胞复染10分钟。
   注意：荧光图像使用40倍物镜采集（比例尺 = 2 µm）。所有图像均使用ZEN软件处理，并采用ImageJ软件（版本1.48v）进行定量分析，遵循一致的校准流程。

16. 统计分析

1. 使用 GraphPad Prism（版本 8.0.2）进行统计分析。
2. 在应用参数检验之前，使用 Shapiro-Wilk 检验评估数据的正态分布，并使用 Brown-Forsythe 和 Bartlett 检验评估方差齐性。
3. 对于多组间的比较，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后接 Tukey 事后检验；对于两组间的比较，采用双尾非配对 Student t 检验。
4. 将 P 值小于 0.05 视为具有统计学显著性。
5. 所有数据均以至少三次独立实验的均值 ± 标准差（SD）表示。

结果

与FD诱导的慢性膝骨关节炎相比，ACLT诱导的PTOA表现出更早发生的软骨破坏和行为功能障碍（图2 和图3）
关节间隙变窄和软骨退变是骨关节炎（OA）的主要表现。既往研究已确定超重和环境因素（如潮湿气候）可能是OA发病的潜在诱因^12,13，这些因素可能与衰老直接相关，并在晚年促进OA的发展。在本研究中，为探讨运动相关创伤是否可加速OA进展，我们建立了ACLT诱导的创伤组作为创伤后骨关节炎（PTOA）模型，并采用FD模型作为慢性OA的阳性对照。通过传统的行为学评估、苏木精-伊红（HE）染色、番红O-快绿（SOFG）染色以及显微µCT技术，对大鼠关节表面形态、组织病理学变化及软骨下骨微结构进行检测，以评估OA的进展程度（图1）。在行为学评估...

