Method Article

通过 Stereo-seq 对 与物种无关的转录组进行全面的空间分析

DOI:

10.3791/68619

⸱

October 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology and Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Veterinary Medicine & Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文提出了一种协议，用于使用 Stereo-seq 对福尔马林固定石蜡包埋组织切片的宿主、病毒、真菌和微生物组 RNA 进行全面的空间转录组学分析，该协议能够对各种转录组进行高分辨率映射，同时保留组织结构。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

宿主内细胞的空间组成，以及组织内的细菌或病毒载量，会影响驱动细胞完成细胞类型特异性过程的细胞类型和分析物的相互作用。FFPE组织的Stereo-seq使用随机启动空间条形码，这与标准空间转录组学方法不同，标准空间转录组学方法使用A'tailing捕获信使RNA（mRNA）或基于探针捕获物种特异性转录本。这些方法没有包含来自长链非编码 RNA、线粒体 RNA、microRNA 或其他物种、RNA（如微生物、病毒和真菌）的其他类型 RNA 的影响和重要性的最新知识。这里概述了从组织切片到文库制备的分步过程，用于空间物种无关的立体测序应用，使用随机探针方法进行 RNA 检测，该方法与福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织兼容。这种 Stereo-seq 方法具有 0.22 μm 大小的随机捕获珠，每 0.5 μm 在阵列中重复出现一次，从而允许通过基于测序的技术实现亚细胞分辨率。由于该方法同时检测宿主和非宿主RNA，因此该方案需要特别考虑，以允许确定组织内部的内容与在收集、保存、切割和检测过程中沉积在组织上的内容（即环境和处理污染物）。最后，该协议允许人们在空间背景下对多RNA物种具有高（单细胞）水平分辨率，从而深入了解细胞类型和病理物种的内和相互作用。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

空间组学技术能够同时定量多个靶标、DNA（基因组学）、RNA（转录组学）、代谢物（代谢组学）或蛋白质（蛋白质组学）1，彻底改变了组织细胞异质性的研究。这些不同测定的分辨率通常各不相同，在测量分析物时提供了不同的限制，要么在测量单细胞2,3时稀疏性增加，要么在天然空间环境4时增加。相比之下，RNA测序等批量方法仅提供整个样品的平均基因表达，并掩盖细胞异质性2，或者单细胞RNA测序（scRNA-seq）2,3，需要组织解离进行单细胞测序，通常需要过滤。因此，这些方法排除了大细胞和聚集体，而生物信息学方法试图去除片段和双峰，所有这些都会诱导偏差5,6,7。空间转录组学保留了组织结构，为细胞组织和相互作用提供了重要的见解。大多数非靶向空间测序方法不具有单细胞分辨率，因此需要对包含10至100个细胞的空间捕获区域进行反卷积8,9,10。然而，在过去十年中，空间转录组学已经超过了对这些方法的需求，因为分辨率、更大的捕获区域以及多组学方法的集成取得了进步，无论是使用实验策略还是新技术1,11,12。

空间增强分辨率组学测序 （Stereo-seq） 提供纳米级分辨率 （500 nm） 和厘米级捕获区域，与物种无关的全转录组捕获允许捕获编码、非编码和非宿主 RNA13。该方法是目前空间转录组学的最高分辨率，并且可以选择提供最大的视场。然而，这种方法有一些显着的局限性，包括大约 15 小时的动手时间和劳动力要求，需要 4 天才能完成测序就绪文库。相比之下，其他基于测序的空间转录组学技术，例如基于探针的空间转录组学、基于polyA捕获阵列的空间转录组学、Slide-seq和用于空间组学测序的组织中的确定性条形码（DBiT-seq）通常需要2至3天内5至8小时的动手时间（表1）。对于许多研究人员来说，这些进步超过了技术挑战，非常适合构建完整的转录组学空间图谱，以研究细胞和亚细胞水平的疾病进展，特别是在与其他技术分层的情况下1。

Stereo-seq 协议具有超越传统 mRNA 转录组学的可能性，传统 mRNA 转录组学依赖于 poly-T 探针来捕获聚腺苷酸化 mRNA 转录本。这些方法可以通过向新鲜组织14 添加聚腺苷酸化或靶预定义基因集15 的物种特异性探针进行修改，以进行空间表达分析。相反，Stereo-seq使用随机核苷酸探针来选择不同的RNA，而不分物种，包括微生物RNA，真菌RNA，病毒RNA和非聚腺苷酸化RNA，如增强子RNA，环状RNA和长链非编码RNA（lncRNA）16。从理论上讲，可以捕获较小的 RNA 或修复元件，例如小干扰 RNA （siRNA）、microRNA （miRNA） 和转座子17。然而，目前这些RNA的生物信息学和图谱仍然具有挑战性，并且经常在初始比对期间被过滤掉，通常使用30 bp的截止值。

这里概述了一个详细的协议，我们对制造商在 DNA 纳米球 （DNB） 芯片上的随机核苷酸捕获进行了修改，以确保更好地理解和处理图 1 所示的 Stereo-seq 协议。该协议包括分子生物学家的策略，用于在Stereo-seq上测试新的FFPE组织，并具有随机核苷酸捕获，以从较低质量的存档样品和脂肪组织中产生更一致，更高的产量。概述的方案针对来自大多数器官的FFPE样品进行了优化，无论其来源如何。然而，该协议不包括处理需要脱钙的困难组织（例如骨髓）所需的当前修改。

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Protocol

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本方法论文中未提供初治高级别高级别浆液性卵巢癌患者标本的临床数据。然而，相关临床数据是按照德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心妇科肿瘤和生殖医学系机构审查委员会 （IRB） 批准的方案从提供书面知情同意书的参与者那里收集的。

