使用质谱成像顺序检测福尔马林固定、石蜡包埋样品中的生物分子

Summary

在这里，我们提出了一种质谱成像方案，用于在福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品中检测序贯代谢物、 N-连接聚糖和胰蛋白酶肽。

Abstract

组织是复杂的细胞环境，由大量细胞类型和生物分子组成，它们相互相互作用以执行器官的功能。传统上，代谢物、聚糖和蛋白质等生物分子的分析技术涉及组织的均质化，破坏了所有空间信息。这些传统方法阻碍了对复杂的细胞内和细胞外分子相互作用的完全理解。另一方面，质谱成像 （MSI） 不仅可以保留组织中生物分子的空间信息，还可以通过以接近单细胞分辨率的顺序分析从同一组织切片中检测多类分析物。这使我们能够更全面地了解不同类别生物分子之间的分子相互作用。此处介绍的方案概述了以 20 μm 分辨率从同一组织切片依次对代谢物、 N 连接聚糖和胰蛋白酶肽进行质谱成像的步骤。认真考虑分析物类别成像的顺序，并仔细处理切片以确保完整性，可以从同一切片中收集多个高质量图像。这些数据随后可以与从连续切片收集的其他空间组学数据（转录组学、免疫组织化学等）集成，其中可以在这些相邻切片中分析相同的细胞。

Introduction

质谱成像 （MSI） 是一种强大的技术，可以检测和可视化薄组织切片中的数百到数千个生物分子，而无需先验了解组织中存在的确切分子，使其成为生物标志物发现的绝佳工具¹。虽然不同的实验室使用多种类型的 MSI，包括解吸电喷雾电离 （DESI）^2,3、红外基质辅助激光解吸电喷雾电离 （IR-MALDESI）⁴ 和二次离子质谱 （SIMS）⁵，但基质辅助激光解吸/电离 （MALDI） 仍然是最常用和最通用的。MSI可以通过定制样品制备来检测大多数类别的生物分子，包括组织的洗涤/预处理，酶消化^{和所使用的}基质/溶剂^6,7。MALDI MSI已用于检测代谢物、脂质、聚糖、蛋白质和蛋白水解肽。

MSI 研究已用于各种临床和临床前研究，以更好地了解疾病机制 ^8,9，改善癌症分级和分期^10,11，预测治疗结果¹²，改进诊断¹³，并确定分子肿瘤边缘¹⁴ 等。这些研究中的大多数仅集中在单一类分析物的检测上。然而，分析同一样品中的多类生物分子通常很有趣。传统上，这是通过连续切片组织进行的。但最近，已经显示了顺序分析来自同一组织切片的多个分析物类别的例子。例如，Yagnik等人已经证明了冷冻组织的脂质成像，然后从同一部分进行MALDI免疫组织化学以进行细胞类型分类¹⁵。Clift等人已经显示了PNGaseF，胶原酶和胰蛋白酶的顺序应用于福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）组织切片，分别用于N连接聚糖，细胞外基质蛋白和一般蛋白质的成像，¹⁶。Escobar等人展示了来自冷冻组织同一部分的N-连接聚糖、O-GlcNAc和胰蛋白酶肽的序贯分析¹⁷。 这些类型的实验是通过仔细的实验计划来完成的，首先分析最容易丢失的分析物，然后分析那些在组织中更稳定的分析物。在许多情况下，用于去除不需要的分子类别的洗涤有助于增强其他类别的分子^6，这一特性可以利用，其中每次去除先前应用的基质的洗涤也有助于增强下一类分析物的信号要成像。

