本方案描述了一种串联免疫荧光杂交检测法，利用甲醛固定石蜡包埋组织同时检测并定量 microRNA 和多重蛋白质。
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摘要
摘要
在使用传统的基于探针的原位杂交（in situ hybridization, ISH）成像检测方法时，由于微小RNA（miRNA）的长度仅为19至25个核苷酸，难以对其进行有效捕获。然而，miRNA作为关键的表观遗传调控因子，在正常生理过程及多种病理状态下均发挥重要作用，因此了解miRNA在时空上的分布行为，对于揭示其在细胞及亚细胞水平上的功能具有重要意义。这迫切需要建立有效的检测与可视化技术。为此，我们开发了锁核酸原位杂交介导的微小RNA扩增与识别技术（MicroRNA Amplification and Recognition through Locked-nucleic-acid in situ hybridizatioN, MARLIN），该方法通过多重免疫荧光染色并结合靶向miRNA的锁核酸（locked nucleic acid, LNA）探针进行优化。该技术可实现miRNA与多重蛋白质表达的联合定量，从而在肿瘤微环境（TME）中以高灵敏度和高重复性对细胞内和细胞外的miRNA进行定量分析。miRNA检测与蛋白质捕获分析的联合应用，还可全面揭示TME中细胞的功能状态及其调控机制。
引言
microRNA
尽管 microRNA（miRNA）非常微小，长度仅在19-25个核苷酸之间，但这些单链RNA分子是基因表达的重要调控因子，可通过序列特异性的相互作用在转录后水平调控信使RNA（mRNA）1。本质上，miRNA作为负向调控因子，通过与靶标mRNA结合，根据互补程度的不同，抑制其翻译或促进其通过mRNA切割而降解，最终导致靶基因的蛋白质产量下降。虽然miRNA基本属于非编码RNA，但约40%的miRNA仍位于蛋白编码基因的内含子或外显子中2。miRNA的功能涉及多个关键生物学过程，如细胞增殖、血管生成、细胞凋亡等。值得注意的是，miRNA的异常调控已被证实与肿瘤发生相关，特定miRNA的异常表达以及miRNA介导的基因调控已在多种癌症类型中被发现与癌变过程相关3。
自发现以来，miRNA 因其组织特异性表达和调控功能而在多种疾病中得到广泛研究，其表达失调与包括神经退行性疾病、自身免疫性疾病以及多种癌症在内的许多疾病相关4,5,6。miRNA 的表达模式可与癌症类型、分期及临床变量相关联，使....
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方案
本方案采用来自高级别浆液性卵巢癌（HGSC）患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）人卵巢肿瘤组织切片。这些样本取自既往未经治疗、接受初次肿瘤细胞减灭术的卵巢癌患者。所有样本及临床数据均来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心妇科肿瘤与生殖医学系的卵巢癌样本库，采集过程遵循经机构审查委员会（IRB）批准的研究方案。患者书面知情同意由前台工作人员获取，研究严格遵循公认的伦理准则进行。
1. 组织制备
- 将所有FFPE样本在60 °C下烘烤过夜，并使用无RNA酶的水清洁每一件设备和工具。确保切片厚度约为5 µm。
注意：本方案已针对卵巢肿瘤进行优化，但经过进一步测试后也可能适用于其他组织类型。 - 使用二甲苯进行三轮脱蜡，每轮5分钟；再进行十轮再水化，每轮3分钟（100%乙醇（EtOH）2次，95%乙醇2次，70%乙醇2次，50%乙醇2次，30%乙醇2次）。用1×Tris缓冲盐水（TBS）洗涤1次，每次2分钟。
注意：此脱蜡步骤虽推荐使用，但为可选步骤，具体取决于组织类型。 - 脱蜡和再水化后，加入3%过氧化氢（H2O2）溶液处理10分钟。用1×TBS洗涤2分钟，重复2次。然后加入3.7%多聚甲醛（PFA）溶液处理10分钟。再用1×TBS洗涤2分钟，重复2次。
注意：此步骤为可选步骤，仅建议用于脂肪组织或易脱落的样本....