注意：建议在整个方案期间佩戴外科口罩和手套，以防止RNase污染。建议长发的研究人员将其向后拉，甚至戴上发网。始终使用无菌无核酸酶水 （NFW） 和无核酸酶、低结合的 DNA/RNA 试管，以最大限度地提高产量。非哺乳动物组织，例如植物组织，可能需要优化粘附性，涉及聚-L-赖氨酸 （PLL） 和由于细胞壁而延长的透化时间。虽然分子捕获在理论上仍然是可行的，但由于植物组织在我们当前的工作流程中仍未经过测试，因此需要进行实验验证。

1. 评估RNA质量和RNA片段分布值200分

  1. 使用 RNA 片段分布值 200 （DV200） 评估 RNA 质量，该值测量大于 200 bp 的 RNA 百分比。
  2. 使用来自同一组织块的两个 10 μm 切片，用于立体测验处理。
    注意：立即处理是最佳选择，但样品可以在 4 °C 下储存长达 1 周，在 -20 °C 下储存 4 周，或在 -80 °C 下储存 6 个月。
  3. 使用Patel等人18 描述的非大小选择性RNA提取方案提取RNA，以准确评估RNA片段大小的分布。
  4. 使用片段分析仪通过以下方法之一评估 RNA 质量，以确定 DV200 分数，或表示长度超过 200 bp 的 RNA 片段的曲线下面积百分比。理想情况下，组织应具有DV200评分（>50%）和浓度（>10ng / μL）。

2. 工作空间清洁

  1. 用 30% 的漂白剂清洁所有表面。让表面干燥至少 30 分钟，以防止漂白剂和乙醇的结合形成氯仿。
  2. 用 DNA 去污湿巾 （DDW） 擦拭表面。用 RNase 去污溶液 （RDS） 喷洒所有表面，然后用 NFW 制备的 70% 乙醇。
    注意：切勿混合漂白剂或任何其他酒精。这种组合产生氯仿，氯仿具有剧毒，即使在低暴露下也会导致意识丧失、器官损伤或死亡。

3. Stereo-seq 随机寡核苷酸捕获芯片 （N-chip） 制备

  1. 按照步骤 2.1 和 2.2 中的说明清理工作区，包括此步骤中使用的所有系统。
  2. 从包装中取出 Stereo-seq N 芯片，记录芯片 ID，并用 100% 乙醇清洁 Stereo-seq N 芯片和载玻片的边缘，不要接触芯片。让其完全风干。
  3. 树脂应用，将芯片固定到载玻片上（对于使用二甲苯的用户，可选）。
    注意：尽管商业供应商经常推荐非二甲苯透明剂，但据观察，根据石蜡混合物的不同，非二甲苯透明剂的效果可能较差。它们通常与某些塑料、合成树脂或蜂蜡包埋组织不相容，并且不能有效清除重交联或高熔点石蜡。如果不确定用于包埋样品的石蜡成分，建议使用二甲苯以获得最佳清除效果。此外，二甲苯能够更好地清除脂肪组织，例如乳房、卵巢、卵子或脑组织。
    1. 摇匀或混合树脂，确保其均匀白色。使用微量移液器，小心地在Stereo-seq N芯片的边缘涂上10μL紫外线固化陶瓷树脂（图2A）。
      注意：树脂会引起皮肤和眼睛刺激，反复接触可能会导致皮肤过敏反应。移液或处理这种树脂时，请始终佩戴丁腈手套、护目镜和实验室外套。在通风良好的地方工作，使用大量或加热溶液时戴上口罩，避免直接接触皮肤或眼睛。
    2. 使用密封的泡沫棉签，去除多余的树脂，在芯片边缘周围只留下一条细线。将载玻片放入紫外线固化装置中，确保不要接触芯片表面。
    3. 将涂有树脂的芯片放在 405 nm 紫外光源上的不透明掩模顶部，照亮载玻片背面并固化 5 分钟。这如 图 2B 所示。
      注意：不要将 Stereo-seq N 芯片过度暴露在紫外线下，也不要接触芯片表面的树脂，因为它可能会对纳米球造成不利影响。
    4. 固化后，使用浸泡在以下每种物质中的密封泡沫拭子：100% 分子级乙醇;70%乙醇;最后是 NFW 清洁放置树脂的边缘周围。如果白点脱落，请再次清洁边缘。切勿触摸芯片表面（图 2C）。
    5. 让载玻片完全风干。检查后，如果需要，将芯片在 4 °C 下用干燥剂储存过夜。但是，建议尽可能立即继续进行芯片制备和切片。
      注意： 使用紫外线时，请务必佩戴适当的个人防护装备，包括防紫外线眼镜。在通风良好的地方处理乙醇和树脂，最好是通风橱。根据机构指南处理废物。
  4. 用聚-L-赖氨酸制备芯片（对于脂肪组织或有粘附问题的组织可选。
    1. 按照步骤 2.1 和 2.2 中的说明清理工作区，包括此步骤中使用的所有系统。
      注意： 请勿将化学品直接喷入 PCR 机。对于所有 PCR 前步骤，如果可能，请在 PCR 罩中工作，以防止污染，包括先前扩增的 cDNA。
    2. 使用 50 mL 锥形管将芯片浸入新鲜的 NFW 中 3 次。
    3. 使用压缩空气干燥芯片，使用压缩空气的全部力，以大约 60° 至 80° 角从距芯片表面约 5 厘米处沿对角线 （45°） 穿过芯片表面（图 2E）。如果表面出现浑浊，请用新鲜的NFW重复清洗并再次干燥（云表面通常意味着陶瓷在前面的步骤中没有充分洗掉或固化）。
    4. 涂上 150 μL PLL 溶液覆盖整个芯片表面。在室温（22°C至25°C）下孵育10分钟。这如 图 2D 所示。
    5. 取出PLL溶液，用无核酸酶水洗涤芯片两次10-15秒。
    6. 第二次清洗后小心擦干载玻片的边缘（不要接触芯片）。
    7. 使用压缩空气牢固干燥芯片，使用压缩空气的全部力，以大约 60° 至 45° 角从距芯片表面约 5 cm 处对角线穿过芯片表面（图 2E）。
      注意：芯片需要在 30 秒或更短的时间内完全干燥。如果花费的时间超过此时间，DNB 将受到干扰，这将导致捕获中出现伪影。
    8. 在 1 小时内进行安装并保持芯片干燥。
      注意：如果干燥后切屑表面出现浑浊，请用新鲜的 NFW 清洗并重复干燥过程。如果干燥后芯片表面有伪影，可能会导致这些区域出现捕获问题。如果组织不需要PLL粘附，请避免使用PLL粘附。触摸芯片会导致 cDNA 释放前的划痕和捕获区域丢失，或释放后捕获不均匀。芯片表面的树脂会导致捕获区域的斑点损失。将芯片放置在离压缩空气喷嘴太近的位置可能会产生晶体，并在芯片表面喷出损坏的 DBN 标记;然而，这种情况很少见，通常只有在喷嘴几乎接触芯片并且压缩空气瓶太冷时才会发生。建议使用评估芯片多次练习此过程，因为此步骤在技术上具有挑战性。

