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方法文章

跨物种转录组的全面空间剖析 通过 Stereo-seq

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DOI：

10.3791/68619

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2025年10月31日

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1Department of Hematopoietic Biology and Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Veterinary Medicine & Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用Stereo-seq对福尔马林固定石蜡包埋组织切片中的宿主、病毒、真菌及微生物组RNA进行全方位空间转录组分析的实验方案，该技术可在保留组织结构的同时实现多种转录组的高分辨率定位。

摘要

宿主内细胞的空间组成，以及组织内的细菌或病毒载量，可能影响细胞类型与分析物之间的相互作用，从而驱动细胞经历特定于细胞类型的生物学过程。用于FFPE组织的Stereo-seq技术采用随机引物对空间条形码进行扩增，这与标准的空间转录组学方法不同——后者通常利用A尾捕获信使RNA（mRNA），或基于探针捕获物种特异性转录本。这些传统方法未能充分纳入当前关于其他类型RNA（如长链非编码RNA、线粒体RNA、微小RNA等）在生物学中所起作用和重要性的最新认知。 其他物种， RNA，例如微生物、病毒和真菌来源的RNA。本文概述了一种从组织切片到文库构建的逐步操作流程，用于基于随机探针法检测RNA的空间性、物种无关的Stereo-seq技术，该方法适用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。该Stereo-seq技术采用直径为0.22 µm的随机捕获微珠，微珠在阵列中每隔0.5 µm重复排列，从而实现基于测序技术的亚细胞分辨率。由于该方法可同时检测宿主与非宿主RNA，因此本实验方案需特别考虑如何区分存在于组织内部的RNA与在样本采集、保存、切片及检测过程中沉积于组织表面的RNA（即环境及操作污染来源的RNA）。最后，本方案使研究者能够 在空间背景下实现对多种RNA物种的高分辨率（单细胞水平）检测，有助于揭示细胞类型及病理相关物种的细胞内与细胞间相互作用组。

引言

空间组学技术通过实现对多种靶标——DNA（基因组学）、RNA（转录组学）、代谢物（代谢组学）或蛋白质（蛋白质组学）——的同步定量，彻底改变了组织细胞异质性的研究。1不同检测方法的分辨率往往存在差异，因而在检测分析物时具有不同的局限性，例如在进行单细胞测定时可能导致数据稀疏性增加2,3 或天然空间环境4相比之下，RNA测序等整体方法仅能提供整个样本的平均基因表达水平，从而掩盖了细胞间的异质性2，或单细胞RNA测序（scRNA-seq）2,3，该方法需要对组织进行解离以实现单细胞测序，通常需要过滤步骤。因此，这些方法会排除大尺寸细胞和细胞聚集体，而生物信息学方法则试图去除碎片和双细胞（doublets），这些处理均会引入偏差5,6,7空间转录组学可保留组织结构，为细胞的组织方式和相互作用提供关键见解。大多数非靶向性空间测序方法不具备单细胞分辨率，因此需要对包含10至100个细胞的空间捕获区域进行解卷积分析。8,9,10然而，在过去十年中，随着分辨率的提升，空间转录组学的发展已超越了这些方法的需求。 更大的捕获区域，以及多组学方法的整合，无论是通过实验策略还是新技术手段1,11,12.

空间增强分辨率组学测序（Stereo-seq）具有纳米级分辨率（500 nm）和厘米级的捕获区域，其不依赖物种的全转录组捕获能力可同时捕获编码RNA、非编码RNA以及非宿主RNA13。该方法目前是空间转录组学中分辨率最高的技术，并可提供最大的视野范围。然而，该方法也存在一些显著局限性，例如需要约15小时的动手操作时间，整个测序文库构建过程需历时4天。相比之下，其他基于测序的空间转录组学技术，如基于探针的空间转录组学、基于polyA捕获阵列的空间转录组学、Slide-seq以及组织中用于空间组学测序的确定性条形码技术（DBiT-seq），通常仅需5至8小时的动手操作时间，耗时2至3天即可完成（表1）。对许多研究人员而言，这些技术的优势超过了其技术挑战，特别适用于结合其他技术，构建全面的空间转录组图谱，以在细胞和亚细胞水平上研究疾病进展过程1。