讨论

与由环境和饮食因素诱导的慢性骨关节炎（OA）相比，前交叉韧带切断术（ACLT）诱导的关节创伤导致疾病进展更为迅速。基于关节肿胀、后肢抓握力和步态分析等行为学评估的结果显示，对照组、创伤后骨关节炎（PTOA）组以及由环境和饮食因素诱导的阳性对照组之间存在显著差异。经过12周的干预后，PTOA组出现明显的关节肿胀，并伴有后肢抓握力显著下降和步态不稳，表明此时是采集样本的合适时间点。进一步通过H&E染色、苏木精-藏红O-快绿（SOFG）染色及显微微计算机断层扫描（micro-µCT）分析，对两种干预模型中的OA进展进行了评估。组织学检查表明，PTOA组表现出更明显的关节间隙狭窄和软骨变薄。相比之下，FD组在此阶段的骨关节炎病理变化较轻，不及早期行为学改变明显。此外，通过micro-µCT分析进一步加强了与组织学结果的相关性，结果显示几乎所有检测参数均与H&E染色和SOFG染色结果一致。具体而言，PTOA组在软骨下骨微结构和骨赘形成方面表现出显著改变，而FD组则未观察到明显变化。这些发现提示，与慢性OA相比，PTOA与更早发生的软骨退变相关，导致OA更快发作。这对运动员尤其值得关注，因为其后果不仅限于急性运动损伤...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2% 胶原酶 II	Sigma-Aldrich，美国	CAS 号：9001-12-1	原代软骨细胞的分离与培养
0.2% Triton X-100	碧云天，中国	ST795	免疫荧光
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	武汉博仕生物技术有限公司	AR1071	脱钙
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco，美国	25200072	原代软骨细胞的分离与培养
4% 多聚甲醛固定液	中国碧云天	P0099-3L	组织固定
抗CaMKII抗体	中国华生物	ET1608-47	Western 印迹（1:1000）
抗II型胶原抗体	Abcam，英国	ab34712	Western blot（1:1000）
抗COX2抗体	Abcam，英国	ab179800	Western印迹（1:1000）
抗细胞色素C抗体	中国Selleck	F2534	Western印迹（1:1000）
抗IP3R抗体（B-2）	美国圣克鲁斯	sc-377518	Western blot（1:1000）
抗MMP9抗体	Abcam，英国	ab76003	Western blot（1:1000）
抗磷酸化CaMKII抗体	中国赛莱克	F0342	Western印迹（1:1000）
抗-β-肌动蛋白抗体	美国细胞信号转导技术公司（Cell Signaling Technology, CST）	8H10D10	Western blot（1:2000）
BSA 封闭液	Sigma Aldrich，美国	N/A	用于 Western blot 封闭的 5% BSA
离心机（5424 R）	德国艾本多夫	N/A	755 × g离心速度
氯仿	Sigma Aldrich，美国	N/A	PA溶剂
气候控制箱（RXZ-158A）	中国本土制造商	N/A	湿润环境模型
Color Reverse Transcription Kit	英潍捷基，中国苏州	N/A	cDNA合成
CTAn 软件	Bruker	版本 1.9 和 4.1	用于定量形态计量分析
CTVol 软件	布鲁克	版本 2.0	用于定性及三维可视化
DAPI 染色液	碧云天，中国	N/A	核染色（5 µg/mL
数字握力计	普森仪器	N/A	测量后肢抓握力
DMEM/F12 培养基	美国康宁公司	N/A	细胞培养基
EDTA（乙二胺四乙酸）	Aladdin	N/A	骨组织脱钙
PGE2 ELISA试剂盒	Elabscience，中国武汉	PGE2E-EL-0034	ELISA 检测
增强型化学发光试剂盒	美国默克密理博公司	WBKLS0500	Western印迹检测
乙醇	广东广试试剂科技有限公司	CAS：64-17-5	组织脱水
胎牛血清（FBS）	康宁，美国	N/A	培养用10%浓度
FITC标记的山羊抗兔IgG	碧云天，中国	P0179 试剂盒	免疫荧光（1:500）
GraphPad Prism	GraphPad Software，美国	版本 8.0.2	数据分析
苏木精和伊红（H&E) 染色试剂盒	Servicebio，武汉	G1005	组织学
IL-1β	PeproTech，美国	400-01B	骨关节炎细胞模型中为 10 ng/mL
ImageJ	美国国立卫生研究院，美国	版本 1.48v	图像分析
Image-Pro Plus 软件	美迪科创	版本 6.0	基于扫描足印的定量步态分析
异氟烷	上海雅吉生物	YS1412C	动物手术麻醉
Leica 包埋中心	徕卡显微系统	EG1160	石蜡包埋
Leica切片机	徕卡显微系统	RM2235	石蜡包埋组织切片
Leica 水浴锅	Leica Microsystems	HI1210	漂浮石蜡切片
光学显微镜（ECLIPSE Ti2-E）	日本尼康	N/A	组织学观察
微型CT扫描仪（ZKKS-MCT-Sharp）	中国本土制造商	N/A	骨成像
小鼠-HRP 二抗	美国细胞信号转导技术公司（Cell Signaling Technology, CST）	7076	1:2000 稀释度
NIS-Elements 成像软件	尼康	N/A	显微镜图像的采集与分析
NRecon 软件	布鲁克，德国	版本 1.6	CT 重建
棕榈酸（PA）	Sigma Aldrich，美国	P0500	500 µFD细胞模型的M储备液
切片用石蜡，病理级，熔点52-54 °C	广东广试试剂科技有限公司	Y258797-500g	用于组织处理过程中的石蜡包埋
切片用石蜡，病理级，熔点56-58 °C	广东广试试剂科技有限公司	Y258799-500g	用于组织切片的最终硬蜡包埋
PBS（磷酸盐缓冲盐水）	Gibco / Thermo Fisher	C10010500BT	细胞洗涤与组织冲洗
青霉素-链霉素	美国康宁公司	N/A	细胞培养用1%
PVDF 膜（0.45 µm)	美国默克密理博公司	IPVH00010	Western blot 膜
兔源HRP二抗	美国Cell Signaling Technology（CST）	7074	1:2000 稀释度
红墨水	HERO	HERO 204	步态分析中的足迹追踪
RIPA裂解缓冲液	中国Keygen	N/A	蛋白质提取
番红O–快绿染色试剂盒	Servicebio，武汉	G1053	组织学染色
螺旋测微器（游标卡尺）	中国黄山	N/A	关节宽度测量
软骨下骨分析软件（CTAn）	布鲁克，德国	版本 1.9 和 4.1	形态计量分析
SYBR Green PCR Master Mix	AG Scientific，中国	N/A	qPCR分析
Western blot 试剂（RIPA 裂解液、SDS-PAGE 凝胶组分、上样缓冲液、TBST 等）	碧云天生物技术（中国）	N/A（用作组条目）	Western 印迹实验所用的常规试剂
二甲苯	广东广试试剂科技有限公司	CAS：1330-20-7	组织透明化