4.组织切片和安装

  1. 确保工作区干净，如步骤 2.1 和 2.2 中所述。确保在组织切片和安装过程中，所有水浴和冰都使用新的刀片和 NFW。不要直接触摸芯片，只用纸巾覆盖芯片的80%。
    注意：建议标准组织使用5μm的厚度，高脂肪组织使用4μm的厚度。如果适用，使用连续部分功能区来匹配样品之间的模式。
  2. 在烤箱或PCR机上打开盖子，在42°C下干燥载玻片3小时。然后转移载玻片或在烘箱或PCR机上将温度更改为37°C，烘烤过夜12-48小时。建议在18小时左右使用。
  3. 可选停止点：干燥后，将载玻片密封在铝袋中，用干燥剂在4°C下最多1周，然后再进行。
    注意：较长的干燥时间可能会降低RNA的完整性。干燥时间过短会导致组织对载玻片的粘附力降低。在较高温度下烘烤可能会降低 RNA 完整性。载玻片可以运送用于外部处理（例如，主机分析）。但是，由于运输过程中的潜在污染增加，不建议运输进行微生物组分析。

5. 对载玻片进行脱蜡

  1. 确保工作区干净，如步骤 2.1 和 2.2 中所述。
  2. 制备用于脱蜡和 Stereo-seq 方案的试剂。
    1. 等分所需试剂：两个 30 mL 二甲苯装在 50 mL 锥形管中，两个 30 mL 100% 乙醇装在 50 mL 锥形管中。
    2. 用NFW制备以下稀释试剂：每芯片96%乙醇（需要2个锥形或1mL），每个芯片90%乙醇，每个芯片80%乙醇，每个芯片70%乙醇，每个芯片50%乙醇，每个芯片30%乙醇，2.5 mL从20x溶液中提取5x盐水-柠檬酸钠（SSC），5 mL 0.01N HCl（用NFW稀释0.1N HCl至pH 2）。对于乙醇稀释液，如果使用硅胶垫圈，则在 50 mL 锥形管中制备一个 30 mL 溶液，或在 1.5 mL 管中制备一个 500 μL 溶液。
    3. 制备以下溶液并将它们保存在冰上：i）从5x溶液中取出32.5mL 0.1x SSC（将30mL溶液保存在锥形管中，将另外2.5mL放入5mL管中以备将来使用），ii）400μL含有5%RI的0.1x SSC，保持在冰上。
    4. 用0.1N HCl制备以下稀释试剂。
      1. 通过向市售冻干试剂中加入 1 mL 0.1 N HCl 来制备 10x 透化试剂 （PR） 溶液。
        注意：仅在冰上保存1小时，确保等分试样以备将来使用，并在-20°C下冷冻。
      2. 制备 500 μL 1x PR 溶液（用 0.01 N HCl 稀释 10x PR 溶液等分试样，在冰上保持长达 6 小时）。
        注意：0.01 N HCl 的 pH 值在 pH 2.0 的 10% 以内至关重要，因为基于胃蛋白酶的酶在 pH 2 下表现最佳。
  3. 通过将载玻片浸泡在二甲苯（推荐）中2轮，每轮20分钟，使载玻片脱蜡。
  4. 立即用乙醇（100%，96%，2轮，每次5分钟）重新水化样品，然后90%，70%，50%和30%，1轮，2分钟）。最后，用NFW补水1分钟。对于乙醇稀释液，如果制备用于微生物组研究的样品，则每张载玻片在 50 mL 锥形管中使用 30 mL 溶液，如果制备非微生物组样品，则每两张载玻片使用 30 mL 溶液。对于所有后续稀释液，在 50 mL 锥形管中制备 30 mL 溶液，或者，如果使用硅胶垫圈，则每 1 cm2 芯片使用 500 μL 溶液以完全覆盖芯片区域。
    可选：建议在芯片周围放置一个硅胶室，以在 100% 乙醇步骤后形成密封，如图 2F-H 所示。这允许使用较小体积的试剂并降低损坏芯片的风险。或者，可以使用 50 mL 锥形管在整个过程中完全浸没 Stereo-seq 载玻片。

6.（可选）核成像和ssDNA染色

注意：在 6.1 中使用之前，让 FFPE 解交联试剂达到室温 （~25 °C）。其他染色溶液是可能的，但目前需要荧光核染色来进行转录组数据的单细胞分割和细胞分箱。

