本文介绍了一种系统建立和评估骨关节炎大鼠模型的实验方案，通过对比提供科学依据，阐明由急性机械性损伤诱导的骨关节炎与由慢性代谢/环境因素诱导的骨关节炎在发病机制上的差异。重点聚焦于前交叉韧带切断（ACLT）模型，强调EP4-Ca2+-线粒体功能障碍信号通路的变化。
本文内容
摘要
摘要
创伤后骨关节炎（PTOA）是一种由创伤或强烈机械应力引发的退行性关节疾病，可导致关节软骨退化及功能障碍。前列腺素 E2（PGE2）在机械性损伤后通过激活软骨细胞膜上的前列腺素 E 受体 4（EP4），显著促进软骨降解。关节软骨的稳态主要依赖于软骨降解与修复之间的动态平衡，这一过程由软骨细胞精细调控。研究表明，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II（Ca2+/CaMKII）信号通路在介导软骨细胞功能恢复中发挥关键作用。在本研究中，我们观察到白细胞介素-1β（IL-1β）刺激的软骨细胞中 EP4、1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R）以及磷酸化 CaMKII 的表达升高，提示 EP4 信号可能与钙离子稳态失调存在关联。然而，目前仍缺乏直接证据证实 EP4-Ca2+/CaMKII 轴在 PTOA 中的参与作用。尚需通过遗传学或药理学干预手段进一步研究以阐明这一潜在机制。这些发现为探索钙稳态与 EP4 信号通路作为 PTOA 治疗靶点提供了初步依据。
引言
尽管体育活动因其健康益处而被广泛提倡，但它仍是下肢肌肉骨骼损伤的主要原因，可能导致多种不良后果1。其中，创伤后骨关节炎（PTOA）已成为青少年和年轻成年人中因年轻时发生关节损伤而日益加重的健康负担2。令人担忧的是，约48%-52%的运动相关关节损伤者在受伤后11-17年内会发展为PTOA3,4。膝关节是青少年体育运动和休闲活动中最常受伤的关节之一，在从关节损伤进展为PTOA的过程中尤为脆弱。一项前瞻性研究报道，与未受伤者相比，膝关节损伤者在受伤后12-20年内发生影像学确诊的膝骨关节炎的风险高出10倍5。此外，在年轻成年人中，影像学评估显示，前交叉韧带断裂（ACLT）的女性足球运动员在12年内发展为PTOA的风险为51%，而男性运动员在14年内的风险为41%5。这些发现凸显了运动相关关节损伤对肌肉骨骼健康的长期负面影响。因此，深入了解PTOA发展过程中不可逆的病理机制，对于确定旨在减缓疾病进展的适当干预策略至关重要。
早期钙离子（Ca2+）稳态失调是PTOA发生的关键指标之一6。Ca2+
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方案
所有涉及动物的实验程序均经广东省中医院动物伦理委员会审查和批准（伦理批准编号：2024014-2）。本研究遵循中华人民共和国国务院规定的实验动物伦理使用规范进行。
1. 动物
- 使用非近交系 Sprague-Dawley (SD) SPF 级大鼠，以减少与动情周期相关的潜在混杂因素。本实验共选用 9 只雄性 SD 大鼠，年龄为 4 周，体重介于 90 g 至 100 g 之间。
注：这些大鼠来源于中国一家持有许可证的实验动物供应商（许可证编号：20240410Aazz0619000774）。 - 将所有动物饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中。维持受控环境，温度为 24 ± 2 °C，平均湿度为 60 ± 1%，并保持 12 小时光照/12 小时黑暗的循环周期。
- 确保大鼠可自由获取酸化水和标准啮齿类动物饲料。
2. 动物模型构建与干预
- 将大鼠在饲养中心进行为期2周的适应性饲养。在6周龄时将大鼠随机分为三组：对照组、PTOA组和FD组，每组3只大鼠。
- 对照组大鼠在标准条件下饲养。
- 使用异氟烷（诱导浓度4%，维持浓度1%–2%）对PTOA组大鼠进行麻醉。
- 采用髌骨内侧入路，通过纵向皮肤切口暴....