最近，我们发表了一个工作流程，用于对来自FFPE卵巢癌组织同一部分的代谢物，N-连接聚糖和胰蛋白酶肽进行序贯分析¹⁸。在这里，我们介绍了分析来自同一组织切片的这三类生物分子的详细工作流程;该协议的概述详见图 1。据我们所知，这是第一个详细描述FFPE组织顺序成像工作流程的协议。简而言之，组织切片用二甲苯脱蜡，然后涂覆1,5-二氨基萘基质（10mg / mL，50%乙腈）以进行负离子模式代谢物成像。然后去除基质，对切片进行再水化，并反对抗原，然后用PNGase F（0.1μg/μL碳酸氢铵溶液）喷洒以原位释放N-连接聚糖。孵育后，用α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）（10mg / mL在70%乙腈，0.1%三氟乙酸中）基质包被切片，并在正离子模式下成像。然后再次取出基质，重复再水化和抗原修复，用胰蛋白酶（0.075μg/μL碳酸氢铵溶液）喷洒切片并孵育，然后再次用CHCA（10mg/mL在70%乙腈，0.1%三氟乙酸中）基质包被，并以正离子模式成像。所有溶液都应在使用前立即新鲜，如果可能的话，实验应连续 3 天进行。如果遇到延误，切片应储存在干燥的-80°C冰箱中。

Protocol

该协议使用从先前未经治疗的高级别浆液性卵巢癌初次细胞减灭手术的患者中收集的福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织。所有临床数据均根据德克萨斯大学 MD 安德森分校机构审查委员会批准的方案从妇科肿瘤和生殖医学系的卵巢癌库获得。前台人员获得了患者的书面知情同意书，研究是按照公认的伦理准则进行的。

1. 代谢物成像样品制备

注意：该协议假设福尔马林固定，石蜡包埋组织（4μm厚）的切片已经安装在玻璃显微镜载玻片上，因为临床样本通常必须由组织技术人员在临床病理学核心内切片。由于此处介绍的工作是在参考的TOF仪器上进行的，因此正交TOF测量减轻了对MSI实验中传统上使用的导电载玻片的需求。使用标准显微镜载玻片也更有利于临床病理学实验室的标准工作流程，并能够使用载玻片上已有的档案组织。

1. 使用菱形划线器在幻灯片的四个角上做基准标记。
2. 通过浸入组织学级二甲苯中3分钟来脱蜡切片。
   注意：二甲苯有毒，应用于化学通风橱中。
3. 将切片浸入新鲜二甲苯中3分钟。
4. 让载玻片在室温下干燥。
5. 将幻灯片放入幻灯片适配器目标中。
6. 使用平板扫描仪以 4,800 dpi 分辨率获取载玻片的光学图像。
7. 通过将 15 mg 1,5-二氨基萘 （DAN） 溶解在 1.5 mL 50% 乙腈中来制备 MALDI 基质。超声处理直至完全溶解，~5 分钟。在加载到样品环之前过滤基质溶液。
   注意：DAN 是一种疑似致癌物，应与适当的个人防护装备一起使用。基质喷涂应在化学通风橱中进行。
8. 使用具有以下参数的机器人试剂喷雾器用 DAN 溶液喷洒载玻片： 轨道速度 - 1,200 mm/s;轨道间距 - 3 毫米;喷嘴温度 - 60 °C;喷嘴高度 - 40 毫米;流速 - 100 μL/min;传球 - 4;N ₂ 压力 - 10 psi;图案 - CC
9. 将 0.5 μL 悬浮在甲醇中的红磷涂抹在载玻片上的已知位置。