Stereo-seq 技术的应用潜力超越了依赖 poly-T 探针捕获 polyA 尾 mRNA 转录本的传统 mRNA 转录组学。这些传统方法可通过向新鲜组织中添加 polyA 化处理14，或使用针对预定义基因集合的物种特异性探针15，实现空间表达分析。而 Stereo-seq 则采用随机核苷酸探针，能够无差别地富集来自不同物种的多种 RNA，包括微生物 RNA、真菌 RNA、病毒 RNA，以及非 polyA 尾 RNA，例如增强子 RNA、环状 RNA 和长链非编码 RNA（lncRNA）16。理论上，该技术也有望捕获更小的 RNA 分子或可移动遗传元件，如小干扰 RNA（siRNA）、微小 RNA（miRNA）和转座子17。然而，目前这些 RNA 的生物信息学分析与序列比对仍具挑战性，在初始比对过程中通常会被过滤掉 ，其 通常 采用 30 bp 作为截断阈值。

本文概述了一种详细的实验方案，该方案对制造商在DNA纳米球（DNB）芯片上进行随机核苷酸捕获的技术进行了优化改进，旨在帮助更好地理解与操作如图1所示的Stereo-seq流程。本方案为分子生物学家提供了在Stereo-seq中使用随机核苷酸捕获技术测试新型FFPE组织样本的策略，以从质量较低的存档样本及脂肪组织中获得更一致且更高的产出。所描述的方案已针对多数器官来源的FFPE样本（无论物种）进行了优化。然而，该方案未包含处理骨髓等难处理组织所需的当前改进措施，此类组织需进行脱钙处理。

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方案

本方法学论文未提供未经治疗的高级别浆液性卵巢癌患者样本的临床数据。然而，相关临床数据是根据德克萨斯大学MD安德森癌症中心妇科肿瘤学与生殖医学系机构审查委员会（IRB）批准的方案，从签署书面知情同意书的参与者处收集的。

注意：建议在整个实验过程中佩戴外科口罩和手套，以防止 RNase 污染。长发研究人员建议将头发扎起，或佩戴发网。始终使用无菌、无核酸酶的水（NFW）以及无核酸酶、低吸附的 DNA/RNA 管，以最大化得率。非哺乳动物组织（如植物组织）可能需要优化贴附条件，包括使用多聚-L-赖氨酸（PLL）并延长透化时间，以应对细胞壁的影响。尽管分子捕获在理论上仍可行，但由于植物组织尚未在本实验流程中进行测试，仍需实验验证。

1. 评估RNA质量和RNA片段分布值200分

  1. 使用RNA片段分布值200（DV200）评估RNA质量，该值用于测量长度大于200 bp的RNA所占的百分比。
  2. 从拟用于Stereo-seq处理的同一组织块中取两个10 µm的切片。
    注意：最佳方案是立即进行处理，但样品也可在4 °C下保存最多1周，-20 °C下保存4周，或-80 °C下保存6个月。
  3. 采用Patel等人18所述的非片段大小选择性RNA提取方案提取RNA，以准确评估RNA片段大小的分布情况。
  4. 使用以下任一方法，通过片段分析仪测定DV200评分，即代表长度大于200 bp的RNA片段的曲线下面积百分比。理想情况下，组织样本的DV200评分应（> 50%）且浓度应（> 10 ng/µL）。

2. 工作区清洁

  1. 使用30%的漂白剂清洁所有表面。让表面干燥至少30分钟，以防止漂白剂与乙醇混合后生成氯仿。
  2. 用DNA去污染湿巾（DDW）擦拭表面。用RNase去污染溶液（RDS）喷洒所有表面，然后使用NFW配制的70%乙醇进行喷洒。
    注意：切勿混合漂白剂或任何其他酒精。这种组合会产生氯仿，氯仿具有高度毒性，即使在低浓度暴露下也可能导致意识丧失、器官损伤或死亡。