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结果
与FD诱导的慢性膝骨关节炎相比，ACLT诱导的PTOA表现出更早发生的软骨破坏和行为功能障碍（图2 和图3）
关节间隙变窄和软骨退变是骨关节炎（OA）的主要表现。既往研究已确定超重和环境因素（如潮湿气候）可能是OA发病的潜在诱因12,13，这些因素可能与衰老直接相关，并在晚年促进OA的发展。在本研究中，为探讨运动相关创伤是否可加速OA进展，我们建立了ACLT诱导的创伤组作为创伤后骨关节炎（PTOA）模型，并采用FD模型作为慢性OA的阳性对照。通过传统的行为学评估、苏木精-伊红（HE）染色、番红O-快绿（SOFG）染色以及显微µCT技术，对大鼠关节表面形态、组织病理学变化及软骨下骨微结构进行检测，以评估OA的进展程度（图1）。在行为学评估.......
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讨论
与由环境和饮食因素诱导的慢性骨关节炎（OA）相比，前交叉韧带切断术（ACLT）诱导的关节创伤导致疾病进展更为迅速。基于关节肿胀、后肢抓握力和步态分析等行为学评估的结果显示，对照组、创伤后骨关节炎（PTOA）组以及由环境和饮食因素诱导的阳性对照组之间存在显著差异。经过12周的干预后，PTOA组出现明显的关节肿胀，并伴有后肢抓握力显著下降和步态不稳，表明此时是采集样本的合适时间点。进一步通过H&E染色、苏木精-藏红O-快绿（SOFG）染色及显微微计算机断层扫描（micro-µCT）分析，对两种干预模型中的OA进展进行了评估。组织学检查表明，PTOA组表现出更明显的关节间隙狭窄和软骨变薄。相比之下，FD组在此阶段的骨关节炎病理变化较轻，不及早期行为学改变明显。此外，通过micro-µCT分析进一步加强了与组织学结果的相关性，结果显示几乎所有检测参数均与H&E染色和SOFG染色结果一致。具体而言，PTOA组在软骨下骨微结构和骨赘形成方面表现出显著改变，而FD组则未观察到明显变化。这些发现提示，与慢性OA相比，PTOA与更早发生的软骨退变相关，导致OA更快发作。这对运动员尤其值得关注，因为其后果不仅限于急性运动损伤.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究受到国家自然科学基金（编号：82205147；编号：62472046）；广东省体育局科研项目（GDSS2024N038）；以及广州中医药大学校院联合基金项目（GZYFT2024G08）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2% 胶原酶 II | Sigma-Aldrich，美国 | CAS 号：9001-12-1 | 原代软骨细胞的分离与培养 |
| 0.2% Triton X-100 | 碧云天，中国 | ST795 | 免疫荧光 |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | 武汉博仕生物技术有限公司 | AR1071 | 脱钙 |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco，美国 | 25200072 | 原代软骨细胞的分离与培养 |
| 4% 多聚甲醛固定液 | 中国碧云天 | P0099-3L | 组织固定 |
| 抗CaMKII抗体 | 中国华生物 | ET1608-47 | Western 印迹（1:1000） |
| 抗II型胶原抗体 | Abcam，英国 | ab34712 | Western blot（1:1000） |
| 抗COX2抗体 | Abcam，英国 | ab179800 | Western印迹（1:1000） |
| 抗细胞色素C抗体 | 中国Selleck | F2534 | Western印迹（1:1000） |
| 抗IP3R抗体（B-2） | 美国圣克鲁斯 | sc-377518 | Western blot（1:1000） |
| 抗MMP9抗体 | Abcam，英国 | ab76003 | Western blot（1:1000） |
| 抗磷酸化CaMKII抗体 | 中国赛莱克 | F0342 | Western印迹（1:1000） |
| 抗-β-肌动蛋白抗体 | 美国细胞信号转导技术公司（Cell Signaling Technology, CST） | 8H10D10 | Western blot（1:2000） |
| BSA 封闭液 | Sigma Aldrich，美国 | N/A | 用于 Western blot 封闭的 5% BSA |
| 离心机（5424 R） | 德国艾本多夫 | N/A | 755 × g离心速度 |
| 氯仿 | Sigma Aldrich，美国 | N/A | PA溶剂 |
| 气候控制箱（RXZ-158A） | 中国本土制造商 | N/A | 湿润环境模型 |
| Color Reverse Transcription Kit | 英潍捷基，中国苏州 | N/A | cDNA合成 |
| CTAn 软件 | Bruker | 版本 1.9 和 4.1 | 用于定量形态计量分析 |
| CTVol 软件 | 布鲁克 | 版本 2.0 | 用于定性及三维可视化 |
