本方案描述了一种串联免疫荧光杂交检测法，利用甲醛固定石蜡包埋组织同时检测并定量 microRNA 和多重蛋白质。
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摘要
摘要
在使用传统的基于探针的原位杂交（in situ hybridization, ISH）成像检测方法时，由于微小RNA（miRNA）的长度仅为19至25个核苷酸，难以对其进行有效捕获。然而，miRNA作为关键的表观遗传调控因子，在正常生理过程及多种病理状态下均发挥重要作用，因此了解miRNA在时空上的分布行为，对于揭示其在细胞及亚细胞水平上的功能具有重要意义。这迫切需要建立有效的检测与可视化技术。为此，我们开发了锁核酸原位杂交介导的微小RNA扩增与识别技术（MicroRNA Amplification and Recognition through Locked-nucleic-acid in situ hybridizatioN, MARLIN），该方法通过多重免疫荧光染色并结合靶向miRNA的锁核酸（locked nucleic acid, LNA）探针进行优化。该技术可实现miRNA与多重蛋白质表达的联合定量，从而在肿瘤微环境（TME）中以高灵敏度和高重复性对细胞内和细胞外的miRNA进行定量分析。miRNA检测与蛋白质捕获分析的联合应用，还可全面揭示TME中细胞的功能状态及其调控机制。
引言
microRNA
尽管 microRNA（miRNA）非常微小，长度仅在19-25个核苷酸之间，但这些单链RNA分子是基因表达的重要调控因子，可通过序列特异性的相互作用在转录后水平调控信使RNA（mRNA）1。本质上，miRNA作为负向调控因子，通过与靶标mRNA结合，根据互补程度的不同，抑制其翻译或促进其通过mRNA切割而降解，最终导致靶基因的蛋白质产量下降。虽然miRNA基本属于非编码RNA，但约40%的miRNA仍位于蛋白编码基因的内含子或外显子中2。miRNA的功能涉及多个关键生物学过程，如细胞增殖、血管生成、细胞凋亡等。值得注意的是，miRNA的异常调控已被证实与肿瘤发生相关，特定miRNA的异常表达以及miRNA介导的基因调控已在多种癌症类型中被发现与癌变过程相关3。
自发现以来，miRNA 因其组织特异性表达和调控功能而在多种疾病中得到广泛研究，其表达失调与包括神经退行性疾病、自身免疫性疾病以及多种癌症在内的许多疾病相关4,5,6。miRNA 的表达模式可与癌症类型、分期及临床变量相关联，使得 miRNA 谱分析成为癌症诊断和预后评估的重要工具4,5,6,7。随着高通量测序技术的进步，新 miRNA 的发现速度显著加快，进一步加深了人们对 miRNA 在多种生物学过程中作用的理解8。2024 年诺贝尔生理学或医学奖授予 Victor Ambros 和 Gary Ruvkun，以表彰他们发现 miRNA 在转录后调控中的功能，这一奖项进一步凸显了 miRNA 的重要意义9。
作为疾病诊断和预后的宝贵生物标志物，miRNA的治疗潜力已被广泛探索，并推动了靶向miRNA药物的开发。miRNA在癌症治疗中的治疗潜力在于其能够协调调控多个基因模块，从而可能恢复正常的细胞功能10。此前，基于miRNA的抗癌疗法已被开发为单药治疗，或与现有的靶向疗法联合使用，以增强治疗反应并提高治愈率11。miRNA的动态谱使其成为创新癌症治疗策略的重要资源。在治疗耐药性的背景下，靶向miRNA已显示出减少癌症复发及对传统治疗产生耐药性的潜力，可能通过靶向癌细胞来改善患者生存率12。通过探索miRNA在调节肿瘤微环境（TME）中多种细胞类型活性方面的作用，有望发现独特且具有临床意义的癌症治疗方法。
检测miRNA的现有方法
目前，检测miRNA最常用的方法依赖于提取RNA后进行定量实时PCR（q-RT-PCR）或下一代测序（NGS），但这些方法会丢失空间信息。一些公司可提供TaqMan microRNA检测试剂盒，该试剂盒采用靶标特异性的茎环引物进行cDNA合成，或使用基于SYBR Green染料并结合通用cDNA合成的化学方法。这些检测方法具有较高的灵敏度和特异性，可在多种q-RT-PCR仪器上运行。然而，TaqMan检测试剂盒无法实现绝对定量，可能导致假阳性结果及实验结果的变异性13。此外，尽管其灵敏度较高，但由于需要复杂的样品前处理，且样品中其他组分可能产生干扰，这些检测方法在不同类型样本中的应用受到一定限制。
