本方案详细描述了RNA 原位 在自动化平台上对组织进行连续蛋白质免疫荧光与杂交，以表征靶向细胞水平的空间多组学。
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本方案详细描述了RNA 原位 在自动化平台上对组织进行连续蛋白质免疫荧光与杂交，以表征靶向细胞水平的空间多组学。
细胞在宿主体内的功能并不依赖于孤立的信号。相反，从最小的RNA分子到最大的蛋白质，所有组分都必须在人体内协调一致地协同运作。因此，整合多层次组学的细胞水平空间研究方法，对于理解细胞间相互作用及疾病进展过程具有至关重要的意义。在同一空间检测体系中解析蛋白质组与转录组，有助于我们不仅了解细胞被指令执行什么功能（RNA），还能揭示其在所处微环境生态位中如何实际执行这些指令（蛋白质）。本论文重点在于将连续免疫荧光技术（SeqIF）与RNA分析进行整合 原位 原位杂交（ISH）结合组织原位微流控系统，用于在空间背景下高通量检测蛋白质和RNA（seqRNA-ISH+seqIF），单次运行可检测多达12种RNA和24种蛋白质靶标，并可进一步增加额外的蛋白质靶标 通过 连续运行。该方法提供了一种无需考虑荧光染料兼容性且无需为更高重数进行大量优化的连续靶向多组学平台。这使得研究者能够了解细胞正在启动或向其微环境传递的信息。这种靶向方法有助于在更精确地研究RNA与蛋白质之间相互作用的同时，验证全转录组分析方法。
人体内细胞的复杂功能依赖于各种信号分子之间错综复杂的相互作用，从小分子RNA到大分子蛋白质，所有这些成分协同工作以维持正常生理活动1。这种相互作用凸显了整合性研究方法的重要性，即在多个组学层面（omics layers）上分析细胞水平的空间相互关系2,3。此类方法对于理解细胞间相互作用的复杂性以及疾病的发展进程至关重要。许多传统技术，如流式细胞术4和单细胞测序5，通常使用分离的细胞来分析解离后的样本，以确定特定样本中各种表型的整体比例。然而，将细胞从原始组织中分离出来进行分析可能会诱导细胞活化或表型改变，从而无法准确反映其在原位（in situ）的真实生物学状态和功能6。空间生物学领域的先进方法为研究细胞及其微环境提供了新策略，能够在不破坏组织结构和多种分子类型下与邻近细胞之间空间关系的前提下，开展深入分析2,7。
在同一空间检测中整合转录组和蛋白质组分析，无需分离单个细胞，可全面揭示细胞功能8
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本方案采用未经治疗的高级别浆液性卵巢癌患者在接受初次肿瘤细胞减灭术时采集的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片。所有临床数据均来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心妇科肿瘤与生殖医学系的卵巢癌样本库，数据获取遵循经机构审查委员会批准的研究方案。患者书面知情同意由前台工作人员获取，研究严格遵循公认的伦理准则进行。
注意：所有试剂除非另有说明，均用无核酸酶的去离子水稀释。
1. 固定并包埋样品
注意：固定剂的选择和固定时间对检测结果有显著影响，通常空间检测多采用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织，因其可较好地保存病理学结构。本方案以FFPE组织为基础进行描述，因此建议以下步骤用于FFPE组织样本。然而，固定过程会影响RNA的质量，对蛋白表位的影响相对较小。这些固定方法、固定不完全以及样本降解均可能导致基于抗体的蛋白质组学检测中非特异性结合增加。第三，内源性荧光通常在FFPE处理过程中被淬灭，但某些荧光染料仍会部分残留，需通过测试确认其是否已被有效淬灭。
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作为该方法的一个示例，我们对两张人高级别浆液性卵巢癌组织切片进行了以下seqRNA-ISH（表1）和SeqIF（表2 和 表3）实验。
图2 展示了卵巢肿瘤组织样本上 seqRNA-ISH 与 seqIF 的叠加图像。利用胶原蛋白1等结构蛋白标志物可识别肿瘤区域，而CD33、CD8和颗粒酶B（GZMB）等表型和功能标志物则有助于区分特定的免疫细胞，这对于理解肿瘤-免疫微环境至关重要。RNA探针靶向ApoE和PDL1等分子，以提供额外的信息，并促进RNA转录与蛋白质翻译之间的比较；而对于GZMB，由于我们在同一组织中同时呈现了蛋白质和RNA信号，因此可能识别出翻译调控机制，这可能对癌症进展产生重要影响33。
图3 展示了同一卵巢组织切片的另一种视图，其中蛋白质标记.......
