通过 Stereo-seq 对 与物种无关的转录组进行全面的空间分析

Summary

本文提出了一种协议，用于使用 Stereo-seq 对福尔马林固定石蜡包埋组织切片的宿主、病毒、真菌和微生物组 RNA 进行全面的空间转录组学分析，该协议能够对各种转录组进行高分辨率映射，同时保留组织结构。

Abstract

宿主内细胞的空间组成，以及组织内的细菌或病毒载量，会影响驱动细胞完成细胞类型特异性过程的细胞类型和分析物的相互作用。FFPE组织的Stereo-seq使用随机启动空间条形码，这与标准空间转录组学方法不同，标准空间转录组学方法使用A'tailing捕获信使RNA（mRNA）或基于探针捕获物种特异性转录本。这些方法没有包含来自长链非编码 RNA、线粒体 RNA、microRNA 或其他物种、RNA（如微生物、病毒和真菌）的其他类型 RNA 的影响和重要性的最新知识。这里概述了从组织切片到文库制备的分步过程，用于空间物种无关的立体测序应用，使用随机探针方法进行 RNA 检测，该方法与福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织兼容。这种 Stereo-seq 方法具有 0.22 μm 大小的随机捕获珠，每 0.5 μm 在阵列中重复出现一次，从而允许通过基于测序的技术实现亚细胞分辨率。由于该方法同时检测宿主和非宿主RNA，因此该方案需要特别考虑，以允许确定组织内部的内容与在收集、保存、切割和检测过程中沉积在组织上的内容（即环境和处理污染物）。最后，该协议允许人们在空间背景下对多RNA物种具有高（单细胞）水平分辨率，从而深入了解细胞类型和病理物种的内和相互作用。

Introduction

空间组学技术能够同时定量多个靶标、DNA（基因组学）、RNA（转录组学）、代谢物（代谢组学）或蛋白质（蛋白质组^学）1，彻底改变了组织细胞异质性的研究。这些不同测定的分辨率通常各不相同，在测量分析物时提供了不同的限制，要么在测量单细胞^2,3时稀疏性增加，要么在天然空间环境⁴时增加。相比之下，RNA测序等批量方法仅提供整个样品的平均基因表达，并掩盖细胞异质性²，或者单细胞RNA测序（scRNA-seq）^2,3，^需要组织解离进行单细胞测序，通常需要过滤。因此，这些方法排除了大细胞和聚集体，而生物信息学方法试图去除片段和双峰，所有这些都会诱导偏差^5,6,7。空间转录组学保留了组织结构，为细胞组织和相互作用提供了重要的见解。大多数非靶向空间测序方法不具有单细胞分辨率，因此需要对包含10至100

Protocol

本方法论文中未提供初治高级别高级别浆液性卵巢癌患者标本的临床数据。然而，相关临床数据是按照德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心妇科肿瘤和生殖医学系机构审查委员会 （IRB） 批准的方案从提供书面知情同意书的参与者那里收集的。

注意：建议在整个方案期间佩戴外科口罩和手套，以防止RNase污染。建议长发的研究人员将其向后拉，甚至戴上发网。始终使用无菌无核酸酶水 （NFW） 和无核酸酶、低结合的 DNA/RNA 试管，以最大限度地提高产量。非哺乳动物组织，例如植物组织，可能需要优化粘附性，涉及聚-L-赖氨酸 （PLL） 和由于细胞壁而延长的透化时间。虽然分子捕获在理论上仍然是可行的，但由于植物组织在我们当前的工作流程中仍未经过测试，因此需要进行实验验证。

1. 评估RNA质量和RNA片段分布值200分

1. 使用 RNA 片段分布值 200 （DV200） 评估 RNA 质量，该值测量大于 200 bp 的 RNA 百分比。
2. 使用来自同一组织块的两个 10 μm 切片，用于立体测验处理。
   注意：立即处理是最佳选择，但样品可以在 4 °C 下储存长达 1 周，在 -20 °C 下储存 4 周，或在 -80 °C 下储存 6 个月。
3. 使用Patel等人¹⁸....