2. 代谢物成像数据收集

1. 将准备好的载玻片放入载玻片适配器 II 中，并加载到 timsTOF fleX MALDI QTOF 质谱仪中。
2. 在timsControl中加载适当的负 离子模式数据收集 方法，并关闭 tims。如果仪器尚未处于负离子模式，请在切换极性以进行平衡后至少等待 25 分钟，然后再使用以下代谢物仪器参数进行校准和数据收集： m/z 范围 - 50 - 600;激光扫描范围 - X 和 Y 均为 16.0 μm;所得场尺寸 - X 和 Y 均为 20.0 μm;激光射击 - 150;激光通量 - ~30%;漏斗 1 RF - 150.0 Vpp;漏斗 2 RF - 200.0 Vpp;多极射频 - 200.0 Vpp;碰撞能量 - 10.0 eV;碰撞射频 - 500.0 Vpp;传输时间 - 55.0 μs;预脉冲存储 - 5.0 μs （补充图 S1）。
3. 在“样品载体”选项卡上执行目标配置文件（单击“立即生成”按钮）和焦点调整（单击“立即调整”按钮）。如果需要，在激光片上调整 X 和 Y 的激光位置，以确保激光与十字准线完全对齐。
4. 通过从载玻片上的点上对至少五组激光射击相加来收集红磷光谱。
5. 通过单击校准选项卡上的校准按钮执行校准。去除任何强度非常低或 ppm 误差高的峰。
   注意：即使是磷簇（P2 和 P4）通常也会发出非常微弱的信号。在单击接受之前，校准分数应为 100%。如果没有，请清除总频谱并获取新的频谱。
6. 启动 flexImaging 软件。图像采集 GUI 将自动启动。
7. 在“选择映像运行”窗口中选择“设置新的映像运行”。
8. 在“选择工作流”窗口中选择“经典工作流”。
9. 在“ 数据存储 ”窗口中，为数据提供“ 映像运行名称 ”和“ 结果目录 ”。
   注意：文件名中不应使用空格。
10. 在采集设置窗口中，选择用户定义的测量区域，然后在栅格宽度框中输入 20。单击“浏览”以选择之前创建的 timsControl 方法。
11. 在 “示例图像” 窗口中，单击“ 浏览 ”以选择使用平板扫描仪采集的光学图像。
12. 在示 教样本 窗口中，在光学图像和载玻片之间执行三点对齐;然后，将样品载体移动到载玻片上的第一个蚀刻基准，并将 timsControl 中的十字准线与蚀刻中的独特特征对齐。放大图片（建议 100% 缩放），将 示例图像 设置为 设置示教点，然后单击光学图片中的相同位置。重复此过程 2 次，总共获得三个教学点。单击 下一步 以完成教学。
13. 单击“ 确定 ”退出 “新建映像运行向导”。
14. 通过单击软件中的 “定位样品载体 ”按钮检查示教的准确性。放大并单击图片中第四个（未使用的）基准点的明显特征;样品载体将在 timsControl 中移动到该位置。确认十字准线与所选要素对齐。如果它们没有排队，请清除 flexImaging 中的示教并重复示教过程以提高准确性。
15. 在软件中，选择 添加多边形测量区域工具 并勾勒出要成像的组织。每次单击鼠标都会创建一个锚点。按键盘上的退格键可逐个删除点。绘制区域后，双击鼠标以关闭多边形。
16. 通过在组织内的几个位置发射激光来检查信号。使用 “位置样品载体 ”按钮单击图片中的某个位置，如步骤 2.14 所示，以检查示教。光谱将以 m/z 157 和 313 附近的基质峰为主;放大 154 和 250-300 以下的 m/z 区域，分别显示许多小分子代谢物和脂肪酸峰。根据需要调整激光通量以获得最佳信号。
17. 保存 timsControl 方法。
18. 通过单击软件中的“ 开始 AutoXecute 运行 ”按钮开始成像采集
    注意：使用 DAN 基质在负离子模式下成像可检测 TCA 循环中的多种代谢物、氨基酸和脂肪酸等。

