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RNA 原位 杂交与连续蛋白质免疫荧光串联检测

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DOI：

10.3791/68615

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2025年10月10日

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1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案详细描述了RNA 原位 在自动化平台上对组织进行连续蛋白质免疫荧光与杂交，以表征靶向细胞水平的空间多组学。

摘要

细胞在宿主体内的功能并不依赖于孤立的信号。相反，从最小的RNA分子到最大的蛋白质，所有组分都必须在人体内协调一致地协同运作。因此，整合多层次组学的细胞水平空间研究方法，对于理解细胞间相互作用及疾病进展过程具有至关重要的意义。在同一空间检测体系中解析蛋白质组与转录组，有助于我们不仅了解细胞被指令执行什么功能（RNA），还能揭示其在所处微环境生态位中如何实际执行这些指令（蛋白质）。本论文重点在于将连续免疫荧光技术（SeqIF）与RNA分析进行整合 原位 原位杂交（ISH）结合组织原位微流控系统，用于在空间背景下高通量检测蛋白质和RNA（seqRNA-ISH+seqIF），单次运行可检测多达12种RNA和24种蛋白质靶标，并可进一步增加额外的蛋白质靶标 通过 连续运行。该方法提供了一种无需考虑荧光染料兼容性且无需为更高重数进行大量优化的连续靶向多组学平台。这使得研究者能够了解细胞正在启动或向其微环境传递的信息。这种靶向方法有助于在更精确地研究RNA与蛋白质之间相互作用的同时，验证全转录组分析方法。

引言

人体内细胞的复杂功能依赖于各种信号分子之间错综复杂的相互作用，从小分子RNA到大分子蛋白质，所有这些成分协同工作以维持正常生理活动1。这种相互作用凸显了整合性研究方法的重要性，即在多个组学层面（omics layers）上分析细胞水平的空间相互关系2,3。此类方法对于理解细胞间相互作用的复杂性以及疾病的发展进程至关重要。许多传统技术，如流式细胞术4和单细胞测序5，通常使用分离的细胞来分析解离后的样本，以确定特定样本中各种表型的整体比例。然而，将细胞从原始组织中分离出来进行分析可能会诱导细胞活化或表型改变，从而无法准确反映其在原位（in situ）的真实生物学状态和功能6。空间生物学领域的先进方法为研究细胞及其微环境提供了新策略，能够在不破坏组织结构和多种分子类型下与邻近细胞之间空间关系的前提下，开展深入分析2,7。

在同一空间检测中整合转录组和蛋白质组分析，无需分离单个细胞，可全面揭示细胞功能8。该方法基于单分子RNA荧光原位杂交（FISH）技术，但不包含蛋白酶消化步骤，从而避免了后续蛋白质检测的复杂性8。该方法适用于单一切片，具有更高的空间分辨率，并减少了图像整合与对齐所需的处理工作。该技术能够同时揭示细胞所接收的指令（RNA）及其在特定微环境生态位中的执行情况（蛋白质）。通过整合这些多层次的信息，研究人员可更深入地理解细胞行为与细胞间通讯机制。

尽管存在手动方法，但空间组学技术的最新进展使得能够通过手动多重分析，对更大量的蛋白质组学标志物进行更复杂的分析9这些方法包括蛋白质和RNA原位杂交检测技术的进步10,11,12,13,14以及需要系统特异性偶联抗体的自动化方法15,16,17，成像质谱流式细胞术（IMC）18,19,20 以及其他利用市售一抗和二抗的自动化荧光串联蛋白质组学方法2,21,22这些技术通过靶向方法促进了蛋白质组学或转录组学与蛋白质组学的联合分析，通常同时对RNA进行可视化检测 通过 探针和蛋白质 通过 基于类似偶联物的抗体，可利用相同的方法或仪器同时或依次共检测RNA和蛋白质。通过提供细胞活动的全面视图，此类方法旨在增进我们对细胞与其微环境之间相互作用的理解。该技术为解析细胞互作的复杂性提供了有力工具，有望揭示正常生理过程及疾病机制的新见解。