| DAPI 染色液 | 碧云天，中国 | N/A | 核染色（5 µg/mL |
| 数字握力计 | 普森仪器 | N/A | 测量后肢抓握力 |
| DMEM/F12 培养基 | 美国康宁公司 | N/A | 细胞培养基 |
| EDTA（乙二胺四乙酸） | Aladdin | N/A | 骨组织脱钙 |
| PGE2 ELISA试剂盒 | Elabscience，中国武汉 | PGE2E-EL-0034 | ELISA 检测 |
| 增强型化学发光试剂盒 | 美国默克密理博公司 | WBKLS0500 | Western印迹检测 |
| 乙醇 | 广东广试试剂科技有限公司 | CAS：64-17-5 | 组织脱水 |
| 胎牛血清（FBS） | 康宁，美国 | N/A | 培养用10%浓度 |
| FITC标记的山羊抗兔IgG | 碧云天，中国 | P0179 试剂盒 | 免疫荧光（1:500） |
| GraphPad Prism | GraphPad Software，美国 | 版本 8.0.2 | 数据分析 |
| 苏木精和伊红（H&E) 染色试剂盒 | Servicebio，武汉 | G1005 | 组织学 |
| IL-1β | PeproTech，美国 | 400-01B | 骨关节炎细胞模型中为 10 ng/mL |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院，美国 | 版本 1.48v | 图像分析 |
| Image-Pro Plus 软件 | 美迪科创 | 版本 6.0 | 基于扫描足印的定量步态分析 |
| 异氟烷 | 上海雅吉生物 | YS1412C | 动物手术麻醉 |
| Leica 包埋中心 | 徕卡显微系统 | EG1160 | 石蜡包埋 |
| Leica切片机 | 徕卡显微系统 | RM2235 | 石蜡包埋组织切片 |
| Leica 水浴锅 | Leica Microsystems | HI1210 | 漂浮石蜡切片 |
| 光学显微镜（ECLIPSE Ti2-E） | 日本尼康 | N/A | 组织学观察 |
| 微型CT扫描仪（ZKKS-MCT-Sharp） | 中国本土制造商 | N/A | 骨成像 |
| 小鼠-HRP 二抗 | 美国细胞信号转导技术公司（Cell Signaling Technology, CST） | 7076 | 1:2000 稀释度 |
| NIS-Elements 成像软件 | 尼康 | N/A | 显微镜图像的采集与分析 |
| NRecon 软件 | 布鲁克，德国 | 版本 1.6 | CT 重建 |
| 棕榈酸（PA） | Sigma Aldrich，美国 | P0500 | 500 µFD细胞模型的M储备液 |
| 切片用石蜡，病理级，熔点52-54 °C | 广东广试试剂科技有限公司 | Y258797-500g | 用于组织处理过程中的石蜡包埋 |
| 切片用石蜡，病理级，熔点56-58 °C | 广东广试试剂科技有限公司 | Y258799-500g | 用于组织切片的最终硬蜡包埋 |
| PBS（磷酸盐缓冲盐水） | Gibco / Thermo Fisher | C10010500BT | 细胞洗涤与组织冲洗 |
| 青霉素-链霉素 | 美国康宁公司 | N/A | 细胞培养用1% |
| PVDF 膜（0.45 µm) | 美国默克密理博公司 | IPVH00010 | Western blot 膜 |
| 兔源HRP二抗 | 美国Cell Signaling Technology（CST） | 7074 | 1:2000 稀释度 |
| 红墨水 | HERO | HERO 204 | 步态分析中的足迹追踪 |
| RIPA裂解缓冲液 | 中国Keygen | N/A | 蛋白质提取 |
| 番红O–快绿染色试剂盒 | Servicebio，武汉 | G1053 | 组织学染色 |
| 螺旋测微器（游标卡尺） | 中国黄山 | N/A | 关节宽度测量 |
| 软骨下骨分析软件（CTAn） | 布鲁克，德国 | 版本 1.9 和 4.1 | 形态计量分析 |
| SYBR Green PCR Master Mix | AG Scientific，中国 | N/A | qPCR分析 |
| Western blot 试剂（RIPA 裂解液、SDS-PAGE 凝胶组分、上样缓冲液、TBST 等） | 碧云天生物技术（中国） | N/A（用作组条目） | Western 印迹实验所用的常规试剂 |
| 二甲苯 | 广东广试试剂科技有限公司 | CAS：1330-20-7 | 组织透明化 |
参考文献
- Whittaker, J. L., Roos, E. M. A pragmatic approach to prevent post-traumatic osteoarthritis after sport or exercise-related joint injury. Best PractRes Clin Rheumatol. 33 (1), 158-171 (2019).
- Maia, C. R., et al.
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