3. N-连接聚糖成像的样品制备

1. 从质谱仪中取出样品后，将载玻片浸入 100% 乙醇（200 度）中 1 分钟，除去 DAN 基质。
2. 在Coplin罐中重新水化载玻片：新鲜100%乙醇1分钟;95% 乙醇 1 分钟;70%乙醇1分钟;浇水3分钟;淡水 3 分钟。
3. 让载玻片干燥~15分钟。
4. 通过将载玻片浸入 100 mM Tris 缓冲液（通过将 6.06 g Tris 碱溶解在 500 mL 水中并根据需要调节 pH 值制成）中来进行抗原修复，pH 值为 9，在 Coplin 罐中，顶部松散地放置一个盖子，将其放入室中装有 500 mL 水的脱衣室中。加热至95°C20分钟。
5. 从脱衣室中取出 Coplin 罐，将其放在台面上冷却 20 分钟。
6. 将载玻片缓冲液交换到水中，进行五次更换。对于前三个，倒出一半的溶液并用水代替。对于最后两个，倒出所有溶液并用水代替。
7. 让载玻片完全干燥。
8. 创建一个湿度室，用于在应用PNGaseF后孵育载玻片。剪一圈吸水湿巾，覆盖直径 100 毫米的培养皿底部。滚动两块实验室湿巾，在培养皿的两侧形成枕头（图2）。加入8mL水使这些湿巾饱和，然后盖上培养皿的盖子，将其放入37°C的烤箱中至少30分钟进行预热。
   注意：盘子的内部应该看起来是热气腾腾的。
9. 通过将 100 μg 冻干酶复溶在 200 μL 100 mM 碳酸氢铵中，pH 7.8，并涡旋混合，制备 PNGaseF。将溶液转移到 1.5 mL 微量离心管中，并用水稀释至 1 mL。
10. 使用机器人试剂喷雾器用PNGaseF喷洒载玻片，参数如下。将注射泵用于小容量/低流量应用： 轨道速度 - 1200 mm/s;轨道间距 - 3 毫米;喷嘴温度 - 45 °C;喷嘴高度 - 40 毫米;流速 - 25 μL/min;传球 - 15;N ₂ 压力 - 10 psi;图案 - CC
11. 将载玻片放入预热的培养皿中，组织面朝上，一端放在每个实验室擦拭枕上。更换载玻片并用粘合性密封膜密封培养皿。放入37°C的烤箱中，在培养皿顶部放置设置为40°C的爬行动物加热垫。
    注意：这使盖子保持盘子最温暖的部分，并防止冷凝水在盖子上形成并落到组织上，从而导致图像中出现伪影。
12. 将载玻片孵育 2 小时，以允许消化进行。
13. 从培养皿中取出载玻片，让其干燥~5分钟。
14. 通过将 15 mg α-氰基-4-羟基肉桂酸 （CHCA） 溶解在 1.5 mL 70% ACN、0.1% TFA、10 mM 磷酸铵中来制备 MALDI 基质。
    注意： TFA 具有腐蚀性，应在配备适当个人防护设备的抽油烟机中使用。
15. 超声处理直至完全溶解，~5 分钟。
16. 在加载到样品环之前过滤基质溶液。
17. 使用具有以下参数的机器人试剂喷雾器向载玻片喷洒 CHCA： 轨道速度 - 1,200 mm/s;轨道间距 - 3 毫米;喷嘴温度 - 75 °C;喷嘴高度 - 40 毫米;流速 - 120 μL/min;传球 - 3;N ₂ 压力 - 10 psi;图案 - HH
18. 将 0.5 μL 悬浮在甲醇中的红磷涂抹在载玻片上的已知位置。