下一代测序（NGS）：miRNA-seq 在生物液体全miRNome的差异表达分析中日益流行。NGS 技术（如 miRNA-seq）的优势在于能够对 miRNA 的全基因组表达进行大规模并行分析，从而实现对单个 miRNA 的定量、序列变异的识别以及新 miRNA 的发现14。然而，基于测序的方法（如 Illumina TruSeq Small RNA Sample Preparation Kit）存在显著缺点，即会引入定量偏差，这在很大程度上影响了差异表达分析的准确性，主要原因在于 miRNA 的同源性及其较短的读长14。不仅如此，等位 miRNA（isomiR，即在序列或长度上与经典 miRNA 序列不同的变体）的存在以及技术性假象可能使数据分析变得复杂，导致生物标志物检测中出现误检和混杂因素14。此外，用于 miRNA-seq 数据分析的不同工具（如 sRNAbench 和 miRDeep2）可能产生不同的结果，从而影响新 miRNA 发现的一致性和可靠性15,16。即便是微阵列技术，在大多数情况下也可能不够充分。尽管该技术可为检测 miRNA 或基因表达水平提供强大且高通量的平台，适用于全基因组研究，但其仍受限于先前已鉴定 miRNA 的数量，并且无法直接验证 miRNA-靶标相互作用，从而限制了其在功能研究中的应用17。
在比较所有这些可用选项时，最重要的因素是缺乏空间背景信息。它们无法提供与组织形态或细胞内时空分布相关的任何背景信息。对miRNA的时空行为进行可视化，对于揭示其在细胞和亚细胞水平上的功能至关重要。目前已有miRNAscope 原位 杂交（ISH）检测方法，通常采用显色检测技术。尽管这些检测方法能够实现单细胞分辨率下的miRNA可视化，但结果质量欠佳，难以区分miRNA表达信号与样本背景。通常，许多此类方法产生的检测结果质量较低，可靠性差，且通常需要人工进行定量分析。
因此，我们开发了通过锁核酸原位杂交实现微小RNA扩增与识别的技术（MARLIN），该技术结合多重免疫荧光染色（Opal蛋白染色）与靶向miRNA的锁核酸（LNA）探针，适用于甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织样本。我们通过采用酪胺信号放大系统（TSA）实现了这一方法，该系统由抗地高辛（DIG）辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗体激活。其中HRP作为TSA的催化剂，而抗DIG抗体则与LNA探针结合。该检测方法特别适用于研究miR在转录后蛋白修饰中的关键作用，同时也有潜力用于其他RNA的联合分析。此外，由于目前尚无 commercially available 的可同时定量miRNA与蛋白表达的检测手段，MARLIN提供了一种有效途径以理解 原位 FFPE 样本中 miR 与蛋白质之间的关系。
使用MARLIN对miR-181c-3p进行定量的初步结果表明，可在人卵巢FFPE组织的天然空间背景下实现miRNA与蛋白质的并行分析。除本示例外，基于MARLIN的组成，理论上还可利用商品化的荧光多重染料（如Alexa Fluor）或其他小分子染料，将蛋白质检测扩展至最多四种18。
此外，由于该方法基于标准组织学方法的改进，因此在选择适当的探针和抗体的前提下，应可适用于其他哺乳动物的FFPE组织。该方法可保留组织的空间结构，并实现对细胞和亚细胞水平miRNA与蛋白质共定位的定量分析。该技术通过绘制miRNA-蛋白质共表达模式及其空间分布图谱，填补了空间生物学领域的一项关键空白，且这些信息可直接置于天然组织结构的背景下进行解读。本文展示了MARLIN方法，并在图1中提供了详细的图示概览。尽管本方案针对miR-181c-3p进行了优化，但只要探针设计得当，也可用于研究其他miRNA。该方法的关键参数包括：组织质量评估以及探针浓度的优化。建议使用DV200指标评估组织切片的RNA完整性，具体操作为取两片10 µm厚的组织切片，采用可保留所有RNA片段大小的提取方法获取RNA。DV200评分高于50或更优的样本，其RNA质量更佳，同时需对实验方案中的试剂浓度进行系统性测试。
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方案
本方案采用来自高级别浆液性卵巢癌（HGSC）患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）人卵巢肿瘤组织切片。这些样本取自既往未经治疗、接受初次肿瘤细胞减灭术的卵巢癌患者。所有样本及临床数据均来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心妇科肿瘤与生殖医学系的卵巢癌样本库，采集过程遵循经机构审查委员会（IRB）批准的研究方案。患者书面知情同意由前台工作人员获取，研究严格遵循公认的伦理准则进行。