本方案提供了整合RNA的指导 原位 原位杂交（ISH）与连续免疫荧光（SeqIF）结合，通过组织上的微流控系统驱动。该方法为在天然空间背景下研究RNA和蛋白质提供了高通量工具。此技术（seqRNA-ISH+seqIF）可在单次运行中检测多达12种RNA和24种蛋白质靶标，并可进一步增加蛋白质靶标的检测数量 通过 连续运行。尽管本方案聚焦于一种特定的微流控系统，但所提供的组织处理、RNA质量控制以及抗体选择与滴定指南可适用于其他方法。然而，本方法采用pH 9.0抗原修复以实现高效、无蛋白酶的表位暴露，在提供一定靶向转录组学信息的同时，提升了蛋白质组的稳定性；而传统的RNA原位杂交在pH 6.0条件下依赖蛋白酶处理以增强RNA探针的可及性，却难以保持蛋白质组的完整性。8seqRNA-ISH+seqIF 方法在图中以可视化方式展示 图1，展示RNA FISH扩增后，在使用一抗-二抗配对方法前进行切割的步骤，该方法通过温和的化学方式去除一抗和二抗。seqIF的顺序性操作及其检测过程通过采用连续的实验方法，克服了与荧光染料兼容性相关的诸多限制23这减少了在高重检测方法中同时染色所需的大量优化工作，因为此类方法需要对光谱重叠进行补偿23.

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方案

本方案采用未经治疗的高级别浆液性卵巢癌患者在接受初次肿瘤细胞减灭术时采集的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片。所有临床数据均来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心妇科肿瘤与生殖医学系的卵巢癌样本库，数据获取遵循经机构审查委员会批准的研究方案。患者书面知情同意由前台工作人员获取，研究严格遵循公认的伦理准则进行。

注意：所有试剂除非另有说明，均用无核酸酶的去离子水稀释。

1. 固定并包埋样品

注意：固定剂的选择和固定时间对检测结果有显著影响，通常空间检测多采用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织，因其可较好地保存病理学结构。本方案以FFPE组织为基础进行描述，因此建议以下步骤用于FFPE组织样本。然而，固定过程会影响RNA的质量，对蛋白表位的影响相对较小。这些固定方法、固定不完全以及样本降解均可能导致基于抗体的蛋白质组学检测中非特异性结合增加。第三，内源性荧光通常在FFPE处理过程中被淬灭，但某些荧光染料仍会部分残留，需通过测试确认其是否已被有效淬灭。

  1. 将组织切成厚度 ≤ 5 mm 的切片，以确保固定均匀，并防止脂肪引起的扩散屏障。立即将切片置于 10% 磷酸盐缓冲福尔马林（pH 7.0）中，在 4 °C 下固定 24 小时，以优化 RNA 和蛋白质24。
  2. 使用组织处理机或手动按以下步骤处理固定后的组织
    1. 使用无核酸酶水配制的分子级乙醇对组织切片进行脱水（依次为 70%、75%、95% 两次、100% 三次，每次 1 小时）。
    2. 然后在二甲苯中室温（约 23 °C）浸洗两次，每次 1 小时。
  3. 将石蜡加热至 60 °C。将组织包埋盒浸入熔化石蜡中两次，每次 1 小时。
  4. 将膨胀后的组织放入模具中并调整方向，用新鲜石蜡填充后迅速冷却至 4 °C25。
    注意：为获得最佳 RNA 质量，建议在 48 小时内完成所有步骤。

2. RNA 质量评估

  1. 使用三张连续切片，可选择将三张切片平行运行，或先运行对照切片再运行目标检测面板，以确保封闭充分。成对的阳性对照探针靶向看家基因，用于评估组织质量和组织内的空间完整性，这些可能受到组织保存差异的影响。常用的对照包括 UBC（高表达基因）、PPIB（中等表达）和 POLR2A（低表达）26。在每个检测通道中使用阴性对照探针组，例如 Dab1（一种土壤细菌 RNA）。可选地，可在同一组织样本上同时加入所有阳性和阴性对照探针。在此设置中，将 Dab1 阴性对照置于 T2–T4 通道，将阳性对照按表达水平从低到高分别分配至 T1、T5 和 T9 通道，并确保目标探针占据其余通道。
    可选：此外，对于 RNA 质量未知的样本，可测定其 DV200（Distribution Value 200，即 DV200 分数）以评估质量。建议 DV200 分数应高于 30，优先选择质量更高的样本（DV200 分数为 50 或以上）27。该分数反映 RNA 的质量，样本质量越高，RNA 原位杂交（RNA-ISH）成功检测的可能性越大27。