4. N -连接聚糖成像数据收集

1. 将准备好的载玻片放入载玻片适配器目标中，并加载到 MALDI QTOF 质谱仪中。
2. 在timsControl中加载适当的正 离子模式数据收集 方法。如果仪器尚未处于正离子模式，请在校准和收集数据之前切换极性以进行平衡后至少等待 25 分钟，然后使用以下聚糖的仪器参数进行校准和数据收集： m/z 范围 - 700-3500;激光扫描范围 - X 和 Y 均为 16.0 μm;所得场尺寸 - X 和 Y 均为 20.0 μm;激光射击 - 200;激光通量 - ~25%;漏斗 1 RF - 450.0 Vpp;漏斗 2 RF - 500.0 Vpp;多极射频 - 500.0 Vpp;碰撞能量 - 10.0 eV;碰撞射频 - 2,700.0 Vpp;传输时间 - 140.0 μs;预脉冲存储 - 14.0 μs （补充图 S2）。
3. 在样品载体选项卡上执行目标配置文件（单击立即生成按钮）和焦点调整（单击立即调整按钮）。如果需要，在激光选项卡上调整 X 和 Y 的激光位置，以确保激光与十字准线对齐。
4. 通过从载玻片上的点上对至少五组激光射击相加来收集红磷光谱。
5. 通过单击校准选项卡上的校准按钮执行校准。去除任何强度非常低或 ppm 误差高的峰。
   注意：在单击接受之前，校准分数应为 100%。如果没有，请清除总频谱并获取新的频谱。
6. 在软件中打开之前用于代谢物成像的.mis文件。
7. 使用新名称保存文件，表明它是聚糖数据。
8. 在 “编辑”下 |成像运行属性，将采集方法更改为所需的聚糖方法。
9. 使用 编辑 |清除教学点。
   注意： 从滑轨适配器中取出并重新加载滑轨后，滑轨将不会处于完全相同的位置。
10. 使用“编辑”执行新教学 |设置教学点;设置 3 个点 ，就像在原始成像向导中所做的那样（步骤 2.12）。
11. 通过单击软件中的 “定位样品载体 ”按钮检查示教的准确性。放大并单击图片中第四个（未使用的）基准点的明显特征。样品载体将在 timsControl 中移动到该位置;确认十字准线与所选要素对齐。
    注意：如果十字准线不对齐，请清除示教并重复示教过程以提高准确性。
12. 保存文件。
13. 通过在组织内的几个位置发射激光来检查信号。使用步骤 4.11 中的“ 定位样品载体 ”按钮单击图像中的某个位置以检查示教。确认光谱具有丰富的聚糖峰，主导峰通常位于 m/z 1,663 和 1,809。根据需要调整激光通量以获得最佳信号。
14. 保存 timsControl 方法。
15. 通过单击“ 开始 AutoXecute 运行 ”按钮开始成像采集。

5. 胰蛋白酶肽成像的样品制备

1. 通过将载玻片浸入 100% 乙醇（200 证明）中 ~1 分钟来去除 CHCA 基质
2. 按如下方式将载玻片重新水化在Coplin罐中：新鲜100%乙醇1分钟;95% 乙醇 1 分钟;70%乙醇1分钟;浇水3分钟;淡水 3 分钟。
3. 让载玻片干燥~15分钟。
4. 通过将载玻片浸入 100 mM Tris 缓冲液 （pH 9） 中进行抗原修复，该缓冲液浸入 Coplin 罐中，顶部松散地放置一个盖子，该盖子放入室中装有 500 mL 水的脱隐室中。加热至95°C20分钟。
   注意：第二次抗原修复对于使蛋白质变性是必要的，以便胰蛋白酶更有效地进入切割位点。
5. 从脱衣室中取出 Coplin 罐，将其放在台面上冷却 20 分钟。
6. 将载玻片缓冲液交换到水中，进行五次更换。对于前三个，倒出一半的溶液并用水代替。对于最后两个，倒出所有溶液并用水代替。
7. 让载玻片完全干燥。
8. 通过将 100 μg 冻干酶复溶在 200 μL 100 mM 乙酸中并上下移液混合来制备胰蛋白酶。等分试样成适合实验的大小（通常为 40 μL）并储存在 -20 °C。
9. 通过加入 350 μL 100 mM 碳酸氢铵、pH 7.8 和 39 μL 乙腈，制备 40 μL 等分试样胰蛋白酶。搅拌均匀。
   注意：与水溶液相比，乙腈（10%ACN）增加了胰蛋白酶的活性，并降低了用于喷涂的溶液的表面张力¹⁹。
10. 使用具有以下参数的机器人试剂喷雾器用胰蛋白酶喷洒载玻片。将注射泵用于低容量/低流量应用： 轨道速度 - 750 mm/s;轨道间距 - 3 毫米;喷嘴温度 - 30 °C;喷嘴高度 - 40 毫米;流速 - 10 μL/min;传球 - 12;N ₂ 压力 - 10 psi;图案 - HH
11. 将一块正方形的吸水湿巾放在直径为100毫米的培养皿底部;确保角落刚好接触盘子的边缘，并在湿巾上分配 1 mL 水。
12. 将载玻片放在湿巾顶部，纸巾面朝上，将盖子放在培养皿上，并用粘合密封膜密封培养皿。
13. 将载玻片在 37 °C 下孵育 4 小时，以允许消化继续进行。
14. 从培养皿中取出载玻片，让其干燥~5分钟。
15. 通过将 15 mg α-氰基-4-羟基肉桂酸 （CHCA） 溶解在 1.5 mL 70% ACN、0.1% TFA、10 mM 磷酸铵中来制备 MALDI 基质。
16. 超声处理直至完全溶解，~5 分钟。
17. 在加载到样品环之前过滤基质溶液。
18. 使用具有以下参数的机器人试剂喷雾器向载玻片喷洒 CHCA： 轨道速度 - 1200 mm/s;轨道间距 - 3 毫米;喷嘴温度 - 75 °C;喷嘴高度 - 40 毫米;流速 - 120 μL/min;传球 - 4;N ₂ 压力 - 10 psi;图案 - HH
19. 将 0.5 μL 悬浮在甲醇中的红磷涂抹在载玻片上的已知位置。