1. 组织制备
- 将所有FFPE样本在60 °C下烘烤过夜，并使用无RNA酶的水清洁每一件设备和工具。确保切片厚度约为5 µm。
注意：本方案已针对卵巢肿瘤进行优化，但经过进一步测试后也可能适用于其他组织类型。 - 使用二甲苯进行三轮脱蜡，每轮5分钟；再进行十轮再水化，每轮3分钟（100%乙醇（EtOH）2次，95%乙醇2次，70%乙醇2次，50%乙醇2次，30%乙醇2次）。用1×Tris缓冲盐水（TBS）洗涤1次，每次2分钟。
注意：此脱蜡步骤虽推荐使用，但为可选步骤，具体取决于组织类型。 - 脱蜡和再水化后，加入3%过氧化氢（H2O2）溶液处理10分钟。用1×TBS洗涤2分钟，重复2次。然后加入3.7%多聚甲醛（PFA）溶液处理10分钟。再用1×TBS洗涤2分钟，重复2次。
注意：此步骤为可选步骤，仅建议用于脂肪组织或易脱落的样本。 - 进行第一轮抗原修复。本方案使用EZ-Retriever IR系统。按照系统说明书，将样本浸入新鲜的EZ-AR1缓冲液中，在95 °C下微波加热15分钟。随后静置冷却20分钟。
- 用1×TBS洗涤2分钟，然后用1×TBS-T（含0.1% Tween的1×TBS）洗涤2分钟，重复2次。
2. 蛋白质应用
- 使用疏水性屏障笔在每张组织切片周围画出屏障。
- 加入1×抗体封闭液（足以覆盖整个组织区域），在室温下的湿盒中孵育30分钟（环境湿度，未控制湿度）。
- 随后，用相同的封闭液稀释第一种一抗，加入足量以覆盖整个组织区域，并在湿盒中室温孵育1小时。
注意：在本方案开发过程中，Anti-CD8 的使用稀释比例为 1:75。 - 用1×TBS-T洗涤2分钟，重复3次。然后加入Anti-Ms + Rb HRP，样品在湿盒中室温孵育10分钟（环境湿度，未控制湿度）。
- 用1×TBS-T洗涤2分钟，重复3次。将第一种荧光染料用扩增稀释液按1:100稀释，于湿盒中室温孵育10分钟。
注意：在本方案开发过程中，使用了发射波长为690 nm的荧光染料。从这一步开始，建议在加入第一轮荧光染料后，后续操作过程中尽量减少光照。 - 用1×TBS-T洗涤2分钟，重复3次。开始第二轮抗体染色，通过微波炉再次进行抗原修复，将样品重新浸入新鲜的EZ-AR1缓冲液中，在95 °C下处理15分钟，然后冷却20分钟。
- 用1×TBS洗涤2分钟，再用1×TBS-T洗涤2分钟，重复2次。
- 再次加入1×抗体封闭液，在湿盒中室温孵育30分钟（环境湿度，未控制湿度）。
- 用相同的封闭液稀释第二种一抗，加入足量以覆盖整个组织区域，并在湿盒中4 °C孵育过夜，至少16小时。
注意：在本方案开发过程中，Anti-EpCAM 的使用稀释比例为 1:200。 - 次日开始，用1×TBS-T洗涤2分钟，重复3次。然后加入Anti-Ms + Rb HRP，样品在湿盒中室温孵育10分钟（环境湿度，未控制湿度）。
- 用1×TBS-T洗涤2分钟，重复3次。将第二种荧光染料用扩增稀释液按1:100稀释，于湿盒中室温孵育10分钟。
注意：在本方案开发过程中，使用了发射波长为620 nm的荧光染料。
3. 探针应用
- 用 1x TBS-T 洗涤 2 分钟，重复 3 次。
- 将 EZ-AR1 Elegance 置于微波炉中，于 107 °C 开始第三次也是最后一次抗原修复，持续 15 分钟。静置冷却 20 分钟。用 1x TBS 洗涤 3 分钟。
- 加入 RNAscope Protease Plus（用量需覆盖整个组织区域），在 40 °C 下孵育 30 分钟（使用烘箱）。用 1x TBS 洗涤 5 分钟，重复 2 次。
- 将 miRNA LNA 探针在 90 °C 下变性 4 分钟，进行探针配制。随后立即使用 miRNA-ISH 缓冲液稀释探针。涡旋混匀并离心探针溶液。
注意：在本实验方案开发过程中，miR-181c-3p 靶向探针的稀释比例为 1:250。 - 加入探针（用量需覆盖整个组织区域），放回 60 °C 烘箱中孵育 1 小时。用 5x SSC（柠檬酸钠盐缓冲液）洗涤 5 分钟。
- 在 60 °C 预热的 SSC 缓冲液中进行五轮严格洗涤，每轮 5 分钟，顺序和稀释比例如下：一轮 5x SSC，两轮 1x SSC，两轮 0.2x SSC。
- 在室温下用 0.2x SSC 洗涤 5 分钟。在湿盒中用封闭缓冲液于室温孵育 30 分钟。封闭缓冲液由 1x TBS 与 0.5% 封闭试剂粉末混合而成，使用前务必涡旋混匀并离心封闭液。
- 加入抗地高辛（小鼠）HRP 偶联物（本实验样品使用 1:500 稀释度），在湿盒中室温孵育 30 分钟。