3. RNA 操作注意事项与准备工作

注意：最佳操作是先对 RNase 污染区域进行去污染处理，擦拭后，再用 70% 乙醇喷洒工作区域。此外，应使用无 RNase 的操作环境，始终佩戴洁净手套、实验服和口罩，以尽量减少皮肤或呼吸带来的 RNase 污染。仅使用无 RNase 的水和耗材，避免将手伸入试剂袋中。这些预防措施，以及保持组织/切片处于低温干燥状态，对于在实验过程中维持 RNA 完整性至关重要。

  1. 使用切片机将组织切片切割至带正电荷的玻璃载玻片上，并将感兴趣区域置于载玻片中心，以与成像区域对齐（不同系统有所差异；此处约为 12.5 mm × 12.5 mm）。
    注意：对于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织，每张切片的理想厚度应在 4–6 µm 之间。
  2. 将 FFPE 载玻片放入干燥且无 RNA 酶的烘箱中，组织面朝上，在 60 °C 下烘烤至少 1 小时；对于脂肪含量较高的组织或易脱落的组织，可烘烤过夜。
  3. 可选预处理步骤
    注意：虽然预处理为可选步骤，但以下列出的某些操作也为可选。
    1. 配制 3% 过氧化氢：在 50 mL 锥形管中，将 5 mL 的 30% 过氧化氢加入 45 mL 的 1× PBS 中。剩余的过氧化氢应密封（瓶盖用 Parafilm 封口），在室温（约 23 °C）下避光保存，最多可保存三个月。
      注意：过氧化氢为强氧化剂，应远离可燃物、热源和金属。应在化学通风橱内操作，并佩戴个人防护装备（PPE；例如护目镜、手套和实验服）。避免接触皮肤、眼睛或吸入蒸气。若皮肤接触，立即用清水冲洗 15 分钟。如误食或吸入，应立即就医。高浓度过氧化氢可导致严重灼伤，并可能与有机物或某些金属发生燃烧或爆炸。配制时务必始终将过氧化氢缓慢加入水中，以避免剧烈反应。
    2. 配制 3.7% 甲醛：在化学通风橱中，将 1 mL 的 16% 甲醛加入 3.3 mL 的 1× PBS 中。将配制好的甲醛溶液用 Parafilm 封口后避光保存，最多可保存三个月。
      注意：甲醛可能导致严重眼损伤、呼吸道刺激，并被怀疑具有致癌性。长期或反复接触可能引起皮肤致敏和过敏反应。仅可在化学通风橱中使用，并穿戴适当的个人防护装备（手套、护目镜/面罩、口罩、实验服等）。避免皮肤接触、眼睛接触和吸入。远离热源和明火。多聚甲醛及受污染材料应作为危险废物处理，且应尽量仅配制即时所需的用量。
    3. 脱蜡处理：将组织载玻片置于含有以下试剂的 50 mL 锥形管中，在化学通风橱内依次用二甲苯（40 mL）洗涤 3 次，每次 5 分钟。
      ​可选：可使用非二甲苯类组织透明剂替代二甲苯，但可能残留石蜡并影响成像质量。具体操作为将切片置于含非二甲苯类组织透明剂（40 mL）的 50 mL 锥形管中，洗涤 2 次，每次 15 分钟。使用蜂蜡包埋的组织块可能难以通过非二甲苯试剂完全脱蜡。对于未知成分的蜡/石蜡混合物，建议在采取适当安全措施的前提下使用二甲苯。二甲苯为危险且易燃物质，长期暴露可能损害中枢神经系统、肝脏和肾脏。仅可在化学通风橱中使用，并佩戴个人防护装备（如手套、口罩和实验服）。二甲苯及受污染材料应作为危险废物处理。如发生暴露，应立即就医。
    4. 水化处理：将组织载玻片依次置于含有以下试剂的 50 mL 锥形管中进行洗涤：100% 乙醇（40 mL）洗涤 2 次，每次 3 分钟；95% 乙醇（40 mL）洗涤 2 次，每次 3 分钟；70% 乙醇（40 mL）洗涤 2 次，每次 3 分钟；50% 乙醇（40 mL）洗涤 2 次，每次 3 分钟；30% 乙醇（40 mL）洗涤 2 次，每次 3 分钟；最后用 1× PBS（40 mL）洗涤 1 次，持续 2 分钟。
    5. 过氧化物酶封闭：将组织置于湿度盒中，在室温（约 23 °C）下用约 100–200 µL 的 3% 过氧化氢覆盖组织，孵育 10 分钟；随后用 1× PBS（40 mL）洗涤 2 次，每次 2 分钟。
      注意：过氧化物酶封闭为可选步骤，其作用是淬灭组织中残留的内源性过氧化物酶活性，以减少非特异性染色，并可能降低组织自发荧光。该步骤对于自发荧光较强的组织尤为重要，例如骨髓、肾脏、肝脏、肺、肠道和脑组织，因为在这些组织中强烈的背景信号可能干扰 TRITC 和 FITC 发射波段的成像28,29,30,31,32。
    6. 甲醛固定：将组织置于湿度盒中，在室温下用约 100–200 µL 的 3.7% 甲醛覆盖组织，孵育 10 分钟；随后用 1× PBS（40 mL）洗涤 2 次，每次 2 分钟。
      注意：此步骤为可选，但推荐用于高脂肪组织或其他易从载玻片脱落的组织，以增强组织附着性。