6. 胰蛋白酶肽成像数据收集

1. 将准备好的载玻片放入载玻片适配器中，并加载到 timsTOF MALDI QTOF质谱仪中。
2. 在timsControl中加载适当的正 离子模式数据收集 方法。如果仪器尚未处于正离子模式，则在切换极性以进行平衡后至少等待 25 分钟，然后使用以下肽仪器参数进行校准和数据收集： m/z 范围 - 600-4500;激光扫描范围 - X 和 Y 均为 16.0 μm;所得场尺寸 - X 和 Y 均为 20.0 μm;激光射击 - 200;激光通量 - ~25%;漏斗 1 RF - 450.0 Vpp;漏斗 2 RF - 500.0 Vpp;多极射频 - 600.0 Vpp;碰撞能量 - 10.0 eV;碰撞射频 - 3400.0 Vpp;传输时间 - 180.0 μs;预脉冲存储 - 18.0 μs （补充图 S3）。
3. 在“样品载体”选项卡上执行目标配置文件（单击“立即生成”按钮）和焦点调整（单击“立即调整”按钮）。如果需要，在激光片上调整 X 和 Y 的激光位置，以确保激光与十字准线对齐。
4. 通过从载玻片上的点上对至少五组激光射击相加来收集红磷光谱。
5. 通过单击校准选项卡上的校准按钮执行校准。去除任何强度非常低或 ppm 误差高的峰。在单击接受之前确认校准分数为 100%。如果没有，请清除总频谱并获取新的频谱。
6. 打开之前用于聚糖成像的 .mis 文件。
7. 使用新名称保存文件，表明它是肽数据。
8. 在 “编辑”下 |成像运行属性，将采集方法更改为所需的肽方法。
9. 使用 编辑 |清除教学点。
   注意： 从滑轨适配器中取出并重新加载滑轨后，滑轨将不会处于完全相同的位置。
10. 使用“编辑”执行新教学 |设置教学点;设置三个点，就像在原始成像向导中所做的那样（步骤 2.12）。
11. 通过单击“ 定位样品载体 ”按钮检查示教的准确性。放大并单击图片中第四个（未使用的）基准点的明显特征。样品载体将在 timsControl 中移动到该位置;确认十字准线与所选要素对齐。
    注意：如果十字准线不对齐，请清除示教并重复示教过程以提高准确性。
12. 保存文件。
13. 通过在组织内的几个位置发射激光来检查信号。使用“ 定位样品载体 ”按钮单击图像中的某个位置，如步骤 6.11 所示，以检查示教。确认谱图具有丰富的肽峰，主导峰通常位于 m/z 944、1,105 和 1,198。根据需要调整激光通量以获得最佳信号。
14. 保存 timsControl 方法。
15. 通过单击“ 开始 AutoXecute 运行 ”按钮开始成像采集。

