双模态分子图谱：整合多重mRNA检测与蛋白质成像质谱流式技术

摘要

本方案详细介绍了在福尔马林固定石蜡包埋组织切片中进行多重 mRNA 检测结合蛋白质成像质谱流式技术的方法学。

摘要

在同一检测中实现蛋白质和 mRNA 的共检测，有助于我们理解细胞如何为到达特定位置进行预准备，以及在迁移和与周围环境相互作用时接收哪些信号线索。当前高重成像技术已能够同时对空间分辨的 mRNA（空间转录组学）和蛋白质（空间蛋白质组学）进行表征。为避免重复分析，这些分析物可在同一张组织切片中完成检测。尽管已有多种技术可实现多蛋白与少数 mRNA 或相反情况的检测，但由于蛋白质是细胞功能的核心执行分子，本论文重点聚焦于将蛋白质成像质谱流式技术（IMC）与 mRNA 检测相结合。 原位 利用金属探针的原位杂交（ISH）。这使我们能够了解细胞在其微环境中准备传递或正在快速向外界发送哪些信息。同时，该方法克服了仅使用抗体检测分泌蛋白或难以检测的标志物时所面临的局限性，这些标志物通常难以定量和可视化。此外，本方案减少了高重荧光方法中常见的补偿调节或后期处理需求，因为基于金属探针的检测系统不存在荧光光谱溢出问题，也无需考虑组织特异性自发荧光。

引言

不同患者中的癌症表现出结构和功能上的多样性。由正常细胞和恶性细胞组成的肿瘤微环境（TME）在不同患者之间具有异质性。转移是原发性肿瘤残留物以细胞簇或单个细胞形式逃逸进入血液所致，这为疾病进展和治疗反应提供了线索^1,2。这些微环境的复杂性亟需被深入理解¹。尽管肿瘤包含多种细胞类型，临床标准仍主要基于单一标志物进行组织学判断，但这一现状正开始改变^1,2。多重成像技术为病理学研究提供了新的方向。目前，已可在单细胞或接近单细胞分辨率下实现对人类癌症的空间分辨蛋白质组学、基因组学、代谢组学和脂质组学分析^3,4,5,6。

这些技术能够解析肿瘤中异质性细胞的空间定位及其相互作用。采用合适的单细胞生物成像方法，可对患者活检样本中多种与疾病相关的蛋白质生物标志物进行谱型分析，从而为癌症治疗方案的设计提供依据。来自空间细胞图谱的研究见解将有助于指导联合治疗策略的选择，以高效清除肿瘤，同时减少脱靶效应、耐药性和复发。¹问题在于如何将这些多种多样的技术整合起来，而这些技术通常在同一组织切片上无法协同工作。⁷. 本方案在视觉上概述于 图1，能够在同一组织切片和同一细胞中，以高于同时进行的荧光蛋白与RNA原位杂交（fluorescent protein+RNA-ISH）所能实现的多重性，对蛋白质组学和特定mRNA子集进行空间分析⁸这也可以作为平行分析的桥梁^3,4,6，旨在对数据进行解卷积分析。尽管存在双重检测，但仍可观察到某些细胞已快速启动mRNA的合成，然而由于直接标记的一抗检测方法本身灵敏度有限且缺乏信号放大机制，导致分泌的蛋白质无法被检测到，这使得分泌分子的检测尤为困难。以下方案改编自一种12重荧光/显色检测方法，适用于基于金属的检测技术 通过 用于IMC中同时检测的巯基还原修饰探针

方案

本方案采用未经治疗的高级别浆液性卵巢癌患者接受初次细胞减灭术时采集的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。所有临床数据均来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心妇科肿瘤与生殖医学系的资料库，获取过程遵循经机构审查委员会批准的研究方案。已获得患者的书面知情同意，研究严格按照公认的伦理准则进行。

1. 注意事项与准备工作

1. 始终使用无核酸酶水（NFW）配制所有所需试剂。
2. 所有步骤均应使用塑料容器，避免使用玻璃器皿，以减少金属与玻璃结合及金属污染。
3. 保持工作区域高度清洁，使用RNase去污染溶液喷洒台面和移液器，随后用NFW配制的70%乙醇喷洒。
4. 将巯基化mRNA检测探针（T1-T12）与相应的金属结合 通过 马来酰亚胺连接子，如Schulz等人所述⁷，进一步详情见 protocol.io 上的 材料表.
   注意：应选择能够指示细胞在组织内位置的蛋白质靶标（结构性标志物）、确定存在哪些细胞的标志物（表型标志物），以及反映细胞功能活动的标志物（功能性标志物）。由于某些功能性标志物呈瞬时表达，引入mRNA靶标可实现对正在生成这些标志物的细胞的识别。