  1. 使用单链 DNA （ssDNA） 染料进行荧光染色
    1. 通过用 5x SSC 缓冲液稀释 Qubit ssDNA 试剂，每 1 至 2 个芯片以 1：1 的稀释度，在 SSC 缓冲液中制备 2 μL ssDNA 染色溶液。
      注意：ssDNA稀释度可以根据成像时使用的显微镜而变化。 因此，新显微镜应使用评估芯片和测试组织的ssDNA染料稀释液组进行测试，以确定最佳动态范围。
    2. 使用 1：20 稀释的 RNase 抑制剂 （RI）、1：200 稀释的 ssDNA 稀释液和剩余的 5x SSC 创建染色溶液的预混液（每芯片 200 μL）。
    3. 加入染色溶液（每芯片 150 μL）并在室温下在黑暗中孵育 5 分钟。使用移液器轻轻去除芯片角上的染色溶液。
      注意：如果使用可拆卸硅胶室，请在用 ssDNA 染料混合物对芯片进行染色之前将其取下。
    4. 用 0.1x SSC（每次每个芯片 150 μL）洗涤芯片两次，持续 10-15 秒。第二次清洗后，用透镜纸小心擦干载玻片的边缘（不要接触芯片）。
    5. 添加~3-5μL甘油（倒置显微镜使用较少）以安装三叶草玻片（小心气泡）。
      注意：确保将正确体积的甘油施加到载玻片区域，对于 1 cm2 芯片，通常约为 4 μL。使用过多的甘油会导致载玻片垂直握住时盖玻片移动。使用过少的甘油会增加移除盖玻片时组织损伤的风险，并可能引入气泡，从而对成像和单细胞分割结果产生负面影响。
    6. 将盖玻片从约 1 厘米高处落到芯片上。如果使用干预显微镜，请确保盖玻片在垂直握持时不会滑落。如果它确实在不添加更多甘油的情况下重新安装。
    7. 使用宽视场显微镜捕获 ssDNA 染色组织的荧光图像，图像图块之间重叠 10%。
      注意：建议使用10倍物镜使用宽视场显微镜绘制9-13点的手动聚焦图。可以使用共聚焦显微镜，但它对组织和芯片的焦点变化更为敏感。
    8. 在ImageJ等图像处理软件中进行拼接，利用理论重叠生成每个瓦片的大致位置，随后进行像素匹配计算重叠，对图像平铺进行微调
    9. 在 StereoMap 软件中处理图像并确保图像质量控制通过后再继续。
    10. 将 Stereo-seq 载玻片浸入 30 mL 的 0.1x SSC 中，直到盖玻片分离。

7. 去交联过程

注意：在此步骤中避免触摸或倾斜芯片，并轻轻移液。

  1. 确保FFPE解交联试剂处于温暖的室温（~25°C）下，并检查以确保没有使溶液浑浊的颗粒。如果可见颗粒，请加热至 55 °C 并冷却至 30 °C 后再使用。
  2. 使用以下设置打开热循环仪：30°C进行平衡（加热盖为85°C）;95°C孵育30分钟;4°C无限保持时间。
  3. 组装盒式垫圈，然后将 Stereo-seq 芯片载玻片放入盒中。
  4. 将FFPE去交联试剂（每芯片400μL）加入含有芯片的盒的孔中。在盒上贴上密封胶带并确认其密封。
  5. 从步骤7.2开始在95°C下孵育30分钟。10 分钟后，将 10 mL 甲醇放入 15 mL 容器中（每张载玻片约需要 1 mL）放入 -20 °C 冰箱中。
  6. 小心地从热循环仪中取出芯片，将盒转移到工作台上，然后撕下密封胶带。
  7. 使用移液器取出并丢弃FFPE解交联试剂。取出所有解交联试剂后，分离并丢弃盒和垫圈。
  8. 将 Stereo-seq 载玻片平衡至室温 ~23 °C。 在无菌通风橱下，擦干载玻片边缘并涂上新的硅胶室（如果适用）。从 -20 °C 冰箱中加入 500 μL 冷冻甲醇，确保整个部分完全浸没 20 分钟。
    注意：或者，可以将整个 Stereo-seq 载玻片浸入装有 30 mL 冷冻甲醇的 50 mL 锥形管中。
  9. 在甲醇固定结束前约 5 分钟使用前，将 1x PR 溶液在 37°C 干燥块上预热 10 分钟（步骤 7.8）。
  10. 固定完成后，将载玻片移至无菌通风橱。擦去载玻片上多余的甲醇，等待芯片上剩余的甲醇蒸发（~5 分钟）。组装新的盒式磁带和垫圈。甲醇完全蒸发后，将 Stereo-seq 芯片载玻片放入盒中。