7. 组织学染色

注意：苏木精和曙红有几种方法可用。这里介绍的是本实验室中经常使用的改进的 Carazzi 方法。

1. 通过将载玻片浸入 100% 乙醇中 1 分钟来去除 CHCA 基质。
2. 对载玻片进行如下染色：95%乙醇30秒;70% 乙醇 30 秒;浇水30秒;苏木精2分钟;浇水30秒;70% 乙醇 30 秒;95%乙醇30秒;曙红1分钟;95%乙醇30秒;100%乙醇30秒;二甲苯2.5分钟;带封面介质的盖玻片。
3. 让载玻片干燥 >1 小时，然后轻轻按压盖玻片去除任何气泡。
4. 使用数字载玻片扫描仪进行数字化。

8. 数据可视化

注意：SCiLS Lab 可以进行超出本协议范围的广泛分析。在这里，我们将仅描述基本的文件创建、数据可视化以及根据数据库搜索峰以进行假定识别。

1. 启动 SCiLS Lab 2025b ，然后选择 “新建”。
2. 选择要加载到软件中的数据文件。
   注意：使用 SCiLS Lab Pro，可以使用相同参数收集的多个数据文件一起加载，以便相互归一化并同时可视化。
3. 按首选布局排列样本。通过左键单击并拖动来移动样本。通过右键单击并拖动来旋转样本。选择 下一步。
4. 在 “质量轴设置” 窗口中，进行必要的调整。默认值通常适用于 timsTOF 数据。单击 下一步。
5. 在 “特征查找” 窗口中，为导入期间的自动峰值拾取设置适当的值。单击 下一步。
   注意：这对于来自FFPE组织的代谢物数据效果不佳，应跳过。
6. 导入设置将在“导入摘要”窗口中可视化。单击导入。
7. 提供文件名和保存 SCiLS 文件的位置。
   注意：根据文件的大小，导入可能需要几分钟到几个小时。
8. 完成后，将看到一个 摘要窗口 。单击 打开导入的数据集（Open Imported Dataset ） 以与 SCiLS 文件进行交互。
9. 在软件的右上角，单击“归一化”旁边的下拉菜单，然后选择“均方根”。
   注意：鉴于导入质心数据的稀疏性，这是 timsTOF 数据最合适的方法，并将提供最佳可视化效果。
10. 在 文件 |文件属性，将 间隔宽度 设置为适当的值，对于 timsTOF 数据，通常为 10 - 15 ppm 。通过评估该值是否跨越平均光谱中峰的宽度来确认该值是否合适。
11. 通过单击并拖动或向前滚动鼠标滚轮来放大软件底部的平均光谱。
12. 通过将十字准线定位在顶点并左键单击鼠标滚轮来选择要可视化的峰。
13. 按 Control + 空格键将感兴趣的离子添加到活动离子图像列表中。
14. 通过单击软件右侧离子图像窗口底部的“另存为特征列表”按钮来保存精选特征列表。
15. 通过单击文件 |如果 在同一网络上安装和配置了 MetaboScape，则使用 MetaboScape 搜索假定的代谢物或聚糖 ID。或者，将 SCiLS 文件转换为 .imzML 文件，以便导入 METASPACE （https://metaspace2020.org/） 进行假定识别。
    注意：有关 SCiLS Lab 功能的完整说明，请参阅用户手册中的 “帮助” 菜单选项。

Results

该协议的完成应该会产生来自同一组织部分的三个稳健的 MSI 数据集。在代谢物数据全谱的可视化中，光谱将主要由m/z 157和315处的基质峰主导。这对于FFPE组织来说是正常的。通过放大 m/z 范围 <155 和 250 到 300 之间，将观察到许多代谢物和脂肪酸信号。 图 3 显示了全光谱和缩放范围的示例，突出显示了从组织中获得的复杂代谢物光谱。通常，通过这种样品制备，在阴性模式下从FFPE组织切片中观察到700至900个代谢物峰。