3. 空间增强型随机寡核苷酸捕获芯片（N-chip）制备

  1. 按照步骤 2.1 和 2.2 所述清洁工作区，包括本步骤中使用的所有系统。
  2. 从包装中取出 Stereo-seq N 芯片，记录芯片 ID，并用 100% 乙醇清洁 Stereo-seq N 芯片和载玻片的边缘，注意不要触碰芯片表面。让其完全自然晾干。
  3. 涂抹树脂以将芯片固定在载玻片上（仅对使用二甲苯的用户为可选步骤）。
    注意：尽管商业供应商通常推荐非二甲苯透明剂，但观察发现，非二甲苯透明剂的效果可能因石蜡混合物的不同而降低。它们通常与某些塑料、合成树脂或蜂蜡包埋组织不兼容，且无法高效清除高度交联或高熔点的石蜡。如果不确定样本包埋所用石蜡的成分，建议使用二甲苯以获得最佳透明效果。此外，二甲苯在清除脂肪组织（如乳腺、卵巢、卵子或脑组织）方面效果更佳。
    1. 充分摇匀或混合树脂，确保其呈均匀的白色。 使用微量移液器，小心地在 Stereo-seq N 芯片边缘周围施加 10 µL 紫外光固化陶瓷树脂（图 2A）。
      注意：树脂可能引起皮肤和眼睛刺激，并在反复接触后导致过敏性皮肤反应。在移取或操作该树脂时，务必佩戴腈手套、护目镜和实验服。应在通风良好的区域操作，使用大量树脂或加热溶液时应佩戴口罩，避免与皮肤或眼睛直接接触。
    2. 使用密封泡沫棉签去除多余的树脂，仅在芯片边缘留下一条细线。将载玻片放入紫外固化仪中，注意不要触碰芯片表面。
    3. 将涂有树脂的芯片置于 405 nm 紫外光源上的一块不透光遮罩上方，使紫外光从载玻片背面照射，固化 5 分钟。如 图 2B 所示。
      注意：切勿使 Stereo-seq N 芯片过度暴露于紫外光下，也不要触碰芯片表面的树脂，否则可能对纳米球造成不利影响。
    4. 固化完成后，使用分别浸透以下液体的密封泡沫棉签依次清洁树脂涂抹区域的边缘：100% 分子级乙醇、70% 乙醇，最后为无核酸酶水（NFW）。若发现有白色斑点脱落，需再次清洁边缘。切勿触碰芯片表面（图 2C）。
    5. 让载玻片完全自然晾干。检查后，如需保存，可将芯片连同干燥剂一起在 4 °C 下存放过夜。但建议尽可能立即进行后续的芯片制备和切片操作。
      注意：使用紫外光时，务必穿戴适当的个人防护装备，包括防紫外线护目镜。乙醇和树脂应在通风良好的区域操作，最好在通风橱内进行。废弃物应按照机构规定妥善处理。
  4. 使用多聚-L-赖氨酸（Poly-L-lysine）进行芯片制备 （仅对脂肪组织或粘附性差的组织为可选步骤）。
    1. 按照步骤 2.1 和 2.2 所述清洁工作区，包括本步骤中使用的所有系统。
      注意：切勿将化学品直接喷入 PCR 仪内。所有 PCR 前步骤应尽可能在 PCR 操作台中进行，以防止污染，包括避免之前 cDNA 的扩增产物污染。
    2. 使用 50 mL 锥形管，将芯片在新鲜的无核酸酶水（NFW）中浸没三次。
    3. 使用压缩空气干燥芯片，从距离芯片表面约 5 cm 处，以大约 60° 至 80° 的角度沿对角线（45°）方向，用最大气流吹干芯片表面（图 2E）。若表面呈现浑浊，需用新鲜 NFW 重新清洗并再次干燥（表面浑浊通常表明陶瓷在前序步骤中未充分清洗或未完全固化  ）。
    4. 在芯片整个表面施加 150 µL PLL 溶液。在室温（22 °C 至 25 °C）下孵育 10 分钟。如 图 2D 所示。
    5. 移除 PLL 溶液，并用无核酸酶水清洗芯片两次，每次 10–15 秒。
    6. 第二次清洗后，小心擦干载玻片边缘（切勿触碰芯片）。
    7. 使用压缩空气彻底干燥芯片，从距离芯片表面约 5 cm 处，以大约 60° 至 45° 的角度沿对角线方向，用最大气流吹干芯片表面（图 2E）。
      注意：芯片必须在 30 秒或更短时间内完全干燥。若耗时更长，DNB 将受到影响，导致捕获过程中出现伪影。
    8. 应在 1 小时内进行后续贴片操作，并保持芯片干燥。
      注意：若干燥后芯片表面呈现浑浊，需用新鲜 NFW 清洗并重复干燥过程。若干燥后芯片表面出现伪影，可能导致这些区域的捕获失败。若组织无需使用 PLL 粘附，则应避免使用。触碰芯片可能导致划痕，并在 cDNA 释放前造成捕获区域丢失，或在释放后导致捕获不均。芯片表面残留树脂会导致斑点状捕获区域丢失。若芯片距离压缩空气喷嘴过近，可能在芯片表面形成晶体或喷溅出受损 DNB 标记；但这种情况较为罕见，通常仅在喷嘴几乎接触芯片且压缩空气罐温度过低时发生。建议使用评估芯片多次练习此操作，因为该步骤技术难度较高。