- 用 1x TBS-T 洗涤 5 分钟，重复 3 次。在湿盒中室温（环境湿度未控制）下，加入推荐稀释比例为 1:50 的 Tyramide Signal Amplification Plus Cyanine 3（TSA+Cy3）荧光染料，孵育 10 分钟。使用前务必涡旋混匀并离心 TSA+Cy3 溶液。
- 用 1x TBS-T 洗涤 5 分钟，重复 3 次。
4. 细胞核染色与封片
- 在湿润室中（环境湿度，未控制湿度），于室温下加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）工作液（用量需覆盖整个组织区域），孵育5分钟。
注意：本实验方案中使用1:1000稀释比例，将DAPI储存液用TBS稀释配制工作液。 - 用1× TBS-T缓冲液洗涤5分钟，重复3次。洗涤完成后，使用封片剂封片，并将载玻片在室温下干燥10分钟。载玻片应于4 °C避光保存，在成像前保存24–72小时，最长可保存三个月。
5. 成像与分析
- 成像时，建议使用载玻片扫描显微镜，放大倍数为 40 倍。
- 进行后续定量分析，利用 DAPI 和蛋白共染色对细胞进行分割和表型鉴定，以计数点状信号。
注意：在本实验方案中，我们使用 Phenoimager HT 进行成像。使用适合所用荧光染料的滤光片，在 40 倍放大倍数下获取整张载玻片的扫描图像，然后将多重图像导出为 OME-TIFF 文件。将扫描图像上传至 Visiopharm 图像分析软件进行定量分析。
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结果
在测试本方案时，为确保准确性和可比性，必须使用同一代表性样本的两个连续切片。本实验采用高级别卵巢癌（HGSC）样本进行结果比较。设置一个仅进行miRNA染色的对照切片（图2A-B）和一个同时进行蛋白和miRNA染色的实验切片（图2C-J）。
对照切片和实验切片均显示出稳定的miRNA（miR-181c-3p）表达，其中肿瘤细胞中的表达水平较高（图2A-D）。两个切片之间的miRNA信号损失极小，表明本实验中用于组织的蛋白染色方法对样本无明显损伤或破坏作用。这正向说明了本方案所用染色方法的完整性和可靠性。如图1C
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讨论
尽管miRNA的重要性已被认识和理解，但目前对正常发育和疾病状态的观察仍受限于使用常规方法研究miRNA的困难。由于原位（in situ）方法的缺乏，研究人员开发了MARLIN技术（miRNA荧光原位杂交检测法）。鉴于miRNA具有高度同源性和较短的序列长度，要可视化其在转录后调控中的定位和作用仍具挑战性。本实验方案采用锁核酸探针（Locked Nucleic Acid Probes, LNA）。LNA是一类经过修饰的RNA碱基，其核糖通过一个亚甲基桥连接氧原子与碳原子，从而被“锁定”。这一额外的桥接结构限制了环状结构通常具有的柔性，使分子构象固定为刚性状态19。LNA使得探针更短，并具有更高的淬灭效率，有助于降低背景信号，提升检测的灵敏度和特异性。
关键步骤
本实验方案设计的主要关注点在于探针的特异性和灵敏度。为解决这一问题，本方案采用了酪胺信号放大技术（Tyramide Signal Amplification, TSA），该技术可将检测灵敏度提高达100倍，同时减少...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们谨向以下人员致以感谢：Chi Lam Au Yeung 和 Manjunath Nimmakayalu，他们在该检测方法开发期间曾参与 Basant 的论文答辩委员会；Samuel Mok，他负责切片并提供了所用样本；以及 Johan Doré 和 Dan Winkowski，他们在数据分析及使用 Visiopharm 软件过程中提供了大量协助。本研究部分由卵巢癌研究联盟（OCRA 811621 和 891490）、Sie 基金会以及 Stephanie C. Stelter 捐赠基金资助。本研究是与流式细胞术和细胞成像核心设施合作完成的，该设施部分由美国国立卫生研究院通过 M. D. Anderson 癌症中心支持拨款 P30 CA016672 及 Jared Burks 的国家癌症研究所研究专家项目 1 R50 CA243707-01A1 提供支持。Au Yeung 博士的 ORCA 基金 89165 资助了 microRNA 扩增所需试剂的采购。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10倍浓度TRIS缓冲盐水（TBS），pH 7.6 | 赛默飞世尔科技 | J62662 K7 | 步骤间间歇性洗涤 |