Results

以下数据展示了使用 SAW 管道执行单细胞分割的能力，并从 FFPE 切片映射到非聚腺苷酸化 RNA，例如 tRNA （TRDMT1）。来自 Stereo-seq 的无偏见数据使人们不仅可以检查 mRNA，还可以检查 tRNA、rRNA 和非宿主 RNA（如果相关）的重要性。使用SAW管道¹⁶的直接输出和图3A-G中Stereo-seq输出质量评估的立体，我们从细胞箱（通过SAW细胞核图像创建的单核叠加）生成了标准的空间概览，基因表达以及聚类和QC。检测到的转录本数量因组织类型而异：免疫密集的组织通常表现出较低的转录本计数（每个细胞箱约 100 个基因），而非整倍体肿瘤细胞每个细胞箱可能有多达 1,000 个转录本。请注意，该样本的聚类仍然需要生物信息学处理来提供聚类身份，因为SAW默认分辨率非常高（0.8比1），并且根据读取计数过滤数据，建议使用.......

Discussion

Stereo-seq 协议非常详细，涉及几个关键步骤，需要精确度、时机和清洁的环境来确保成功，尤其是在可能需要特定预防措施的微生物组或非宿主分析中。

在所有步骤中都需要使用无核酸酶的水，并且除样品和试剂外，不得接触捕获芯片。使用盒式组件时要格外小心，花时间使用练习芯片。组织区域上的划痕会破坏组织空间分辨率，而轨道线上的划痕可能会阻止空间分辨率或样品自动对齐。此外，对于胰腺或肝脏等高 RNase/DNase 组织，建议在切片过程中换水。此外，为了保持RNA质量，建议将带有少量蜡封的FFPE组织块储存在面部，4°C，并储存在干燥器中以防止降解。如果以这种方式储存，在使用^25、26、27 之前，样品仍需要在表面再水化并平衡至切割室温。切割室应在 22 至 25 °C。 此外，最适合 Stereo-seq 的样本是 DV200 分数高于 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5毫升离心管，常规DNA酶/RNA酶	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	3456	要混合试剂（其他能带也行）
100%乙醇	西格玛-奥尔德里奇	E7023	分子级
15毫升锥形无菌聚丙烯离心管	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	339650	用于等分额和nbsp;
20倍浓缩 盐水柠檬酸钠（SSC）缓冲液	西格玛-奥尔德里奇	S6639-1L	以前我做过5倍SSC用于染色，1倍SSC用于洗涤步骤和去除盖片。
2100 生物分析仪	安捷伦	折扣	设备：生物分析仪
3 井室，可拆卸	伊比迪	80381	硅胶腔体用于在补水和固定甲醇时减少体积。
405nm紫外光源	各种	无	用于固化紫外线树脂
50毫升锥形无菌聚丙烯离心管	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	339652	用于分滴和脱石蜡化等;
70%无菌异丙醇醇	Texwipe	TX3270	用于表面去污
安捷伦高灵敏度DNA套件	安捷伦	5067-4626	用于生物分析仪对cDNA和文库的表征
安捷伦RNA 6000 Pico套件	安捷伦	5067-1513	用于RNA的生物分析仪表征
铝箔	各种	无	用于覆盖SSD染色时的载玻片。
贝克曼·库尔特 SPRIselect（贝克曼·库尔特）	贝克曼·库尔特生命科学	B23317/B23318/B23319	SPRI珠cDNA与文库清理
漂白剂	各种	无	清洁工作站去除微生物组污染
CONSTIX 密封泡沫棉棒	康泰克	19161023	用于精准的树脂清洗
覆滑	西格玛-奥尔德里奇	BR470045-2000EA
干燥剂包	各种	无	无RNase、无尘的干燥剂包。
一次性口罩	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	12-888-001	保护、RNA酶污染及无菌
DNA擦除湿巾	西格玛-奥尔德里奇	L9060-250EA	通过擦拭表面（湿巾）进行去污
DNA LoBind 管 1.5mL	埃彭多夫	22431021	用于采集cDNA和文库后扩增。
DNA LoBind 管 2mL	埃彭多夫	22431048	用于扩增前采集cDNA。
DNBSEQ OneStep DNB 试剂套件	完整基因组学	940-001891-00	用于DNA纳米球（DNB）制备与扩增的试剂
DNBSEQ-T7RS 清洁试剂套装	完整基因组学	940-001903-00	序列完成后清洗的墨盒
DNBSEQ-T7RS DNB 装载试剂套件	完整基因组学	940-001894-00	试剂和板材将DNB装入流质单元
DNBSEQ-T7RS 测序流单元	完整基因组学	940-001902-00	1车道/流速单元
DNBSEQ-T7RS 立体序列可视化试剂套件	完整基因组学	940-001893-00	测序用的弹匣和试剂。
DNBSEQ-T7RS 系统	完整基因组学		该立体序列可视化集采用了DNBSEQ技术。测序运行始于DNA锚的杂交，然后利用组合探针锚定测序（cPAS）化学将荧光探针连接到DNA纳米球（DNB）。最后，高分辨率成像系统捕捉荧光信号。在对光信号进行数字处理后，序列器生成高质量且准确的序列信息。
尘埃脱压压缩空气	晨祷	M-6318	使用这个品牌或与类似推进剂的产品非常重要;