4. 抗原修复

注意：此处推荐并概述的脱蜡和抗原修复方法与seqRNA-ISH+seqIF所推荐的方法不同 制造商，该制造商使用大容量可控加热抗原修复装置。

  1. 使用微波炉进行热诱导抗原修复（HEIR）
    1. 使用带有温度监控的微波炉，加入足量市售的 pH 9.0 HEIR 缓冲液（约 250 mL），确保覆盖置于载玻片架中的载玻片，且液面低于温度计（如适用）。
      注意：RNA 的抗原修复通常在 pH 6.0 条件下进行，但以下方法采用 pH 9.0 以提高抗体结合效率。
  2. 将载玻片浸入缓冲液后放入微波炉中，如有空腔，需用双蒸水对称平衡。在微波炉中于 107 °C 加热 15 分钟（HEIR 缓冲液通常需总共约 30 分钟达到目标温度）。
  3. 将载玻片置于室温下的化学通风橱中冷却约 20 分钟。
  4. 将载玻片在含有 40 mL 1× PBS 的 50 mL 锥形管中洗涤一次，每次 2 分钟。
  5. 将载玻片储存于带螺口盖的载玻片邮寄盒或装有 1× PBS（或商用多重染色缓冲液）的 50 mL 锥形管中，立即进行后续操作，或在 4 °C 下保存最多 7 天，但建议在 72 小时内完成 seqRNA-ISH+seqIF 实验。

5. 配制储备溶液

  1. 配制40倍浓缩的RNA成像缓冲液
    1. 通过将400 mg粉末状RNA成像缓冲液与25 mL无核酸酶的去离子水混合，配制40倍浓缩的RNA成像缓冲液
    2. 涡旋振荡所得溶液直至完全溶解，随后分装至1.5 mL微量离心管中（每管1 mL）
    3. 于-20 °C冷冻保存，最多可保存三个月，避免反复冻融
  2. 配制20倍浓缩的氯化钠-柠檬酸钠缓冲液（SSC）
    1. 将157.3 g氯化钠（NaCl）和88.2 g柠檬酸钠（Na3C6H5O7）溶解于800 mL无核酸酶的去离子水中
    2. 测定pH值，并逐滴加入1 M盐酸（HCl）调节至pH 7.0
    3. 高压灭菌以实现无菌。
      注意：无菌的20x SSC缓冲液也可从不同公司购买。开启后，于室温至4 °C保存
    4. 通过将1 mL 20x SSC储备液与4 mL无核酸酶去离子水混合，配制4x SSC缓冲液

6. 顺序RNA原位杂交 + 顺序免疫荧光

注意：此处所述所有步骤均改编自制造商关于 seqRNA-ISH+seqIF 的说明书协议 材料表，因此大多数试剂被认定为与系统兼容的商用试剂。这些试剂由制造商识别和/或提供，并设计为与系统兼容。虽然可能进行修改，且相关修改已在讨论部分说明，但修改后可能需要额外的测试以及流体清洗步骤，以防止残留积聚。软件将在 panel 和实验方案设计并输入后，自动计算所需试剂的总体积。然而，本文提供了推荐的修改方案。总体积将始终根据每个实验方案中使用的循环次数和靶标数量而有所变化。但是，除非将每种单独的组合在数据库中作为独立条目输入，否则系统不会自动计算抗体和RNA-ISH的稀释量。在本实验方案中，每张样本切片需要400 μL抗体混合液。