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制备和处理样本时最关键的步骤是降低RNase污染。可通过佩戴口罩以防止呼吸带来的污染，并使用RNase去污染溶液以及用无核酸酶水配制的70%乙醇擦拭工作台面来实现。对于FFPE切片，建议从FFPE组织块上连续切下多张相邻切片用于seqRNA-ISH+seqIF实验，并将其与干燥剂一同在4 °C下保存。在质量控制方面，除了检测组织块的DV200外，还建议在相邻组织切片上运行RNA阳性对照（UBC、PPIB、POLR2A）和阴性对照（DapB）。将样本和切片在4 °C下保存有助于防止RNA降解（RNA降解随温度升高而加剧），而干燥剂则有助于减少水溶性蛋白质的降解。在4 °C条件下使用的干燥剂需定期更换。对于脂肪含量较高或难以贴附于载玻片的组织，应将烘烤时间从通常的最少1小时延长至过夜（12至18小时）。延长烘烤时间可增强组织与载玻片的粘附性；然而，温度升高可能会加剧RNA的降解。
组织自发荧光通常在300-500 nm范围内被激发，并在350-555 nm范围内发射（例如DAPI-TRITC范围内的发射滤光片）35,.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
本研究部分由卵巢癌研究联盟（OCRA 811621 和 891490）、Sie 基金会以及 Stephanie C. Stelter 捐赠基金资助。本研究与流式细胞术和细胞成像核心设施合作完成，该设施部分由美国国立卫生研究院通过 M. D. Anderson 癌症中心支持基金 P30 CA016672 以及 Jared Burks 的美国国家癌症研究所研究专家项目 1 R50 CA243707-01A1 提供支持。
我们还要感谢Lunaphore公司的Emily Martersteck在技术协助和培训方面提供的支持。
作者通过Bio-Techne公司的早期使用计划，以优惠价格获得了一套RNAScope靶向探针和对照探针，部分试剂由该公司免费提供用于本研究。制造商未参与研究设计、数据收集与分析，或稿件的撰写。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | 赛默飞世尔科技 / 英维特罗根 | EN62248 / 62248 | 用于细胞核染色（本研究中使用的产品 62247 已停产） |
| 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管 | 赛默飞世尔科技 | 339652 | 用于分装 &和混合二次溶液 |
| 70% 无菌异丙醇酒精 | Texwipe | TX3270 | 用于表面去污染 |
| 抗体 | 各种 | 各种 | 用于主要目标，根据所用通道不同而有所变化 |
| APOE - 宿主：小鼠，克隆号：960318 | R&研发 | MAB41443-100 | （注：本研究特有）一抗 |
| aSMA - 宿主：小鼠，克隆号：1A4 | CST | 69319SF | （注：本研究特有）一抗 |
| 自动切片机 | Leica | 14051956472 | 组织切片 |
| CD10 - 宿主：兔，克隆号：E5P7S | CST | 65534S | （注：本研究特有）一抗 |
| CD11c - 宿主：兔，克隆：D3V1E | CST | 93233SF | （注：本研究特有）一抗 |
| CD163 - 宿主：兔，克隆号：D6U1J | CST | 93498S | （注：本研究特异性）一抗 |
| CD163 - 宿主：兔，克隆株：ja51-30 | Invitrogen | ma5-32684 | （注：本研究特异性）一抗 |
| CD20 - 宿主：小鼠，克隆号：L26 | 贝赛尔 | A500-017ACF | （注：本研究特有）一抗 |
| CD31 - 宿主：小鼠，克隆：3F8E2 | ProteinTech | 66065-2-Ig | （注：本研究特有）一抗 |
| CD33 - 宿主：兔，克隆号：BLR061G | 贝赛尔 | A700-061CF | （注：本研究特有）一抗 |
| CD4 - 宿主：兔，克隆号：EPR6855 | Abcam | ab181724 | （注：本研究特有）一抗 |
| CD45 - 宿主：兔，克隆号：BL-178-12C7 | 贝赛尔 | A700-012 | （注：本研究特有）一抗 |
| CD45RO - 宿主：小鼠，克隆：UCHL1 | 贝赛尔 | A500-020ACF | （注：本研究特有）一抗抗体 |
| CD56 - 宿主：兔，克隆号：BLR152J | 贝赛尔 | 99746 | （注：本研究特异性）一抗 |
| CD66b - 宿主：兔，克隆号：BLR111H | Invitrogen | MA5-44413 | （注：本研究特异性）一抗 |
| CD68 - 宿主：小鼠，克隆：KP-1 | Biolegend | 916104 | （注：本研究特有）一抗 |
| CD8 - 宿主：小鼠，克隆号：C8/144B | Biolegend | 372902 | （注：本研究特有）一抗抗体 |
| CD86 - 宿主：兔，克隆号：E2G8P | CST | 76755SF | （注：本研究特有）一抗抗体 |
| Col 1A1 - 宿主：小鼠，克隆号：E3E1X | CST | 66948S | （注：本研究特有）一抗 |