4. 组织切片与封片

  1. 确保工作区域清洁，具体操作如步骤 2.1 和 2.2 所述。在组织切片和贴片过程中，所有水浴和冰浴均应使用新刀片和无核酸酶水（NFW）。切勿直接触碰芯片，且组织覆盖芯片面积不得超过 80%。
    注意：标准组织建议切片厚度为 5 µm，高脂肪组织建议为 4 µm。若适用，可使用连续切片条带以实现不同样本间检测模式的匹配。
  2. 将载玻片置于 42 °C 条件下干燥 3 小时，可使用烘箱或打开盖子的 PCR 仪。随后将载玻片转移或将烘箱或 PCR 仪温度调至 37 °C，继续烘烤过夜 12–48 小时。建议烘烤时间约为 18 小时。
  3. 可选暂停点：干燥后，可将载玻片密封于含干燥剂的铝箔袋中，于 4 °C 保存最多 1 周后再继续后续操作。
    注意：干燥时间过长可能降低 RNA 完整性；干燥时间过短会导致组织与载玻片粘附性降低。较高温度烘烤可能影响 RNA 完整性。载玻片可外送进行后续处理（如宿主分析），但不建议用于微生物组分析，因运输过程中污染风险增加。

5. 脱蜡切片

  1. 确保工作区域清洁，具体操作如步骤 2.1 和 2.2 所述。
  2. 准备脱蜡和 Stereo-seq 实验所需的试剂。
    1. 分装所需试剂：在 50 mL 锥形管中分别加入两份 30 mL 二甲苯，以及两份 30 mL 100% 乙醇。
    2. 使用 NFW 配制以下稀释试剂：每张芯片需 96% 乙醇（需 2 个锥形管或 1 mL）、90% 乙醇、80% 乙醇、70% 乙醇、50% 乙醇、30% 乙醇；从 20x 溶液中配制 2.5 mL 5x 盐酸钠-柠檬酸钠（SSC）缓冲液；配制 5 mL 0.01N HCl（将 0.1N HCl 用 NFW 稀释至 pH 2）。对于乙醇梯度稀释液，若使用硅胶垫圈，可在 50 mL 锥形管中配制一份 30 mL 溶液，或在 1.5 mL 离心管中配制 500 µL 溶液。
    3. 配制以下溶液并置于冰上保存：i) 从 5x 溶液中配制 32.5 mL 0.1x SSC 缓冲液（将 30 mL 溶液保存在锥形管中，另取 2.5 mL 置于 5 mL 管中备用）；ii) 400 µL 含 5% RI 的 0.1x SSC 溶液，置于冰上保存。
    4. 使用 0.1 N HCl 配制以下稀释试剂。
      1. 通过向商业提供的冻干试剂中加入 1 mL 0.1 N HCl，配制 10x 通透化试剂（PR）溶液。
        注意：仅可在冰上保存 1 小时，务必分装后用于后续实验，并于 -20 °C 冷冻保存。
      2. 配制 500 µL 1x PR 溶液（将 10x PR 溶液分装液用 0.01 N HCl 稀释，可在冰上保存最多 6 小时）。
        注意：0.01 N HCl 的 pH 值必须在 pH 2.0 的 ±10% 范围内，因为胃蛋白酶类酶在 pH 2 时活性最佳。
  3. 通过将载片浸入二甲苯中（推荐方法）进行脱蜡处理，每次 20 分钟，共 2 轮。
  4. 立即使用乙醇对样本进行梯度水化（100%、96%，各 2 轮，每轮 5 分钟；随后依次为 90%、70%、50% 和 30%，各 1 轮，每轮 2 分钟）。最后用 NFW 水化 1 分钟。对于乙醇梯度稀释液，若制备微生物组研究样本，每张载片使用 50 mL 锥形管中的 30 mL 溶液；若制备非微生物组样本，则每两张载片使用 30 mL 溶液。后续所有稀释步骤中，均使用 50 mL 锥形管配制 30 mL 溶液；若使用硅胶垫圈，则每 1 cm2 芯片使用 500 µL 溶液以完全覆盖芯片区域。
    可选：建议在完成 100% 乙醇处理步骤后，在芯片周围放置一个来自三腔移除载片的硅胶腔室以形成密封，如 图 2F-H 所示。此方法可减少试剂用量，并降低芯片损伤风险。或者，也可在整个实验过程中使用 50 mL 锥形管将 Stereo-seq 载片完全浸没于试剂中。