2. 样品制备与预处理

1. 将组织切片置于干燥烘箱中，60 °C 下烘烤过夜。
2. 进行脱蜡处理：二甲苯处理三轮，每轮 5 分钟；再进行十轮水化处理（100% 乙醇（EtOH）2 次，95% EtOH 2 次，70% EtOH 2 次，50% EtOH 2 次，30% EtOH 2 次），每轮 3 分钟。用 1× Tris 缓冲盐水（TBS）洗涤一次，每次 2 分钟。根据同时处理的样本数量，使用 50 mL 锥形管（最多 2 张载玻片）或 350 mL 免疫组化染色盒（最多 24 张载玻片）。
   注意：此脱蜡步骤虽为推荐操作，但可根据组织类型选择性执行。
3. 加入 3.7% 多聚甲醛（PFA）溶液，室温孵育 10 分钟，将组织切片放入 50 mL 管中，并加入足量 PFA 溶液以完全覆盖组织切片。
4. 微波辅助热诱导抗原修复（HEIR）：使用带温度监控的微波炉，将一个托盘加入 pH 6 的 HEIR 抗原修复缓冲液（350 mL），其余托盘加入无核酸酶水（NFW）。将组织切片放入显微镜载玻片染色架中，并将其置于含抗原修复缓冲液的托盘内。
   注意：进行抗原修复前，确保抗原修复缓冲液已恢复至室温（RT）。
5. 在 107 °C 下进行抗原修复 15 分钟，随后将载玻片置于化学通风橱中，室温冷却 20 分钟。
6. 在抗原修复过程中，将保湿纸用无核酸酶水润湿，放入湿度控制载玻片染色托盘中，并将托盘置于 60 °C 的杂交炉内。
7. 用无 RNase 的 TBS 溶液冲洗载玻片 3 分钟，随后干燥 3 分钟。

3. 蛋白酶处理

1. 使用疏水性屏障笔在每张组织切片周围画出疏水屏障。让屏障完全干燥，约需 2 分钟。
2. 打开摆动夹，将干燥的载玻片装入湿盒中的载玻片架内。
3. 滴加足够量的蛋白酶，完全覆盖组织切片。从杂交炉中取出预热的湿控盒（60 °C，步骤 2.6），并将载玻片架插入湿控盒中。重新密封湿控盒，并放回杂交炉。在 40 °C 下孵育 30 分钟。
4. 在孵育期间，准备 RNA-ISH 检测所需材料。
   1. 通过将 50 倍浓缩液用 NFW 稀释，配制 500 mL 的 1 倍 RNA-ISH 洗涤缓冲液。可在室温下保存长达一个月。
      注意：若 50 倍洗涤缓冲液中出现沉淀，请在配制 1 倍洗涤缓冲液前，将缓冲液于 40 °C 加热 10–20 分钟以重新溶解。
5. 在 NFW 中加入 5 mL Tween，配制 1 L 的 DTBS-T（0.5% Tween）。
6. 准备 RNA-ISH ZZ 配对靶标探针：
   1. 将 mRNA 探针原液和 RNA-ISH 稀释液置于 40 °C 干式加热器中温育 10 分钟。涡旋震荡探针后，在台式小型离心机中短暂离心。
   2. 通过将 50 倍原液探针用 RNA-ISH 稀释液稀释，配制 1 倍混合液（最多 12 种探针，表 1），确保最终体积足以完全覆盖整个组织切片。
   3. 充分涡旋混匀，将混合探针和 RNA-ISH 稀释液置于室温下备用。
7. 从杂交炉中取出湿控盒，并取出载玻片架。将湿控盒放回杂交炉中。
8. 将载玻片放入已用 NFW 预先清洗过的透明载玻片架中。在 NFW 中轻轻振荡洗涤 5 分钟。
9. 更换新鲜 NFW，重复洗涤步骤 5 分钟。