PNGaseF酶解应导致在组织中检测到~2-300个聚糖峰。源自 m/z 范围内的聚糖的峰在 1,000-2,000 之间，由于其原子组成，十进制质量数应为 0.3-0.7。该十进制质量有助于区分聚糖和在此样品制备中可能观察到的基质簇。 图4A 显示了具有丰富峰的稳健糖基信号示例，尤其是m/z 1,127.55、1,325.58、1,663.58和1,809.64，而 图4B

Discussion

从单个组织切片收集连续的 MSI 数据需要仔细注意细节。有几个步骤对于获得高质量的数据绝对至关重要。首先，如果同时准备多张载玻片，则应小心。将载玻片放入 Coplin 罐中或在 Coplin 罐之间移动时，请注意不要将两张载玻片放在罐中的同一位置。这将导致组织表面的溶剂暴露不足，或者一张载玻片可能会将组织从另一张载玻片上刮掉。其次，在改变极性进行分析时，允许仪器平衡至少 25 分钟至关重要。在此期间，分子的测量 m/z 值将略有漂移。在此平衡时间内喷洒调谐混合物时可以观察到这一点，因为峰的质量会略有变化。如果在系统平衡之前启动图像，则图像的第一部分中检测到的峰将出现质量漂移，如果在此稳定期间执行校准，则会导致校准不正确。

此外，在PNGaseF孵育期间保持培养皿顶部温暖非常重要。在高湿度孵育2小时期间，水可能会在培养皿的盖子上凝结并雨点落到载玻片上的组织上。如果发生这种情况，组织中将有明显的基质不会结晶的区域，并且不会观察到聚糖信号。带有此伪影的样本中的图像将具有麻子外观。此外，在装入喷雾器的样品回路之前，应过滤基...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5-二氨基萘	费雪科学	D010125G	用于代谢物成像的 MALDI 基质
乙 腈	费雪科学	A955-4	用于基质制备的LC-MS级溶剂
&α;-氰基-4-羟基肉桂酸	西格玛-奥尔德里奇	70990-1G-F	用于聚糖和肽成像的 MALDI 基质
碳酸氢铵	费雪科学	A643-500	酶缓冲液
磷酸铵	西格玛-奥尔德里奇	467782-50克	添加剂，用于减少成像过程中的基质簇
解身室 NxGen	生物护理医疗	不适用	用于组织的抗原修复
乙醇	费雪科学	04-355-223	用于基质制备和染色的LC-MS级溶剂
M5 机器人试剂喷雾器	火币HTX映像	不适用	用于酶和基质在组织中的应用
甲醇	费雪科学	A456-4	用于制制红磷悬浮液的LC-MS级溶剂
MS级胰蛋白酶	费雪科学	PI90058	蛋白质消化酶
MTP 滑块适配器 II	布鲁克道尔顿	8235380	用于将微量镜载玻片插入质谱仪的适配器
NanoZoomer SQ 数字载玻片扫描仪	滨松公司	不适用	用于生成染色组织的数字显微镜图像
Perfection V600 平板扫描仪	爱普生	不适用	用于生成载玻片的光学图像，用于MSI数据收集
Petri-seal	费雪科学	50-212-518	用于酶消化过程中的培养皿密封
巴布亚新几内亚	斗牛犬简介	NZPP550LY	从蛋白质中裂解 N-连接聚糖的酶
红磷	西格玛-奥尔德里奇	04004-250克	用于正离子和负离子模式的 MALDI 校准剂
科学实验室 （2025b）	布鲁克道尔顿	不适用	用于 MSI 数据可视化的软件
timsTOF fleX QTOF 质谱仪	布鲁克道尔顿	不适用	用于质谱数据收集
三氟乙酸	费雪科学	85183	基质添加剂可降低正离子模式成像的 pH 值
特里斯基地	费雪科学	BP152-500型	抗原修复缓冲液
水	费雪科学	W64	LC-MS级溶剂，用于基质、酶和染色
威普 X60	费雪科学	19-413-113	用于加湿酶孵育的吸收性湿巾
二甲苯	费雪科学	X3P-1GAL	染色用透明剂