6. （可选）核成像与单链DNA染色

注意：在步骤 6.1 中使用前，需使 FFPE 脱交联试剂达到室温 ( ~25 °C)。可使用其他染色溶液，但目前单细胞转录组数据的单细胞分割和细胞分箱仍需进行荧光核染色。

  1. 使用单链DNA（ssDNA）染料进行荧光染色
    1. 按每1至2个芯片取2 µL单链DNA染色溶液，用5x SSC缓冲液以1:1比例稀释Qubit ssDNA试剂，制备SSC缓冲液中的单链DNA染色工作液。 
      注意：ssDNA 稀释度可根据成像所用显微镜的不同而调整。因此，使用新显微镜时，应通过评估芯片和测试组织对 ssDNA 荧光染料的系列稀释进行测试，以确定最佳动态范围。
    2. 配制染色溶液的主混合液（每张芯片200 µL），其中RNase抑制剂（RI）按1:20稀释，ssDNA稀释液按1:200稀释，其余成分为5x SSC。
    3. 加入染色液（每张芯片150 µL），室温避光孵育5分钟。使用移液器从芯片边缘轻轻吸除染色液。
      注意：如果使用可拆卸硅胶腔室，在用单链DNA染料混合物对芯片染色前，需先将其移除。
    4. 用 0.1x SSC 缓冲液（每次 150 µL）清洗芯片两次，每次 10–15 秒。第二次清洗后，用镜头纸小心擦干载玻片边缘（勿触碰芯片）。
    5. 加入约 3–5 µL 甘油（若使用倒置显微镜，则用量减少）以封固盖玻片 （注意避免气泡）。
      注意：确保将正确体积的甘油应用于载玻片区域，通常对于1 cm的区域约为4 µL2 芯片。使用过多的甘油可能导致载玻片垂直放置时盖玻片发生移位；使用过少的甘油则会在移除盖玻片时增加组织损伤的风险，并可能引入气泡，从而对成像和单细胞分割结果产生不利影响。
    6. 从约1厘米高度将盖玻片滴落至芯片上。若使用倒置显微镜，确保盖玻片在垂直放置时不会滑落。 如果在不添加更多甘油的情况下重新安装成功。
    7. 使用宽场显微镜对经ssDNA染色的组织进行荧光成像，图像 tile 之间重叠10%。
      注意：建议使用10倍物镜在宽场显微镜下手动进行9至13个点的聚焦成像。也可使用共聚焦显微镜，但其对组织和芯片间焦点变化更为敏感。
    8. 使用ImageJ等图像处理软件进行拼接，利用理论重叠确定每幅图像的近似位置，随后通过像素匹配的计算重叠实现图像拼接的精细校正
    9. 在 StereoMap 软件中处理图像，并确保图像质控通过后再继续后续步骤。
    10. 将 Stereo-seq 芯片浸入 30 mL 0.1x SSC 溶液中，直至盖玻片脱落 分离。