4. 靶标探针杂交

1. 去除载玻片上的多余液体。将湿度控制盘从烘箱中取出，并将载玻片架放入盘中。
2. 加入足量的适当探针混合液，完全覆盖每个组织切片。盖上盘盖，放入40 °C烘箱中孵育2小时。
3. 在孵育结束前30分钟，将RNA原位杂交放大剂1（ZZ尾树，用于T1至T4尾）试剂置于室温平衡，以用于步骤5.2。
4. 孵育完成后，从杂交烘箱中取出湿度控制盘，并取出载玻片架。将盘放回烘箱中。
5. 将载玻片放入已用NFW预洗过的透明载玻片架中。在1x洗涤缓冲液中轻轻振荡洗涤2分钟。
6. 在室温下用新鲜的1x洗涤缓冲液重复洗涤步骤，持续2分钟。

5. 杂交RNA-ISH扩增剂1

1. 去除切片上的多余液体，将切片放入湿化盘的切片架中。将切片架插入湿化控制盘内。
2. 涡旋振荡 RNA-ISH 放大剂 1，使其完全覆盖每个组织切片。盖上湿化盘，放入杂交炉中，在 40 °C 下孵育 30 分钟。将 RNA-ISH 放大剂 2（用于 T5 至 T8 尾部的 ZZ 尾树）试剂置于室温，以备第 6.2 步使用。
3. 从杂交炉中取出湿化控制盘，取出切片架。将湿化盘放回杂交炉中。
4. 将切片放入已用 NFW 预先清洗过的透明切片架中。在 1x 洗涤缓冲液中轻轻振荡洗涤 2 分钟。
5. 在室温下，用新鲜的 1x 洗涤缓冲液重复洗涤步骤，持续 2 分钟。

6. 杂交 RNA-ISH 放大剂 2

1. 去除切片上的多余液体。将湿度控制托盘从烘箱中取出，把切片架放入托盘中。
2. 涡旋振荡 RNA-ISH 扩增液 2，并加入覆盖每个组织切片。盖上托盘，放入杂交炉中，在 40 °C 下孵育 30 分钟。
3. 将 RNA-ISH 扩增液 3（用于尾部 T9 至 T12 的 ZZ 尾树试剂）置于室温，以备第 7.2 步使用。将切片架从托盘中取出，再将托盘放回烘箱中。
4. 将切片放入已用 NFW 预先清洗过的透明切片架中。在 1× 洗涤缓冲液中轻轻振荡洗涤 2 分钟。
5. 在室温下，用新鲜的 1× 洗涤缓冲液重复洗涤步骤，振荡 2 分钟。

7. 杂交 RNA-ISH 放大探针 3

1. 去除切片上的多余液体。从烘箱中取出湿度控制托盘，并将切片架放入托盘中。
2. 涡旋混匀RNA-ISH扩增剂3，使其完全覆盖每个组织切片。盖上托盘，放入杂交炉中，在40 °C下孵育30分钟。
3. 孵育期间，准备步骤8所需的金属寡核苷酸混合液。每种寡核苷酸使用浓度为1:15（从10 μM的储备液稀释），确保最终体积足以完全覆盖整个组织切片。充分涡旋混匀，混合后的金属寡核苷酸置于室温下备用。将湿度控制托盘从烘箱中取出，然后将切片架从托盘中移出，随后将托盘放回烘箱。
4. 将切片放入预先用NFW清洗过的透明切片架中。在1×洗涤缓冲液中轻轻振荡洗涤2分钟。
5. 在室温下，用新鲜的1×洗涤缓冲液重复洗涤步骤，振荡2分钟。

8. 杂交金属寡核苷酸

1. 从载玻片上移除多余的液体。将湿度控制盘从烘箱中取出，并将载玻片架放入盘中。加入步骤 7.3 中配制的混合金属寡核苷酸（使用前涡旋混匀）。
2. 盖上盘盖，将其放入杂交炉中，在 40 °C 下孵育 45 分钟。
3. 从杂交炉中取出湿度控制盘，取出载玻片架。将盘放回烘箱中。
4. 将载玻片放入预先用 NFW 清洗过的透明载玻片架中。在 1x 洗涤缓冲液中轻轻振荡洗涤 2 分钟。
5. 在室温下，用新鲜的 1x 洗涤缓冲液重复洗涤步骤 2 分钟。