  1. 系统准备
    1. 在进行 seqRNA-ISH+seqIF 之前，使用无核酸酶水彻底冲洗所有微流控系统。
    2. 使用 RNase 去污染溶液喷洒系统外部，随后用 70% 乙醇喷洒。
  2. 准备通用试剂
    1. 洗涤缓冲液：20 倍系统兼容的商用多重染色缓冲液 50 mL + 无核酸酶去离子水 950 mL
    2. 水：无核酸酶去离子水 100 mL。
    3. 乙醇：70% 乙醇 100 mL。
    4. 成像缓冲液：10 倍系统兼容的商用成像溶液 16 mL + 无核酸酶去离子水 140 mL + 系统兼容的商用成像母液 4 mL
    5. 洗脱缓冲液：系统兼容的商用洗脱溶液 1 152 mL + 系统兼容的商用洗脱溶液 2 8 mL
    6. 淬灭缓冲液：无核酸酶去离子水 130 mL + 系统兼容的商用淬灭溶液 1 14 mL + 系统兼容的商用淬灭溶液 2 16 mL
  3. 准备 RNA-ISH 实验方案的染色试剂
    ​注意：此步骤可在前一晚完成，并于 4 °C 避光保存。尽管制造商建议混合探针可使用长达一年，但由于污染风险，不建议提前超过一周混合探针。对于探针，最好通过轻弹或轻轻吹打混匀，并在使用前短暂离心以收集管壁液体。
    1. 在系统兼容的微量离心管中，按每张载玻片 500 µL 加入系统兼容的商用无蛋白酶通透溶液。
    2. 根据周期（表 1）将 RNA-ISH 放大剂混合，每种组合在系统兼容的微量离心管中总量为每张载玻片 500 µL：i) T1 至 T4 尾部的 ZZ 尾树，ii) T5 至 T8 尾部的 ZZ 尾树，iii) T9 至 T12 尾部的 ZZ 尾树。
    3. 将与尾树特异性匹配的荧光染料混合，在系统兼容的微量离心管中每种组合总量为每张载玻片 500 µL：i) T1 至 T4 树的荧光染料，ii) T5 至 T8 树的荧光染料，iii) T9 至 T12 树的荧光染料。
      注意：此步骤对光敏感
    4. 每张载玻片使用无核酸酶去离子水配制 1 mL 商用 DAPI（储存浓度为 1 mg/mL）的 1:200 稀释液，稀释于商用多重染色缓冲液中
      注意： 该操作按照制造商说明进行，其中 DAPI 为标准试剂的一部分。若使用以 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）稀释的自定义 DAPI 配方，稀释比例可能不同，需进行滴定测试。但建议使用 1 mg/mL 储存液的 1:1000–1:2000 稀释度。通常该浓度高于常规手动染色方案，因其需在多轮成像与剥离过程中保持信号。以 DMF 新鲜配制的 DAPI 通常比市售 DAPI 配方更亮。含甲酰胺的试剂（如 DAPI）应在化学通风橱中操作。甲酰胺可能导致生殖毒性与器官损伤，并疑似具有致癌性。请使用适当的个人防护装备（如手套和实验服）。
    5. 使用 12.125 mL 无核酸酶去离子水、1.5 mL 10x 成像缓冲液母液 B 和 275 µL 40x 成像缓冲液母液 A（已解冻或新鲜配制），在使用前立即配制 RNA-ISH 成像缓冲液
    6. 根据滴定测试确定的稀释比例，在系统兼容的微量离心管中，使用商用多重染色缓冲液为 seqIF 准备最多 10 对一抗（一抗蛋白抗体详见 表 2），每张载玻片总量为 400 µL。确保每轮 seqIF 中每个宿主物种仅含一种一抗。
    7. 根据步骤 6.3.7 中的一抗组合，使用滴定测试确定的稀释比例，为 seqIF 准备二抗荧光染料（表 3）及 DAPI。在 50 mL 锥形管中用多重染色缓冲液稀释，每轮总量为 400 µL，死体积至少为 1 mL。二抗 Alexa Fluor 抗体和 DAPI 的示例浓度如下：Alexa Fluor 555 为 1:200 稀释，Alexa Fluor 647 为 1:400 稀释，DAPI（来自 1 mg/mL DMF 溶液）为 1:1800 稀释
      注意：此步骤对光敏感。将 DAPI 加入二抗中并非制造商方案要求，但有助于在多轮 seqIF 中维持 DAPI 信号，从而辅助运行后图像的对齐。大多数图像处理软件（包括本系统配套软件）利用 DAPI 信号确认循环荧光共定位成像的对齐情况。
  4. 系统初始化
    1. 按照系统指定顺序加载步骤 6.3 中的每种试剂。注意通常顺序如上所述，但务必确认试剂与其加载位置匹配
    2. 将抗原修复后的载玻片装入支架，确保载玻片成像窗口位于成像区域中心，再将系统兼容的微流控芯片置于其上并锁定到位。
      注意：若清洗和储存得当且密封垫完好，微流控芯片可在 seqIF 滴定测试中重复使用一次。但由于潜在污染风险，若用于 RNA 面板实验则不可重复使用。
    3. 通过混合 1.35 mL 4x SSC 与 150 mL 商用 10x 切割溶液，配制切割溶液。
      注意：10x 切割溶液极易氧化，应储存在玻璃安瓿瓶中，仅在 seqRNA-ISH+seqIF 实验运行前立即打开使用。