7. 解交联过程

注意：此步骤中避免触碰或倾斜芯片，并轻柔地进行移液操作。

  1. 确保FFPE脱交联试剂处于温暖的室温条件  (~25 °C)，并检查溶液中无颗粒导致浑浊。若可见颗粒， 需将试剂加热至55 °C，再冷却至30 °C后使用。
  2. 开启PCR仪，并设置如下程序：30 °C平衡（热盖温度85 °C）；95 °C孵育30分钟；4 °C无限保持。
  3. 组装样品盒垫圈，然后将Stereo-seq芯片载玻片放入样品盒中。
  4. 向含有芯片的 样品盒孔中加入FFPE脱交联试剂（每张芯片400 µL）。用封口膜密封 样品盒，并确认密封严密。
  5. 从步骤7.2开始95 °C孵育30分钟。孵育进行10分钟后，将10 mL甲醇置于15 mL容器中（每张载片约需1 mL），放入-20 °C冰箱预冷。
  6. 小心地从PCR仪中取出芯片，将 样品盒转移至实验台，撕去封口膜。
  7. 使用移液器移除并弃去FFPE脱交联试剂。待所有脱交联试剂完全移除后，拆下并丢弃样品盒和垫圈。
  8. 将Stereo-seq载玻片平衡至室温（约23 °C）。在无菌通风橱内，擦干载玻片边缘，并安装新的硅胶腔室（如适用）。加入500 µL来自-20 °C冰箱的预冷甲醇，确保整个组织区域完全浸没 20分钟。
    注意：也可将整张Stereo-seq载玻片浸入装有30 mL预冷甲醇的50 mL锥形管中。
  9. 在甲醇固定结束前约5分钟（步骤7.8），将1x PR溶液置于37 °C干式金属浴中预热10分钟，以备使用 。
  10. 固定完成后，将载玻片转移至无菌通风橱。擦去载玻片表面多余甲醇，并等待芯片上残留甲醇完全挥发 （约5分钟）。组装新的样品盒和垫圈。待甲醇完全挥发后，将Stereo-seq芯片载玻片放入样品盒中。

8. 透化与逆转录

注意：执行步骤 8.1-8.11 时，应缓慢移液，切勿触碰芯片。过大的压力会导致 DNB 扩散或产生痕迹。

  1. 向芯片中加入 200 µL 通透化试剂。将密封胶带贴至 Stereo-seq 载玻片盒上，并确保其密封严密。
  2. 在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  3. 通过为每张载玻片加入 380 µL 0.1x SSC 和 20 µL RI（RNA 抑制剂）来配制洗涤缓冲液。每张载玻片配制 400 µL，并置于冰上保存直至使用。
  4. 取出 FFPE 逆转录（FFPE RT）所需试剂，短暂离心以下所有试剂，并将酶混合液、寡核苷酸和二聚体置于冰上。将 FFPE RT 缓冲液恢复至室温（约 23 °C）。
  5. 在通透化步骤结束前 5 分钟，为每张芯片配制 200 µL FFPE RT 混合液。加入 FFPE RT 缓冲液（158 µL）、FFPE RT 酶混合液（30 µL）、FFPE RT 寡核苷酸（10 µL）和 FFPE 二聚体（2 µL）。轻轻混匀后置于冰上保存。
  6. 将芯片保留在热循环仪中，将孵育温度调整至室温（约 23 °C）。移除密封胶带，并小心弃去 1x PR 溶液。
  7. 用每 1 cm2 芯片 200 µL 的 0.1x SSC（含 5% RI）极其轻柔地洗涤芯片。
  8. 从芯片的角落移除 0.1x SSC（含 5% RI）洗涤液。
  9. 向芯片的角落加入 200 µL FFPE RT 溶液。
  10. 将密封胶带贴至 Stereo-seq 载玻片盒上，并确保其密封严密；否则蒸发 会降低 产量。
  11. 启动 FFPE RT 孵育等温反应程序：42 °C 反应，加热盖温度为 45 °C，反应时间为 5 至 24 小时。
    注意：建议孵育 12 至 16 小时，并在各实验间保持一致。

9. cDNA 的释放与纯化

注意：执行步骤 9.6-9.7 时，应缓慢移液，切勿触碰芯片。过大的压力会导致 DNA 纳米球（DNBs）发生扩散或产生痕迹。

  1. 通过将cDNA释放缓冲液在55 °C下温育以溶解可能形成的任何沉淀物，制备400 µL的cDNA释放缓冲液。
  2. 将cDNA释放缓冲液平衡至 温 室温度（25 °C），切勿置于冰上。
  3. 使用前，在台式离心机中以100 x g 离心cDNA释放缓冲液和cDNA释放酶。
  4. 通过将20 µL释放酶加入380 µL cDNA释放缓冲液中，制备cDNA缓冲液。
  5. 保持芯片在热循环仪中，将孵育温度改为室温（约23 °C）。移除密封膜，并小心移除并弃去FFPE RT溶液。
  6. 用每张芯片0.1x SSC（200 µL）极其轻柔地洗涤芯片一次。
  7. 从芯片角落小心吸出0.1x SSC，移液时需格外谨慎。
  8. 向每张芯片中加入400 µL已配制的cDNA释放溶液。
  9. 通过将密封带（或PCR盖）贴到盒中，密封Stereo-seq载片盒。确保盒体密封严实，防止任何 蒸发、 泄漏或污染。
  10. 在55 °C下孵育≥ 5 h（最短5 h，最长可达24 h），盖子温度加热至60 °C。
    注意：建议孵育5至7 h，或在各实验间保持一致的2 h孵育时间。