8. 透化和逆转录

注意：对于步骤 8.1-8.11，缓慢移液，不要触摸芯片。过大的压力会导致 DNB 中扩散或标记。

  1. 向芯片中加入 200 μL 透化试剂。将密封胶带贴在 Stereo-seq 载玻片盒上并确保其密封。
  2. 在37°C下孵育30分钟。
  3. 通过为每张载玻片添加 380 μL 0.1x SSC 和 20 μL RI（RNA 抑制剂）来制备洗涤缓冲液。每张载玻片制作 400 μL，并在冰上保存直至使用。
  4. 取出FFPE逆转录（FFPE RT）试剂，然后旋转以下所有试剂，并将酶混合物，寡核苷酸和二聚体保持在冰上。将FFPE RT缓冲液加热至室温（~23°C）。
  5. 透化结束前 5 分钟，每芯片制备 200 μL FFPE RT 混合物。加入FFPE RT缓冲液（158μL），FFPE RT酶混合物（30μL），FFPE RT寡核苷酸（10μL）和FFPE二聚体（2μL）。轻轻混合并放在冰上。
  6. 将芯片放在热循环仪上，将孵育温度更改为室温（~23°C）。取下密封件并轻轻丢弃 1x PR 溶液。
  7. 用每 1 cm2 芯片 200 μL 0.1x SSC（含 5% RI）非常轻柔地清洗芯片。
  8. 从芯片角去除 0.1x SSC（含 5% RI）洗涤液。
  9. 将 200 μL FFPE RT 溶液添加到芯片的角上。
  10. 在 Stereo-seq 载玻片盒上贴上密封胶带并确保其密封;否则，蒸发会降低产量。
  11. 在42°C下用45°C加热的盖子开始协议FFPE RT孵育等温反应（5至24小时）。
    注意：建议孵育12至16小时，并在实验中保持一致。

9. cDNA释放和纯化

注意：对于步骤 9.6-9.7，缓慢移液，不要触摸芯片。过大的压力会导致 DNB 中扩散或标记。

  1. 通过在 55 °C 下加热 cDNA 释放缓冲液以溶解可能形成的任何沉淀物，制备 400 μL cDNA 释放缓冲液。
  2. 将 cDNA 释放缓冲液平衡至温暖的室温 （25 °C）。不要放在冰块上。
  3. 使用前，在台式离心机中以 100 x g 的速度旋转 cDNA 释放缓冲液和 cDNA 释放酶。
  4. 通过将 20 μL 释放酶添加到 380 μL cDNA 释放缓冲液中来制备 cDNA 缓冲液。
  5. 将芯片放在热循环仪上，将孵育温度更改为室温（~23°C）。取下密封件，轻轻取出并丢弃 FFPE RT 溶液。
  6. 用每片 0.1x SSC （200 μL） 轻柔地清洗芯片一次。
  7. 从芯片角上去除 0.1x SSC，非常小心地移液。
  8. 向每个芯片中加入 400 μL 制备的 cDNA 释放溶液。
  9. 通过在盒上贴上密封胶带（或 PCR 盖）来密封 Stereo-seqs 载玻片盒。确保盒式磁带密封严密，以防止任何蒸发、泄漏或污染。
  10. 在 55°C 下孵育 ≥ 5 小时（至少 5 小时至 24 小时），盖子加热至 60 °C。
    注意：建议孵育5至7小时或以2小时在实验中保持一致。

10. 收集 cDNA 释放混合物

  1. 将NFW预热至37°C（每个1cm2的芯片至少500μL）。
  2. 取下密封件，在组织上方芯片的每个角落和中心用力移液，但不要刮擦或触摸组织。从芯片中收集所有 cDNA 释放混合物并转移到 1.5 或 2.0 mL 离心管中。在每根管子上记录芯片识别（芯片 ID）编号。
  3. 将 350 μL 预热的 NFW 直接添加到芯片表面。再次用较小的移液器（P100 或 P200）用力移液，倾斜吸头以施加更大的剪切力，但不要接触组织或刮掉芯片。
  4. 将步骤 10.3 中的洗涤液 （350 μL） 与步骤 10.2 中的 cDNA 释放混合物 （400 μL） 混合。确保仅组合单个芯片中的样品。
  5. 将 100 μL NFW 放在芯片上，将 Stereo-seq 芯片载玻片密封在盒中，并将其存放在冰箱中直至方案结束。
    注意：在产量低的情况下，请考虑重新释放cDNA。可以使用 ssDNA 染料和带或不带盖玻片的重新成像来评估芯片上 DNA 的存在。

11. 收集 cDNA 珠子清理

  1. 用等体积的固相可逆固定化（SPRI）珠重悬步骤10.4中的cDNA。混合直至珠子均匀分布在整个溶液中，以选择超过 ~100 bp 的 DNA 片段。
  2. 在 27°C 至 37°C（推荐 30°C）的温度下孵育 10 分钟。
    1. 孵化期间。每处理 2 个芯片，在 NFW 中制备 5 mL 80% 新鲜乙醇。
  3. 取出装有孵育珠混合物的试管，并在台式离心机上以 100 x g 的速度短暂旋转。
  4. 将试管放在磁分离架上并孵育至少 5 分钟（直到液体变清）。
  5. 小心地除去上清液，不要干扰珠子，并将其保存在干净的标记管中。用芯片 ID 和日期标记 cDNA 释放。
  6. 在不干扰磁珠的情况下向试管中加入 1.5 mL 80% 乙醇，孵育 30 秒，然后取出乙醇。
  7. 再重复步骤 11.6 一次，这次使用小移液器吸头尽可能多地去除乙醇，而不会干扰珠子。
  8. 风干管中的珠子，直到它们不再反射。时间会有所不同，因此请定期检查以防止过度干燥（裂纹），从而导致产量低下。
    注意： 测量房间的湿度和温度。在高温（27°C）和低湿度（低于20%）下，珠子会非常快地干燥（3至5分钟）。在低温 （23 °C） 和高湿度 （超过 40%） 下，珠子的干燥速度会慢得多（7 至 15 分钟）。
  9. 从磁铁架上取出珠子管，加入 22 μL NFW，并通过涡旋混合。
  10. 在27°C的干浴或PCR机中孵育5至15分钟。
  11. 短暂离心并将试管放回磁分离架上，直到液体变清（2 至 5 分钟）。
  12. 将 21 μL 含有 cDNA 的上清液转移到样品标记的 0.2 mL PCR 管中，而不会干扰磁珠。
  13. 对每个试管重复步骤 11.9 至 11.12，总共收集 42 μL cDNA。继续直接扩增 cDNA（步骤 12.1 至 12.8）。
    注意：开始扩增的延迟将导致产量降低、短读长增加和单链 DNA 模板降解。