9. 金属偶联抗体

1. 为阻断非特异性位点，加入足量封闭缓冲液以覆盖整个组织切片，室温孵育30分钟。
2. 孵育期间，将抗体（表1）用抗体稀释缓冲液稀释，配制步骤10.1中使用的抗体混合液。

10. 金属偶联抗体孵育

1. 封闭缓冲液孵育后，弃去组织切片上的封闭缓冲液，并加入足量的抗体混合液（来自步骤 9.2），以完全覆盖组织切片区。
2. 将切片置于湿盒中，在 4 °C 下孵育过夜（约 16 小时）。

11. DNA 染色

1. 配制新鲜的Ir-嵌入剂溶液。
   1. 从500 µM的储存液中，用无RNase的TBS配制1:2000的工作液。工作液可分装后于-20 °C保存（避免反复冻融）。
2. 将切片放入已用NFW预洗过的透明切片架中，用TBS-T缓冲液轻轻振荡洗涤5分钟。
3. 在TBS-T中重复洗涤一次。
4. 用Ir工作液（来自步骤11.1.1）在室温下染色5分钟。
5. 将切片放入已用NFW预洗过的透明切片架中，用TBS-T缓冲液轻轻振荡洗涤5分钟。
6. 在TBS-T中重复洗涤一次。
7. 用TBS洗涤两次，每次5分钟（缓慢搅拌）。
8. 将切片快速浸入ddH₂O中，以防止TBS中的盐在组织上结晶。
9. 在化学通风橱下干燥10分钟，并于4 °C保存直至成像。

12. 图像采集

1. 将载玻片装入IMC的消融室中。
2. 拍摄全景图像以确定感兴趣区域（ROI）。
3. 在图像采集软件中划定ROI。
4. 应用采集模板。
5. 根据样本类型调整激光功率（消融能量），默认设置为0 dB。
   注意：建议在多个小组织区域（30 µm × 30 µm）上测试消融能量，每次增加1 dB。选择能够清除样本而不灼伤载玻片的最低消融能量。通常情况下，激光功率为3–4 dB。若组织厚度超过建议值，激光功率偶尔需增至5 dB。
6. 启动激光消融。系统将激光引导至ROI，消融金属标记的蛋白质，产生气溶胶羽流，随后被转移至电感耦合等离子体（ICP）炬管，在等离子体中羽流被汽化、原子化并离子化。
7. 检测器测量每种同位素的数量，并将其转换为数据。

结果

在同一项检测中实现蛋白质和 mRNA 的同步检测，有助于我们理解细胞在到达特定位置前的准备状态，以及其在迁移和与环境相互作用过程中所接收到的信号。如代表性数据所示，mRNA 与蛋白质检测是空间生物学研究中的关键环节，因为检测的下限往往受到标记、检测和/或成像步骤流程的限制，具有较大挑战性。仅蛋白酶的引入就可能使联合实验方案中的关键标志物变得复杂，因此，设置重复实验不仅有助于阐明结果，也具有验证意义。

本方案介绍了一种包含28种金属偶联抗体和12种mRNA探针的检测方法（表1）。如图2所示，CD8 T细胞的活化状态具有多样性，可通过不同标志物的组合进行评估。这些组合可用于表征具有不同活化水平的各类细胞亚群。图2A显示一个活化的CD8 T细胞在mRNA和蛋白质水平均表达颗粒酶B，并且表达干扰素γ（IFN-γ）；图2B显示另一个活化的CD8 ...

讨论

多重多组学是所采集数据的关键演进，旨在研究影响疾病进展和治疗的细胞间及细胞与微环境间的相互作用。在同一样本乃至同一细胞中分析这些数据至关重要，因为许多蛋白质靶标呈瞬时表达，或其mRNA与蛋白质表达水平存在差异，因此将靶向mRNA检测与蛋白质检测相结合，有助于检测那些难以发现或表达差异的靶标²¹。近年来，RNA原位杂交（RNA-ISH）技术与成像质谱流式技术（IMC）的整合取得了新进展，实现了在同一张组织切片上进行多组学分析^22,23,24,25，从而可在单细胞分辨率下直接整合转录组学与蛋白质组学信息。