10. 收集 cDNA 释放混合液

  1. 将NFW预热至37 °C（每张1 cm2芯片至少500 µL）。
  2. 移除封片，用移液器在芯片的每个角落及中心区域（位于组织上方）剧烈吹打，但不得刮擦或接触组织。收集芯片上的全部cDNA释放混合液，并转移至1.5或2.0 mL离心管中。在每根离心管上记录芯片编号（chip ID）。
  3. 直接向芯片表面加入350 µL预热的NFW。再次使用较小量程的移液器（P100或P200）剧烈吹打，倾斜枪头以增加剪切力，但不得接触组织或刮擦芯片。
  4. 将步骤10.3中的洗涤液（350 µL）与步骤10.2中的cDNA释放混合液（400 µL）合并。确保仅合并来自同一芯片的样品。
  5. 在芯片上加入100 µL NFW，将Stereo-seq芯片载玻片密封于盒中，置于冰箱中保存直至实验流程结束。
    注意：若产量较低，可考虑重新进行cDNA释放。可通过ssDNA染料染色，并在加盖或不加盖玻片的情况下重新成像，以评估芯片上是否残留DNA。

11. 收集 cDNA 磁珠纯化产物

  1. 将第10.4步的cDNA用等体积的固相可逆固定化（SPRI）磁珠重悬。混匀至磁珠在溶液中均匀分布，以筛选长度大于约100 bp的DNA片段。
  2. 在27 °C至37 °C温度下孵育10分钟（推荐30 °C）。
    1. 孵育期间，每处理2个芯片，准备5 mL用NFW配制的新鲜80%乙醇。
  3. 取含有孵育后磁珠混合物的离心管，在台式离心机上以100 × g 短暂离心。
  4. 将离心管置于磁力架上，孵育至少5分钟（直至液体变澄清）。
  5. 小心移除上清液，避免扰动磁珠，并将上清液保存至洁净且已标记的离心管中。使用芯片编号和日期标记cDNA洗脱液。
  6. 向离心管中加入1.5 mL 80%乙醇，避免扰动磁珠，孵育30秒后去除乙醇。
  7. 重复步骤11.6一次，此次使用小吸头尽可能彻底去除乙醇，同时避免扰动磁珠。
  8. 将离心管中的磁珠在空气中干燥，直至磁珠表面不再反光。干燥时间因环境而异，请定期检查，防止过度干燥（出现裂纹），否则会导致产量降低。
    注意：测量室内的湿度和温度。在高温（27 °C）和低湿度（低于20%）条件下，磁珠干燥速度很快（3至5分钟）；在低温（23 °C）和高湿度（高于40%）条件下，磁珠干燥较慢（7至15分钟）。
  9. 将磁珠离心管从磁力架上取下，加入22 µL NFW，通过涡旋振荡充分混匀。
  10. 在干式恒温仪或PCR仪中于27 °C孵育5至15分钟。
  11. 短暂离心后，将离心管放回磁力架，静置至液体澄清（2至5分钟）。
  12. 将含有cDNA的21 µL上清液转移至已标记样品信息的0.2 mL PCR管中，避免扰动磁珠。
  13. 对每个离心管重复步骤11.9至11.12，共收集42 µL cDNA。随后立即进行cDNA扩增（步骤12.1至12.8）。
    注意：延迟启动扩增将导致产量降低、短读长片段增加以及单链DNA模板降解。