12. cDNA扩增

  1. 从冰箱中取出 cDNA 扩增混合物和 FFPE cDNA 引物，并将它们放在湿冰上解冻。
  2. 在台式离心机上以 ~100 x g 旋转 cDNA 扩增混合物和 FFPE cDNA 引物。
  3. 从（步骤 11.13）中将 50 μL cDNA 扩增溶液和 8 μL FFPE cDNA 引物从（步骤 11.13）的 42 μL 添加到每个 cDNA 管中，并放入带有平盖适配器的热循环仪中，以防止管变形。
  4. 运行热循环仪程序进行cDNA扩增：初始变性：95°C5分钟;循环：[98°C20s，58°C20s，72°C3min]×15次循环;最终延伸：72°C5分钟;保温温度：12°C（如果立即处理）/4°C（如果保温过夜）。
  5. 在磁珠清理前和后测量 1 μL cDNA 的 DNA 浓度。
    注意：清理前的cDNA产物量应计算为每1cm²芯片超过1μg。净化后浓度应至少为 10 ng/μL。较低的产量通常与文库多样性的降低有关。此阶段的显着样本损失与 DV200 评分相关;然而，DV200 并不是结果的完美预测指标。
  6. 使用步骤 12.4 中的 PCR 产物重复步骤 11 的 cDNA 磁珠纯化（磁珠净化），并进行三项修改：使用较小的 PCR 磁架，在步骤 11.6 中仅添加 200 μL 80% 乙醇，并在步骤 11.9 中重悬于 22 μL Tris-EDTA （TE） 缓冲液 （pH 8） 中。
  7. 将珠子储存在装有 20 μL NFW 的管中，标有样品名称、条形码、日期和芯片 ID。
  8. 使用片段分析仪测量 cDNA 片段分布。片段大小范围应在 250-400 bp 之间。如果碎片太小，请重复珠子清洁，但使用室温（~25°C）而不是27°C。
    可选停止点：测量 cDNA 后，可在 -20 °C 下保存长达 1 个月，在 -80 °C 下保存长达 1 年。珠子可以在4°C下在NFW中储存1周。 不要冷冻珠子。

13. 文库准备（第 4 天）

  1. 扩增反应混合物制备
    1. 取出文库 PCR 扩增溶液、文库条形码集、cDNA 产物和 NFW。在室温下在冰和水上解冻 cDNA 和试剂，并以 100 x g 旋转 10 秒。
  2. 确定每 25 μL PCR 条码引物混合物的文库条码策略。
    注意：对于此测序器，所有碱基必须在条形码集中的每个位置均等表示。因此，大多数与此兼容的商业套件都设计有预定义的条形码四分体（四件一组）。当跨测序通道进行分离时，这些四分体可以应用于单个样品，或者在每个泳道对一个样品进行测序时，它们可以合并在一起用于单个样品。保持平衡的条码势在必行，因为不平衡的条码会减少排序器生成的可用数据量。
  3. 确定 20 ng 的 cDNA 体积（例如，10 ng/μL 需要 2 μL）。使用它制备稀释的 cDNA（稀释至 ~1 ng/μL）的 NFW （25 μL） 溶液。
  4. 将文库扩增混合物 （50 μL） 与稀释的 cDNA 在 NFW （25 μL） 和 PCR 条形码引物混合物 （25 μL） 中混合到 0.2 mL PCR 管中。
  5. 通过移液混合孔并以 100 x g 旋转 10 秒。（不要涡旋）
  6. 将 0.2 mL PCR 管放入热循环仪中，并确保有一个插入物以防止管被压碎。
  7. 运行热循环仪程序进行cDNA扩增：初始变性：95°C5分钟;循环：[98°C20s，58°C20s，72°C3min]×8次循环;最终延伸：72°C5分钟;保温温度：12 °C（如果立即处理）/4 °C（如果保温过夜）。
    注意：可以使用不同量的输入cDNA来制备文库。然而，使用的量会影响扩增所需的 PCR 循环次数。例如，供应商建议输入 20 ng 的 DNA 并使用 8 个循环。也可以使用 40 ng 的 7 个循环或 80 ng 的 6 个循环。不建议使用少于 20 ng 或超过 80 ng 的起始 cDNA。

14. 文库扩增珠清理

  1. 按照步骤 12.5 中的方法定量原始文库产物。
  2. 使用步骤 13.7 中的原始文库产物重复步骤 11 的磁珠纯化（磁珠净化），并进行三项修改：使用磁珠与产物的比例为 0.8：1，使用较小的 PCR 磁架，与步骤 11.7 相比仅使用 200 μL 80% 乙醇，并在步骤 11.9 中重悬于 22 μL TE 缓冲液 （pH 8） 中。每两个 1cm2 芯片准备大约 1mL 新鲜的 80% 乙醇。
  3. 可选停止点：测量文库后，可在 -20 °C 下保存长达 1 个月，在 -80 °C 下保存长达 1 年。珠子可以在4°C下在NFW下储存1周。 不要冷冻珠子。