7. 系统运行

  1. 根据制造商说明运行系统，使用12-plex seqRNA-ISH结合20-plex蛋白seqIF，在12.5 cm × 12.5 cm成像窗口下，两张载玻片的近似运行时间为48小时。
  2. seqRNA-ISH+seqIF运行完成后，可将载玻片取出并保存于1× PBS中，或立即用于额外的seqIF检测（最多可检测40种蛋白）。
    注意：每次运行前后，必须使用无核酸酶水清洗并冲洗系统的微流控通道，以降低污染风险。

8. 可选：图像与统计分析

  1. 进行图像和统计分析 通过 图像分析或病理学分析工具

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结果

作为该方法的一个示例，我们对两张人高级别浆液性卵巢癌组织切片进行了以下seqRNA-ISH（表1）和SeqIF（表2 和 表3）实验。

图2 展示了卵巢肿瘤组织样本上 seqRNA-ISH 与 seqIF 的叠加图像。利用胶原蛋白1等结构蛋白标志物可识别肿瘤区域，而CD33、CD8和颗粒酶B（GZMB）等表型和功能标志物则有助于区分特定的免疫细胞，这对于理解肿瘤-免疫微环境至关重要。RNA探针靶向ApoE和PDL1等分子，以提供额外的信息，并促进RNA转录与蛋白质翻译之间的比较；而对于GZMB，由于我们在同一组织中同时呈现了蛋白质和RNA信号，因此可能识别出翻译调控机制，这可能对癌症进展产生重要影响33。

图3 展示了同一卵巢组织切片的另一种视图，其中蛋白质标记...

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讨论

制备和处理样本时最关键的步骤是降低RNase污染。可通过佩戴口罩以防止呼吸带来的污染，并使用RNase去污染溶液以及用无核酸酶水配制的70%乙醇擦拭工作台面来实现。对于FFPE切片，建议从FFPE组织块上连续切下多张相邻切片用于seqRNA-ISH+seqIF实验，并将其与干燥剂一同在4 °C下保存。在质量控制方面，除了检测组织块的DV200外，还建议在相邻组织切片上运行RNA阳性对照（UBC、PPIB、POLR2A）和阴性对照（DapB）。将样本和切片在4 °C下保存有助于防止RNA降解（RNA降解随温度升高而加剧），而干燥剂则有助于减少水溶性蛋白质的降解。在4 °C条件下使用的干燥剂需定期更换。对于脂肪含量较高或难以贴附于载玻片的组织，应将烘烤时间从通常的最少1小时延长至过夜（12至18小时）。延长烘烤时间可增强组织与载玻片的粘附性；然而，温度升高可能会加剧RNA的降解。

组织自发荧光通常在300-500 nm范围内被激发，并在350-555 nm范围内发射（例如DAPI-TRITC范围内的发射滤光片）35,...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究部分由卵巢癌研究联盟（OCRA 811621 和 891490）、Sie 基金会以及 Stephanie C. Stelter 捐赠基金资助。本研究与流式细胞术和细胞成像核心设施合作完成，该设施部分由美国国立卫生研究院通过 M. D. Anderson 癌症中心支持基金 P30 CA016672 以及 Jared Burks 的美国国家癌症研究所研究专家项目 1 R50 CA243707-01A1 提供支持。