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结果
在测试本方案时，为确保准确性和可比性，必须使用同一代表性样本的两个连续切片。本实验采用高级别卵巢癌（HGSC）样本进行结果比较。设置一个仅进行miRNA染色的对照切片（图2A-B）和一个同时进行蛋白和miRNA染色的实验切片（图2C-J）。
对照切片和实验切片均显示出稳定的miRNA（miR-181c-3p）表达，其中肿瘤细胞中的表达水平较高（图2A-D）。两个切片之间的miRNA信号损失极小，表明本实验中用于组织的蛋白染色方法对样本无明显损伤或破坏作用。这正向说明了本方案所用染色方法的完整性和可靠性。如图1C
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讨论
尽管miRNA的重要性已被认识和理解，但目前对正常发育和疾病状态的观察仍受限于使用常规方法研究miRNA的困难。由于原位（in situ）方法的缺乏，研究人员开发了MARLIN技术（miRNA荧光原位杂交检测法）。鉴于miRNA具有高度同源性和较短的序列长度，要可视化其在转录后调控中的定位和作用仍具挑战性。本实验方案采用锁核酸探针（Locked Nucleic Acid Probes, LNA）。LNA是一类经过修饰的RNA碱基，其核糖通过一个亚甲基桥连接氧原子与碳原子，从而被“锁定”。这一额外的桥接结构限制了环状结构通常具有的柔性，使分子构象固定为刚性状态19。LNA使得探针更短，并具有更高的淬灭效率，有助于降低背景信号，提升检测的灵敏度和特异性。
关键步骤
本实验方案设计的主要关注点在于探针的特异性和灵敏度。为解决这一问题，本方案采用了酪胺信号放大技术（Tyramide Signal Amplification, TSA），该技术可将检测灵敏度提高达100倍，同时减少.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们谨向以下人员致以感谢：Chi Lam Au Yeung 和 Manjunath Nimmakayalu，他们在该检测方法开发期间曾参与 Basant 的论文答辩委员会；Samuel Mok，他负责切片并提供了所用样本；以及 Johan Doré 和 Dan Winkowski，他们在数据分析及使用 Visiopharm 软件过程中提供了大量协助。本研究部分由卵巢癌研究联盟（OCRA 811621 和 891490）、Sie 基金会以及 Stephanie C. Stelter 捐赠基金资助。本研究是与流式细胞术和细胞成像核心设施合作完成的，该设施部分由美国国立卫生研究院通过 M. D. Anderson 癌症中心支持拨款 P30 CA016672 及 Jared Burks 的国家癌症研究所研究专家项目 1 R50 CA243707-01A1 提供支持。Au Yeung 博士的 ORCA 基金 89165 资助了 microRNA 扩增所需试剂的采购。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10倍浓度TRIS缓冲盐水（TBS），pH 7.6 | 赛默飞世尔科技 | J62662 K7 | 步骤间间歇性洗涤 |
| 1× Opal 抗体稀释液/封闭液 | Akoya Biosciences | ARD1001EA | 蛋白封闭液 |
| 1x Plus 自动化扩增稀释液 | Akoya Biosciences | FP1609 | 用于稀释 Opal 氟染料 |
| 20倍浓缩液 盐水柠檬酸钠（SSC）缓冲液 | Sigma-Aldrich | S6639-1L | 探针杂交后的miRNA洗涤步骤 |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | 赛默飞世尔科技 / 英维特罗根 | EN62248 / 62248 | 用于细胞核染色 |
| ACD HybEZ II 杂交系统 | ACD Biotechne | 321711 | 用于 miRNAscope 实验流程中温度控制的烘箱 |
| 抗CD8（D8A8Y），兔单克隆抗体 | 细胞信号传导技术 | 85336S | 用于优化本实验方案的一抗示例 |
| 抗地高辛（小鼠）HRP 结合物 | Revvity Health Sciences Inc | NEF832001EA | 用于miRNA检测的二抗试剂 |
| 抗 EpCAM（E6V8Y），兔单克隆抗体 | 细胞信号传导技术 | 93790 | 用于优化本实验方案的初级抗体示例 |
| 封闭剂粉末 | Akoya Biosciences | FP1012 | miRNA 封闭液 |
| 100% 乙醇（200标准） | Pharmco | 111000200 | 用于脱蜡 |
| EZ-AR1 缓冲液 | BioGeneX | HK521-XAK | 用于福尔马林固定石蜡包埋组织切片在蛋白步骤中的抗原修复 |
| EZ-AR1 优雅缓冲液 | BioGeneX | HK546-XAK | 用于在miRNA探针步骤中对FFPE组织切片进行抗原修复 |
| EZ-Retriever IR 系统 | BioGeneX | MW015-IR | 用于福尔马林固定石蜡包埋组织切片抗原修复的微波炉 |
| 30% 过氧化氢溶液 | Sigma-Aldrich | HX0640-5 | 用于组织制备，有助于阻断内源性过氧化物酶活性，并产生高显色产物 |
| miR-181c-3p miRNA 探针 | Qiagen | 339112 | 用于优化本实验方案的miRNA探针示例 |
| miRCURY LNA miRNA ISH 缓冲液套装（FFPE） | Qiagen | 339450 | 用于稀释miRNA探针 |
| Opal 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 用于识别一抗的荧光染料 |
| Opal 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 用于鉴定一抗的荧光染料 |
| Opal 抗小鼠 + 兔 HRP | Akoya Biosciences | ARH1001EA | 用作检测剂的二抗 |
| Pierce 16% 甲醛（w/v），无甲醇 | 赛默飞世尔科技 | 28908 | 用于组织制备的3.7% PFA的配制 |
| ProLong Diamond 抗荧光淬灭剂 | 赛默飞世尔科技 | P36970 | 封片剂 |
| RNAscope蛋白酶Plus | ACD Biotechne | 322331 | 对组织切片进行通透处理 通过部分消化蛋白质 &以及暴露目标miRNA分子 |
| 无RNA酶水 | 康宁 | 46-000-CM | 清洁和准备所有设备，并在需要时用作稀释剂 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-25ML | 配制 TBS-T |
| 酪胺信号放大增强液（Cyanine 3） | Akoya Biosciences | NEL744001KT | 用于鉴定miRNA的荧光染料 |
| U6 和随机 miRNA 探针 | Qiagen | 339459 | 可选对照探针 |
| 二甲苯 组织学级 | 赛默飞世尔科技 | UN1307 | 用于脱蜡 |
参考文献
- Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers. 14 (10), 2569(2022).
- Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. Microrna in cancer: The involvem....
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