15. 用于测序 Stereo-Seq 随机寡核苷酸引发 DNB 的 DNBSEQ-T7RS 系统

  1. 在 DNBSEQ-T7RS 系统上使用 PE75 试剂盒，将周期分配给读取 1 的周期为 25，读取 2 的周期为 62 （PE25+62），然后是 10 bp 的指数：
    1. 第一次读取（读取 25 个周期中的 1 个）从基于芯片的条形码中捕获空间芯片 ID （CID） 或特定于位置的信息。
    2. 第二次读取（读取 62 个周期中的 2 个）捕获分子标识符 （MID），这是一个随机的 6 bp 序列，直接连接到基因插入片段，并具有 3 个额外的暗循环，用于定相校正和条形码偏移校准。接下来是来自读数 2 的 30-59 bp 的基因插入，通过映射到已知基因组或转录组来识别。
      注意：更长的基因插入是可能的，但需要不同的配对端试剂盒，并修改图谱工作流程。
    3. 基于步骤13.2中汇集的测序条形码，解复用的索引周期涵盖10 bps。
      注意：对于 75 PE 流通池，典型测序时间约为 10-12 小时。测序通常在测序核心或商业设施中进行，而不是大多数实验室的内部过程，因为它需要 DNBSEQ-T7RS 或类似的测序仪器。

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Results

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以下数据展示了使用 SAW 管道执行单细胞分割的能力，并从 FFPE 切片映射到非聚腺苷酸化 RNA，例如 tRNA （TRDMT1）。来自 Stereo-seq 的无偏见数据使人们不仅可以检查 mRNA，还可以检查 tRNA、rRNA 和非宿主 RNA（如果相关）的重要性。使用SAW管道16的直接输出和图3A-G中Stereo-seq输出质量评估的立体，我们从细胞箱（通过SAW细胞核图像创建的单核叠加）生成了标准的空间概览，基因表达以及聚类和QC。检测到的转录本数量因组织类型而异：免疫密集的组织通常表现出较低的转录本计数（每个细胞箱约 100 个基因），而非整倍体肿瘤细胞每个细胞箱可能有多达 1,000 个转录本。请注意，该样本的聚类仍然需要生物信息学处理来提供聚类身份，因为SAW默认分辨率非常高（0.8比1），并且根据读取计数过滤数据，建议使用...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stereo-seq 协议非常详细，涉及几个关键步骤，需要精确度、时机和清洁的环境来确保成功，尤其是在可能需要特定预防措施的微生物组或非宿主分析中。

在所有步骤中都需要使用无核酸酶的水，并且除样品和试剂外，不得接触捕获芯片。使用盒式组件时要格外小心，花时间使用练习芯片。组织区域上的划痕会破坏组织空间分辨率，而轨道线上的划痕可能会阻止空间分辨率或样品自动对齐。此外，对于胰腺或肝脏等高 RNase/DNase 组织，建议在切片过程中换水。此外，为了保持RNA质量，建议将带有少量蜡封的FFPE组织块储存在面部，4°C，并储存在干燥器中以防止降解。如果以这种方式储存，在使用25、26、27 之前，样品仍需要在表面再水化并平衡至切割室温。切割室应在 22 至 25 °C。 此外，最适合 Stereo-seq 的样本是 DV200 分数高于 ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明这项工作不是由 Complete Genomics 资助的。然而，Complete Genomics 正在支持本文的发表费用。 他们没有得到高级副本，也没有对内容进行输入。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究部分由卵巢癌研究联盟（OCRA 811621 和 891490）、Sie 基金会和 Stephanie C. Stelter 捐赠基金资助。这项研究是与流式细胞术和细胞成像核心设施、兽医和外科系以及先进基因组学技术核心合作进行的，该核心部分得到了美国国立卫生研究院通过 MD Anderson 的癌症中心支持补助金 P30 CA016672 和 Jared Burks 的 NCI 研究专家 1 R50 CA243707-01A1。