为确保检测的可靠性，采用 Schultz 等人所述的方法实施了严格的对照策略，最初使用荧光团和金属对探针进行双重标记⁷。如

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.	Protocols.IO	dx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2	用于成像质谱流式的寡核苷酸-聚合物偶联 V.2
10x TBS 无RNA酶	Thermo Fisher Scientific	J62780.K7	用于各步骤间的间歇性洗涤
ACD HybEZ II 杂交系统	ACD Biotechne	321711	用于烘烤组织切片的烤箱
抗体稀释液	Dako	S0809	抗体稀释缓冲液
抗体：B7-H3	Bethyl	A700-025CF, A700-026CF	克隆号：BLR025F, BLR026F
抗体：B7-H4	Thermo Fisher Scientific	14-5949-82	克隆号：H74
抗体：BRD4(6F11)	Bethyl	A700-005CF	克隆号：BL-151-6F11
抗体：CCR6	R&D	MAB195-100	克隆号：53103
抗体：CD11b	Abcam	ab209970	克隆号：EPR1344
抗体：CD25	Abcam	ab215378	克隆号：EPR6452
抗体：CD278/ICOS	CST	89601BF	克隆号：D1K2T
抗体：CD31	Abcam	ab207090	克隆号：EPR3094
抗体：CD33	Abcam	ab238784	克隆号：SP266
抗体：CD3e	CST	85061BF	克隆号：D7A6E
抗体：CD4	Abcam	ab181724	克隆号：EPR6855
抗体：CD44	Thermo Fisher Scientific	MA1-10225	克隆号：IM7
抗体：CD45	Thermo Fisher Scientific	14-9457-82	克隆号：CD45-2B11
抗体：CD8a	CST	85336BF	克隆号：D8A8Y
抗体：CXCL13	R&D	AF801	克隆号：多克隆
抗体：CXCR5	R&D	MAB190-100	克隆号：CXCR5
抗体：gamma-H2AX	Bethyl	A700-053CF	克隆号：BLR053F
抗体：颗粒酶B	Santa Cruz	sc-8022 x	克隆号：2C5
抗体：KAP1	Bethyl	A700-014CF	克隆号：BL-248-2G6
抗体：Ki67	Bethyl	A700-021CF	克隆号：BLR021E
抗体：LCK	CST	2984BF	克隆号：D88
抗体：MFAP5	N/A	N/A	PMID: 31332047 / 克隆号：130A （注：定制设计）
抗体：SMA	CST	56856BF	克隆号：1A4
抗体：VEGF	STB-Fluidigm	3163028D	克隆号：G153-494
抗体：VISTA	CST	64953BF	克隆号：D1L2G
AZ-AR1 Elegance Citra	BioGeneX	HK546-XAK	抗原修复缓冲液
100% 乙醇（200 proof）	Pharmco	111000200	用于脱蜡
EZ – Retriever IR	BioGeneX	MW016-IR	用于FFPE组织切片的抗原修复系统
HybEZ II 杂交系统	ACD Biotechne	321710	系统组成：HybEZ烤箱（货号 321710/321720）、湿度控制托盘（货号 310012）、HybEZ加湿纸（2张，货号 310025）、EZ-Batch洗涤托盘（货号 321717）、EZ-Batch切片架（货号 321716）
ImmEdge 疏水屏障PAP笔	VectorLabs	H-4000	疏水屏障笔
Ir嵌入剂溶液	Thermo Fisher Scientific	NC1038184	用于识别有核细胞
KERATIN 8/18	CST	4546BF	克隆号：C51
金属寡核苷酸	多种	多种	金属标签从T1到T12不等，根据需要选择
无核酸酶水（NFW）	Corning	46-000-CM	用于清洁和准备所有设备，必要时作为稀释剂使用
RNAscope蛋白酶Plus	ACD Biotechne	322331	用于通透样本的细胞膜
RNAscope EZ-Batch切片架	ACD Biotechne	310017	设计用于高效手动批量处理最多20张切片
RNAscope HiPlex12试剂盒 v2	ACD Biotechne	324409	RNAScope用试剂
RNAscope HiPlex探针 - 靶标探针	ACD Biotechne	各种	根据需要选择T1至T12范围内的探针
RNaseZap RNase去污染溶液	Thermo Fisher Scientific	AM9782	一种可破坏RNase的表面去污染溶液
染色架显微镜切片篮式支架 24位 耐化学塑料	Optimal Scientific	3028	用于对多个切片进行染色
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	AAJ20605AP	用于各步骤间的间歇性洗涤
Ultravision 蛋白封闭液	Thermo Fisher Scientific	TA125PBQ	封闭缓冲液