| DNA LoBind 管 2 mL | Eppendorf | 22431048 | 用于混合RNA探针溶液 |
| Drierite 21005 指示型干燥剂 | 科尔-帕尔默 | 21005 | 干燥器用干燥剂 |
| Edge-Rite切片机刀片 | 赛默飞世尔科技 / 英维特罗根 | 4280L | 组织学——用于样本切片时 |
| 乙醇 100%（200 Proof） | Pharmco | 111000200 | 用于脱蜡 |
| EZ-AR2 优雅缓冲液 | BioGeneX | HK547-XAK | 用于福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复 |
| FOXP3 - 宿主：兔，克隆性：多克隆 | 贝赛尔 | A700-034CF | （注：本研究特异性）一抗 |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 555 | 赛默飞世尔科技 / 英维特罗根 | A-21425 | （注：本研究特有）F(ab')2-山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 555 |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 647 | 赛默飞世尔科技 / 英维特罗根 | A-48289/A-21237 | （注：本研究特有）F(ab')2-山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ Plus 647 |
| 山羊抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 555 | 赛默飞世尔科技 / 英维特罗根 | A-21430 | （注：本研究特有）F(ab')2-山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 555 |
| 山羊抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 647 | 赛默飞世尔科技 / 英维特罗根 | A-21246 | （注：本研究特有）F(ab')2-山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 647 |
| GZMB - 宿主：兔，克隆：多克隆 | ProteinTech | 13588-1-AP | （注：本研究特有）一抗抗体 |
| Hs-POLR2A-T1 | ACD Biotechne | 310457-T1 | 人类低表达探针 |
| Hs-PPIB-T5 | ACD Biotechne | 313907-T5 | 人类中段表达探针对照 |
| Hs-UBC-T9 | ACD Biotechne | 310047-T9 | 人类高表达对照 |
| 30% 过氧化氢溶液 | Sigma-Aldrich | HX0640-5 | 用于组织制备，有助于阻断内源性过氧化物酶活性，并产生高显色产物。配制3%过氧化氢溶液 |
| Ker8/18 - 宿主：小鼠，克隆类型：多克隆 | ProteinTech | 66187-1-PBS | （注：本研究特有）一抗 |
| LRP5 - 宿主：兔，克隆号：HPA030505 | Sigma | HPA030505-100UL | （注：本研究特异性）一抗 |
| Lunaphore 20x 多重染色缓冲液 | Bio-Techne | BU06 | 用作 COMET 实验的稀释液和洗涤液 |
| Lunaphore COMET 芯片 | Bio-Techne | MK03 | 用于COMET仪器的微流控芯片 |
| Lunaphore COMET | Bio-Techne | CM10-S | Seq-IF 自动染色仪 |
| Lunaphore 洗脱缓冲液试剂盒 | Bio-Techne | BU07-L | 溶液1 &用于 COMET 洗脱步骤的溶液 2 |
| Lunaphore 成像缓冲液试剂盒 | Bio-Techne | BU09 | 溶质 & COMET 实验成像过程中使用的溶剂 |
| Lunaphore 灭活缓冲液 | Bio-Techne | BU08-L | 溶液1 &以及用于COMET淬灭步骤的溶液2 |
| 微量移液器 | 各种 | N/A | 用于试剂制备 |
| Periostin - 宿主：小鼠，克隆号：1A11A3 | ProteinTech | 66491-1-PBS | （注：本研究特有）一抗 |
| Pierce 16% 甲醛（w/v），无甲醇 | 赛默飞世尔科技 | 28908 | 用于组织制备的3.7% PFA的配制 |
| T2 通道中的探针 320102 | ACD Biotechne | 300040 | T2 中的阴性对照 DapB |
| T3 通道中的探针 320102 | ACD Biotechne | 300040 | T3 中的阴性对照 DapB |
| 探针 320102（T4 通道） | ACD Biotechne | 300040 | T4 中的阴性对照 DapB |
| RNAscope HiPlex 裂解储存液 | Bio-Techne | P/N 324399 | RNAScope 检测中用于切割的试剂 |