| 1× Opal 抗体稀释液/封闭液 | Akoya Biosciences | ARD1001EA | 蛋白封闭液 |
| 1x Plus 自动化扩增稀释液 | Akoya Biosciences | FP1609 | 用于稀释 Opal 氟染料 |
| 20倍浓缩液 盐水柠檬酸钠（SSC）缓冲液 | Sigma-Aldrich | S6639-1L | 探针杂交后的miRNA洗涤步骤 |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | 赛默飞世尔科技 / 英维特罗根 | EN62248 / 62248 | 用于细胞核染色 |
| ACD HybEZ II 杂交系统 | ACD Biotechne | 321711 | 用于 miRNAscope 实验流程中温度控制的烘箱 |
| 抗CD8（D8A8Y），兔单克隆抗体 | 细胞信号传导技术 | 85336S | 用于优化本实验方案的一抗示例 |
| 抗地高辛（小鼠）HRP 结合物 | Revvity Health Sciences Inc | NEF832001EA | 用于miRNA检测的二抗试剂 |
| 抗 EpCAM（E6V8Y），兔单克隆抗体 | 细胞信号传导技术 | 93790 | 用于优化本实验方案的初级抗体示例 |
| 封闭剂粉末 | Akoya Biosciences | FP1012 | miRNA 封闭液 |
| 100% 乙醇（200标准） | Pharmco | 111000200 | 用于脱蜡 |
| EZ-AR1 缓冲液 | BioGeneX | HK521-XAK | 用于福尔马林固定石蜡包埋组织切片在蛋白步骤中的抗原修复 |
| EZ-AR1 优雅缓冲液 | BioGeneX | HK546-XAK | 用于在miRNA探针步骤中对FFPE组织切片进行抗原修复 |
| EZ-Retriever IR 系统 | BioGeneX | MW015-IR | 用于福尔马林固定石蜡包埋组织切片抗原修复的微波炉 |
| 30% 过氧化氢溶液 | Sigma-Aldrich | HX0640-5 | 用于组织制备，有助于阻断内源性过氧化物酶活性，并产生高显色产物 |
| miR-181c-3p miRNA 探针 | Qiagen | 339112 | 用于优化本实验方案的miRNA探针示例 |
| miRCURY LNA miRNA ISH 缓冲液套装（FFPE） | Qiagen | 339450 | 用于稀释miRNA探针 |
| Opal 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 用于识别一抗的荧光染料 |
| Opal 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 用于鉴定一抗的荧光染料 |
| Opal 抗小鼠 + 兔 HRP | Akoya Biosciences | ARH1001EA | 用作检测剂的二抗 |
| Pierce 16% 甲醛（w/v），无甲醇 | 赛默飞世尔科技 | 28908 | 用于组织制备的3.7% PFA的配制 |
| ProLong Diamond 抗荧光淬灭剂 | 赛默飞世尔科技 | P36970 | 封片剂 |
| RNAscope蛋白酶Plus | ACD Biotechne | 322331 | 对组织切片进行通透处理 通过部分消化蛋白质 &以及暴露目标miRNA分子 |
| 无RNA酶水 | 康宁 | 46-000-CM | 清洁和准备所有设备，并在需要时用作稀释剂 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-25ML | 配制 TBS-T |
| 酪胺信号放大增强液（Cyanine 3） | Akoya Biosciences | NEL744001KT | 用于鉴定miRNA的荧光染料 |
| U6 和随机 miRNA 探针 | Qiagen | 339459 | 可选对照探针 |
| 二甲苯 组织学级 | 赛默飞世尔科技 | UN1307 | 用于脱蜡 |
参考文献
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