我们还要感谢Lunaphore公司的Emily Martersteck在技术协助和培训方面提供的支持。

作者通过Bio-Techne公司的早期使用计划，以优惠价格获得了一套RNAScope靶向探针和对照探针，部分试剂由该公司免费提供用于本研究。制造商未参与研究设计、数据收集与分析，或稿件的撰写。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）赛默飞世尔科技 / 英维特罗根EN62248 / 62248用于细胞核染色（本研究中使用的产品 62247 已停产）
50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管赛默飞世尔科技339652用于分装 &和混合二次溶液
70% 无菌异丙醇酒精TexwipeTX3270用于表面去污染
抗体各种各种用于主要目标，根据所用通道不同而有所变化
APOE - 宿主：小鼠，克隆号：960318R&研发MAB41443-100（注：本研究特有）一抗
aSMA - 宿主：小鼠，克隆号：1A4CST69319SF（注：本研究特有）一抗
自动切片机Leica14051956472组织切片
CD10 - 宿主：兔，克隆号：E5P7SCST65534S（注：本研究特有）一抗
CD11c - 宿主：兔，克隆：D3V1ECST93233SF（注：本研究特有）一抗
CD163 - 宿主：兔，克隆号：D6U1JCST93498S（注：本研究特异性）一抗
CD163 - 宿主：兔，克隆株：ja51-30Invitrogenma5-32684（注：本研究特异性）一抗
CD20 - 宿主：小鼠，克隆号：L26贝赛尔A500-017ACF（注：本研究特有）一抗
CD31 - 宿主：小鼠，克隆：3F8E2ProteinTech66065-2-Ig（注：本研究特有）一抗
CD33 - 宿主：兔，克隆号：BLR061G贝赛尔A700-061CF（注：本研究特有）一抗
CD4 - 宿主：兔，克隆号：EPR6855Abcamab181724（注：本研究特有）一抗
CD45 - 宿主：兔，克隆号：BL-178-12C7贝赛尔A700-012（注：本研究特有）一抗
CD45RO - 宿主：小鼠，克隆：UCHL1贝赛尔A500-020ACF（注：本研究特有）一抗抗体
CD56 - 宿主：兔，克隆号：BLR152J贝赛尔99746（注：本研究特异性）一抗
CD66b - 宿主：兔，克隆号：BLR111HInvitrogenMA5-44413（注：本研究特异性）一抗
CD68 - 宿主：小鼠，克隆：KP-1Biolegend916104（注：本研究特有）一抗
CD8 - 宿主：小鼠，克隆号：C8/144BBiolegend372902（注：本研究特有）一抗抗体
CD86 - 宿主：兔，克隆号：E2G8PCST76755SF（注：本研究特有）一抗抗体
Col 1A1 - 宿主：小鼠，克隆号：E3E1XCST66948S（注：本研究特有）一抗
DNA LoBind 管 2 mLEppendorf22431048用于混合RNA探针溶液
Drierite 21005 指示型干燥剂科尔-帕尔默21005干燥器用干燥剂
Edge-Rite切片机刀片赛默飞世尔科技 / 英维特罗根4280L组织学——用于样本切片时
乙醇 100%（200 Proof）Pharmco111000200用于脱蜡
EZ-AR2 优雅缓冲液BioGeneXHK547-XAK用于福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复
FOXP3 - 宿主：兔，克隆性：多克隆贝赛尔A700-034CF（注：本研究特异性）一抗
山羊抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 555赛默飞世尔科技 / 英维特罗根A-21425（注：本研究特有）F(ab')2-山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 555
山羊抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 647赛默飞世尔科技 / 英维特罗根A-48289/A-21237（注：本研究特有）F(ab')2-山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ Plus 647
山羊抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 555赛默飞世尔科技 / 英维特罗根A-21430（注：本研究特有）F(ab')2-山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 555
山羊抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 647赛默飞世尔科技 / 英维特罗根A-21246（注：本研究特有）F(ab')2-山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 647
GZMB - 宿主：兔，克隆：多克隆ProteinTech13588-1-AP（注：本研究特有）一抗抗体
Hs-POLR2A-T1ACD Biotechne310457-T1人类低表达探针
Hs-PPIB-T5ACD Biotechne313907-T5人类中段表达探针对照
Hs-UBC-T9ACD Biotechne310047-T9人类高表达对照
30% 过氧化氢溶液Sigma-AldrichHX0640-5用于组织制备，有助于阻断内源性过氧化物酶活性，并产生高显色产物。配制3%过氧化氢溶液
Ker8/18 - 宿主：小鼠，克隆类型：多克隆ProteinTech66187-1-PBS（注：本研究特有）一抗
LRP5 - 宿主：兔，克隆号：HPA030505SigmaHPA030505-100UL（注：本研究特异性）一抗
Lunaphore 20x 多重染色缓冲液Bio-TechneBU06用作 COMET 实验的稀释液和洗涤液