Edge-Rite切片机	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	4280L	组织学——用于样本切片
防爆冷冻柜	各种	无	在固定甲醇步骤前后冷却甲醇。
组织学刷	各种	无	组织学——用于样本切片
盐酸	西格玛-奥尔德里奇	2104-50ML	用于稀释预制酶，浓度为0.01 N HCl（pH 2）。盐酸溶液的标准库存浓度为0.1牛顿。
成像系统	各种	无	GC Stomics 成像仪，Lecia，Evo Revolution
Invitrogen RNaseZap RNase 去污溶液	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	AM9780	清除RNA酶污染的清洁工作站
Kimtech 精细任务擦拭器	金科技	34155	用来干燥工作台、设备、移液器等。
实验服	各种	无	个人防护装备（PPE）
透镜纸	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	11-997	各种无须洗叶干燥玻片的作品
Lookout DNA擦除湿巾	西格玛-奥尔德里奇	L9060	清洁工作站去除PCR污染
凝乳分离架 5uL - 0.2 & nbsp;	Permagen Labware	MSRLV08	用于PCR管内的珠子分离
Magjet 机架 12x1.5 mL	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	MR02	用于1.5毫升管内的珠子分离
手动旋转切片机	徕卡	RM2235	组织学——用于样本切片
甲醇 & ge;99.9%，适用于免疫荧光和高效液相色谱（HPLC）	西格玛-奥尔德里奇	34860	用于固定（需要HPLC级）
微解剖产钳	西格玛-奥尔德里奇	F4142-1EA	组织学——用于样本切片
微量移液器	各种	无
分子级无核酸酶水 非DPEC处理水	各种	无	珠子的稀释与洗脱
丁腈手套	各种	无	个人防护装备
烤箱	各种	无	烤薯条
带帽的PCR 0.2 mL管	各种	无	用于PCR应用
PCR覆盖物及nbsp;	各种	无	如果提供的保护套粘合剂薄弱，则更换
PCR罩与工作站	神秘人物	MY-PCR24-010	用于PCR前（RNA到cDNA）步骤
pH计	各种	无	pH表确认盐酸pH值。
聚L-赖氨酸溶液	西格玛-奥尔德里奇	A005-C	可选以增强组织与芯片的粘附力
量子比特4荧光仪	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	Q33226	肠胃管;DNA量子测量
量子比特 dsDNA 定量测定套件	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	Q32851	用于测量cDNA和文库定量
量子bitsDNA测定套件	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	Q10212	ssDNA染色（仅使用染料）
无RNA酶冰块	各种	无	组织学——用于切片样品以补充水分，然后再进行切片
RNaseZap RNase 去污溶液	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	AM9782	一种表面净化溶液，能破坏RNAs。
RNeasy FFPE套件	奇根	73504及19093	关于RNA提取与DV200 测量
Sculpt 超白树脂	西拉亚技术	无	耐高温紫外线固化树脂
Stereo-seq 16条码库准备套件	STOmics/完整基因组学	111KL160	用于构建立体序列 OMNI FFPE 库
立体序列FFPE配件套件	STOmics/完整基因组学	310AK002	211SN114套件中的空间OMNI配件部件
立体序列N芯片幻灯片（1cm x 1cm）	STOmics/完整基因组学	210CN114	空间全知芯片，211SN114套件的一部分
立体测序PCR适配器	STOmics/完整基因组学	301AUX001	针对PCR杂交步骤，修改为适应三个，类似于PCRmax原位杂交适配器
立体序列转录组学 N 套件	STOmics/完整基因组学	211KN114	空间OMNI摄政器2111SN114套件的一部分
外科设计 通用工业剃须刀片	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	13-812-236	组织学——用于样本切片
TE缓冲液pH 8.0	西格玛-奥尔德里奇	8890	用于洗脱cDNA和文库
热循环器	BioRad / 各种	1861096 /12015392 / 各种	PCR机带手动盖子或深井选项（T100热循环器/PTC、Tempo、深井热泵等）
Thermo Scientific Orion 一体化pH缓冲套装	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	13-624-500
组织浮选浴 - 数字 XH-1003	首播	NC0779538	组织学——用于样本切片
防紫外线眼镜	各种	无	为了紫外线固化时的安全
二甲苯	西格玛-奥尔德里奇	247642	用于脱石蜡