我们还要感谢 Compete Genomics，特别是 Brandon Vanderbush 和 Tanzeen Yusuff 的技术培训和故障排除，以及 Jia “Jackie” Zhao、Yongfu Wong 和 Erin Petrilli。作者以折扣价从 Complete Genomics 获得了一套 FFPE OMNI 和测序试剂，以及 T7 早期访问计划的访问权限。此外，还免费提供一些试剂用于本研究。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5毫升离心管，常规DNA酶/RNA酶Thermo Fisher Scientific / Invitrogen3456要混合试剂（其他能带也行） 
100%乙醇西格玛-奥尔德里奇E7023分子级
15毫升锥形无菌聚丙烯离心管Thermo Fisher Scientific / Invitrogen339650用于等分额和nbsp;
20倍浓缩 盐水柠檬酸钠（SSC）缓冲液西格玛-奥尔德里奇S6639-1L以前我做过5倍SSC用于染色，1倍SSC用于洗涤步骤和去除盖片。
2100 生物分析仪安捷伦折扣设备：生物分析仪
3 井室，可拆卸伊比迪80381硅胶腔体用于在补水和固定甲醇时减少体积。
405nm紫外光源各种无用于固化紫外线树脂
50毫升锥形无菌聚丙烯离心管Thermo Fisher Scientific / Invitrogen339652用于分滴和脱石蜡化等;
70%无菌异丙醇醇Texwipe TX3270用于表面去污 
安捷伦高灵敏度DNA套件安捷伦5067-4626用于生物分析仪对cDNA和文库的表征
安捷伦RNA 6000 Pico套件安捷伦5067-1513用于RNA的生物分析仪表征
铝箔各种无用于覆盖SSD染色时的载玻片。
贝克曼·库尔特 SPRIselect（贝克曼·库尔特）贝克曼·库尔特生命科学B23317/B23318/B23319SPRI珠cDNA与文库清理
漂白剂各种无清洁工作站去除微生物组污染
CONSTIX 密封泡沫棉棒康泰克19161023用于精准的树脂清洗
覆滑西格玛-奥尔德里奇BR470045-2000EA
干燥剂包各种无无RNase、无尘的干燥剂包。
一次性口罩Thermo Fisher Scientific / Invitrogen12-888-001保护、RNA酶污染及无菌 
DNA擦除湿巾西格玛-奥尔德里奇L9060-250EA通过擦拭表面（湿巾）进行去污
DNA LoBind 管 1.5mL埃彭多夫 22431021用于采集cDNA和文库后扩增。
DNA LoBind 管 2mL埃彭多夫 22431048用于扩增前采集cDNA。
DNBSEQ OneStep DNB 试剂套件完整基因组学940-001891-00用于DNA纳米球（DNB）制备与扩增的试剂
DNBSEQ-T7RS 清洁试剂套装完整基因组学940-001903-00序列完成后清洗的墨盒
DNBSEQ-T7RS DNB 装载试剂套件完整基因组学940-001894-00试剂和板材将DNB装入流质单元
DNBSEQ-T7RS 测序流单元完整基因组学940-001902-001车道/流速单元
DNBSEQ-T7RS 立体序列可视化试剂套件完整基因组学940-001893-00测序用的弹匣和试剂。
DNBSEQ-T7RS 系统完整基因组学该立体序列可视化集采用了DNBSEQ技术。测序运行始于DNA锚的杂交，然后利用组合探针锚定测序（cPAS）化学将荧光探针连接到DNA纳米球（DNB）。最后，高分辨率成像系统捕捉荧光信号。在对光信号进行数字处理后，序列器生成高质量且准确的序列信息。
尘埃脱压压缩空气晨祷M-6318使用这个品牌或与类似推进剂的产品非常重要;
Edge-Rite切片机Thermo Fisher Scientific / Invitrogen4280L组织学——用于样本切片
防爆冷冻柜各种无在固定甲醇步骤前后冷却甲醇。
组织学刷各种无组织学——用于样本切片
盐酸西格玛-奥尔德里奇2104-50ML用于稀释预制酶，浓度为0.01 N HCl（pH 2）。盐酸溶液的标准库存浓度为0.1牛顿。
成像系统各种无GC Stomics 成像仪，Lecia，Evo Revolution
Invitrogen RNaseZap RNase 去污溶液Thermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9780清除RNA酶污染的清洁工作站
Kimtech 精细任务擦拭器 金科技34155用来干燥工作台、设备、移液器等。
实验服各种无个人防护装备（PPE）
透镜纸Thermo Fisher Scientific / Invitrogen11-997各种无须洗叶干燥玻片的作品
Lookout DNA擦除湿巾西格玛-奥尔德里奇L9060清洁工作站去除PCR污染
凝乳分离架 5uL - 0.2 & nbsp;Permagen LabwareMSRLV08用于PCR管内的珠子分离
Magjet 机架 12x1.5 mLThermo Fisher Scientific / InvitrogenMR02用于1.5毫升管内的珠子分离
手动旋转切片机徕卡RM2235组织学——用于样本切片
甲醇 & ge;99.9%，适用于免疫荧光和高效液相色谱（HPLC）西格玛-奥尔德里奇34860用于固定（需要HPLC级）
微解剖产钳西格玛-奥尔德里奇F4142-1EA组织学——用于样本切片
微量移液器各种无
分子级无核酸酶水 非DPEC处理水各种无珠子的稀释与洗脱
丁腈手套各种无个人防护装备
烤箱各种无烤薯条
带帽的PCR 0.2 mL管各种无用于PCR应用
PCR覆盖物及nbsp;各种无如果提供的保护套粘合剂薄弱，则更换
PCR罩与工作站神秘人物MY-PCR24-010用于PCR前（RNA到cDNA）步骤
pH计各种无pH表确认盐酸pH值。
聚L-赖氨酸溶液西格玛-奥尔德里奇A005-C可选以增强组织与芯片的粘附力
量子比特4荧光仪Thermo Fisher Scientific / InvitrogenQ33226肠胃管;DNA量子测量
量子比特 dsDNA 定量测定套件Thermo Fisher Scientific / InvitrogenQ32851用于测量cDNA和文库定量
量子bitsDNA测定套件Thermo Fisher Scientific / InvitrogenQ10212ssDNA染色（仅使用染料）
无RNA酶冰块各种无组织学——用于切片样品以补充水分，然后再进行切片
RNaseZap RNase 去污溶液Thermo Fisher Scientific / InvitrogenAM9782一种表面净化溶液，能破坏RNAs。
RNeasy FFPE套件奇根73504及19093关于RNA提取与DV200 测量 
Sculpt 超白树脂西拉亚技术无耐高温紫外线固化树脂
Stereo-seq 16条码库准备套件STOmics/完整基因组学111KL160用于构建立体序列 OMNI FFPE 库
立体序列FFPE配件套件STOmics/完整基因组学310AK002211SN114套件中的空间OMNI配件部件
立体序列N芯片幻灯片（1cm x 1cm）STOmics/完整基因组学210CN114空间全知芯片，211SN114套件的一部分
立体测序PCR适配器 STOmics/完整基因组学301AUX001针对PCR杂交步骤，修改为适应三个，类似于PCRmax原位杂交适配器
立体序列转录组学 N 套件STOmics/完整基因组学211KN114空间OMNI摄政器2111SN114套件的一部分
外科设计 通用工业剃须刀片Thermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236组织学——用于样本切片
TE缓冲液pH 8.0西格玛-奥尔德里奇8890用于洗脱cDNA和文库
热循环器BioRad / 各种1861096 /12015392 / 各种PCR机带手动盖子或深井选项（T100热循环器/PTC、Tempo、深井热泵等）
Thermo Scientific Orion 一体化pH缓冲套装Thermo Fisher Scientific / Invitrogen13-624-500
组织浮选浴 - 数字 XH-1003首播NC0779538组织学——用于样本切片
防紫外线眼镜各种无为了紫外线固化时的安全
二甲苯西格玛-奥尔德里奇247642用于脱石蜡

References

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