Lunaphore COMET 芯片Bio-TechneMK03用于COMET仪器的微流控芯片
Lunaphore COMETBio-TechneCM10-SSeq-IF 自动染色仪
Lunaphore 洗脱缓冲液试剂盒Bio-TechneBU07-L溶液1 &用于 COMET 洗脱步骤的溶液 2
Lunaphore 成像缓冲液试剂盒Bio-TechneBU09溶质 & COMET 实验成像过程中使用的溶剂
Lunaphore 灭活缓冲液Bio-TechneBU08-L溶液1 &以及用于COMET淬灭步骤的溶液2
微量移液器各种N/A用于试剂制备
Periostin - 宿主：小鼠，克隆号：1A11A3ProteinTech66491-1-PBS（注：本研究特有）一抗
Pierce 16% 甲醛（w/v），无甲醇赛默飞世尔科技28908用于组织制备的3.7% PFA的配制
T2 通道中的探针 320102ACD Biotechne300040T2 中的阴性对照 DapB
T3 通道中的探针 320102ACD Biotechne300040T3 中的阴性对照 DapB
探针 320102（T4 通道）ACD Biotechne300040T4 中的阴性对照 DapB
RNAscope HiPlex 裂解储存液Bio-TechneP/N 324399RNAScope 检测中用于切割的试剂
RNAscope HiPlex Pro COMET 12-重 20片装试剂盒Bio-Techne322075试剂 & RNAScope 用缓冲液
RNAscope HiPlex 探针 - 人 APOE-T2ACD Biotechne433093-T2（注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-APOE-T2
RNAscope HiPlex 探针- Hs-ARG1-T4ACD Biotechne401581-T4（注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-ARG1-T4
RNAscope HiPlex 探针- Hs-CD274-T1ACD Biotechne600863-T1（注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-CD274-T1
RNAscope HiPlex 探针-Hs-CD40-T6ACD Biotechne445973-T6（注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-CD40-T6
RNAscope HiPlex 探针- Hs-CXCL1-01-T12ACD Biotechne1256473-T12（注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-CXCL1-01-T12
RNAscope HiPlex 探针-Hs-GZMB-T7ACD Biotechne468453-T7（注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-GZMB-T7
RNAscope HiPlex 探针 - 人-IFNG-T3ACD Biotechne310503-T3（注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-IFNG-T3
RNAscope HiPlex 探针- Hs-IL23a-T8ACD Biotechne562853-T8（注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-IL23a-T8
RNAscope HiPlex 探针- Hs-IL6-T9ACD Biotechne400883-T9（注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-IL6-T9
RNAscope HiPlex 探针- Hs-TNFa-T11ACD Biotechne310423-T11（注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-TNFa-T11
RNAscope HiPlex 探针- Hs-VEGFA-T5ACD Biotechne423163-T5（注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-VEGFa-T5
RNAscope HiPlex 探针- Hs-VISTA-T10ACD Biotechne491513-T10（注：本研究特有）早期访问 RNAscope™ HiPlex CS 探针-Hs-VISTA-T10
RNAscope HiPlex12 CS 阴性对照探针ACD Biotechne324347制造商推荐的完整12重阴性对照面板。T1-T12中为DapB。
RNAscope HiPlex12 CS 人源阳性对照探针-HsACD Biotechne324317制造商推荐的完整12重人源阳性对照面板。Hs -RTU，对应通道T1至T12中的以下看家基因：Polr2a、PPIB、UBC、HPRT1、TUBB、RPL28、RPL5、B2M、ACTB、LDHA-O1、RPLP0-X-RPLP0P2、GAPDH。
无RNase水康宁46-000-CM清洁和准备所有设备，并在需要时用作稀释剂
RNaseZap RNase 去污染溶液赛默飞世尔科技AM9782一种可灭活RNase的表面去污溶液
RNeasy FFPE 试剂盒Qiagen73504 && 19093用于RNA提取 & DV200 测量
载玻片邮寄盒Simport ScientificM9504MA用于在液体缓冲液中储存载玻片。
外科设计通用工业刀片赛默飞世尔科技 / 英维特罗根13-812-236组织学——用于样本切片时
TOX 1/2 - 宿主：兔，克隆号：E613QCST62886SF（注：本研究特异性）一抗
二甲苯 组织学级赛默飞世尔科技UN1307用于脱蜡

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