| RNAscope HiPlex Pro COMET 12-重 20片装试剂盒 | Bio-Techne | 322075 | 试剂 & RNAScope 用缓冲液 |
| RNAscope HiPlex 探针 - 人 APOE-T2 | ACD Biotechne | 433093-T2 | （注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-APOE-T2 |
| RNAscope HiPlex 探针- Hs-ARG1-T4 | ACD Biotechne | 401581-T4 | （注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-ARG1-T4 |
| RNAscope HiPlex 探针- Hs-CD274-T1 | ACD Biotechne | 600863-T1 | （注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-CD274-T1 |
| RNAscope HiPlex 探针-Hs-CD40-T6 | ACD Biotechne | 445973-T6 | （注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-CD40-T6 |
| RNAscope HiPlex 探针- Hs-CXCL1-01-T12 | ACD Biotechne | 1256473-T12 | （注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-CXCL1-01-T12 |
| RNAscope HiPlex 探针-Hs-GZMB-T7 | ACD Biotechne | 468453-T7 | （注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-GZMB-T7 |
| RNAscope HiPlex 探针 - 人-IFNG-T3 | ACD Biotechne | 310503-T3 | （注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-IFNG-T3 |
| RNAscope HiPlex 探针- Hs-IL23a-T8 | ACD Biotechne | 562853-T8 | （注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-IL23a-T8 |
| RNAscope HiPlex 探针- Hs-IL6-T9 | ACD Biotechne | 400883-T9 | （注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-IL6-T9 |
| RNAscope HiPlex 探针- Hs-TNFa-T11 | ACD Biotechne | 310423-T11 | （注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-TNFa-T11 |
| RNAscope HiPlex 探针- Hs-VEGFA-T5 | ACD Biotechne | 423163-T5 | （注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-VEGFa-T5 |
| RNAscope HiPlex 探针- Hs-VISTA-T10 | ACD Biotechne | 491513-T10 | （注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-VISTA-T10 |
| RNAscope HiPlex12 CS 阴性对照探针 | ACD Biotechne | 324347 | 制造商推荐的完整12重阴性对照面板。T1-T12中为DapB。 |
| RNAscope HiPlex12 CS 人源阳性对照探针-Hs | ACD Biotechne | 324317 | 制造商推荐的完整12重人源阳性对照面板。Hs -RTU，对应通道T1至T12中的以下看家基因：Polr2a、PPIB、UBC、HPRT1、TUBB、RPL28、RPL5、B2M、ACTB、LDHA-O1、RPLP0-X-RPLP0P2、GAPDH。 |
| 无RNase水 | 康宁 | 46-000-CM | 清洁和准备所有设备，并在需要时用作稀释剂 |
| RNaseZap RNase 去污染溶液 | 赛默飞世尔科技 | AM9782 | 一种可灭活RNase的表面去污溶液 |
| RNeasy FFPE 试剂盒 | Qiagen | 73504 && 19093 | 用于RNA提取 & DV200 测量 |
| 载玻片邮寄盒 | Simport Scientific | M9504MA | 用于在液体缓冲液中储存载玻片。 |
| 外科设计通用工业刀片 | 赛默飞世尔科技 / 英维特罗根 | 13-812-236 | 组织学——用于样本切片时 |
| TOX 1/2 - 宿主：兔，克隆号：E613Q | CST | 62886SF | （注：本研究特异性）一抗 |
| 二甲苯 组织学级 | 赛默飞世尔科技 | UN1307 | 用于脱蜡 |
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