12. cDNA 扩增

  1. 从冰箱中取出cDNA扩增混合液和FFPE cDNA引物，置于湿冰上融化。
  2. 将cDNA扩增混合液和FFPE cDNA引物在台式离心机中以约100 × g 离心沉降。
  3. 向来自步骤11.13的每管42 µL cDNA中加入50 µL cDNA扩增溶液和8 µL FFPE cDNA引物，并放入配备平盖适配器的热循环仪中，以防止管体变形。
  4. 运行cDNA扩增的热循环程序：初始变性：95 °C 5分钟；循环扩增：[98 °C 20秒，58 °C 20秒，72 °C 3分钟] × 15个循环；最终延伸：72 °C 5分钟；保存温度：12 °C（若立即进行后续操作）或4 °C（若过夜保存）。
  5. 使用1 µL cDNA在磁珠纯化前后测定DNA浓度。
    注意：纯化前的cDNA产量应计算为每1 cm²芯片超过1 µg。纯化后的浓度应至少达到10 ng/µL。产量较低通常与文库多样性降低相关。此阶段显著的样品损失与DV200评分相关；然而，DV200并非结果的完全预测指标。
  6. 参照步骤11（磁珠纯化）重复cDNA磁珠纯化操作，使用步骤12.4中的PCR产物，并进行三项修改：使用小型PCR磁力架，在步骤11.6中仅加入200 µL 80%乙醇，步骤11.9中用22 µL Tris-EDTA（TE）缓冲液（pH 8）重悬。
  7. 将磁珠储存于含有20 µL NFW的离心管中，并标记样品名称、条形码、日期和芯片编号。
  8. 使用片段分析仪检测cDNA片段分布。片段大小应在250–400 bp之间。若片段过小，可重复磁珠纯化步骤，但将温度由27 °C改为室温（约25 °C）。
    可选暂停点：cDNA测定后可在-20 °C保存最长1个月，或在-80 °C保存最长1年。磁珠可在4 °C条件下于NFW中保存1周，切勿冷冻磁珠。

13. 文库构建（第4天）

  1. 扩增反应体系配制
    1. 取出文库PCR扩增溶液、文库条形码试剂盒、cDNA产物和无核酸酶水（NFW）。将cDNA和试剂在冰上或室温水中融化，随后以100 × g 离心10秒。
  2. 为每25 µL PCR条形码引物混合液确定文库条形码策略。
    注意：对于该测序仪，每个条形码集合中每个位置的碱基必须均等表示。因此，大多数与此兼容的商业试剂盒均设计为预定义的条形码四联体（每组四个）。当在测序通道中分配多个样本时，这些四联体可分别用于各个样本；当每个通道测序一个样本时，也可将多个四联体混合用于单个样本。保持条形码平衡至关重要，因为不平衡的条形码会降低测序仪生成的可用数据量。
  3. 根据20 ng的量计算所需cDNA体积（例如，若浓度为10 ng/µL，则需2 µL）。 使用该体积配制含稀释后cDNA的NFW（25 μL）溶液 （稀释至约1 ng/μL）。
  4. 将文库扩增混合液（50 µL）、稀释后的cDNA-NFW溶液（25 µL）和PCR条形码引物混合液（25 µL）加入0.2 mL PCR管中。
  5. 用移液器充分混匀，并以100 × g 离心10秒。（切勿涡旋震荡）
  6. 将0.2 mL PCR管放入热循环仪中，并确保使用适配插件以防止管子受压破损。
  7. 运行cDNA扩增的热循环程序：初始变性：95 °C 5分钟；循环扩增：[98 °C 20秒，58 °C 20秒，72 °C 3分钟] × 8个循环；最终延伸：72 °C 5分钟；保存温度：12 °C（若立即处理）或4 °C（若过夜保存）。
    注意：可用于文库制备的cDNA投入量可在一定范围内变化。然而，投入量将影响扩增所需的PCR循环数。例如，厂商推荐使用20 ng的输入DNA并进行8个循环。也可使用40 ng输入DNA配合7个循环，或80 ng输入DNA配合6个循环。不建议使用少于20 ng或多于80 ng的cDNA作为起始量。

14. 文库扩增磁珠纯化

  1. 按照步骤12.5的方法对原始文库产物进行定量。
  2. 重复步骤11（磁珠纯化）的操作，使用步骤13.7中获得的原始文库产物，并进行以下三项修改：使用0.8:1的磁珠与产物比例，使用更小的PCR磁力架，步骤11.7中使用200 µL 80%乙醇（相比原步骤减少用量），并在步骤11.9中用22 µL TE缓冲液（pH 8）重悬。每处理两片1 cm2芯片，需准备约1 mL新鲜配制的80%乙醇。
  3. 可选暂停点：文库定量后可在-20 °C保存长达1个月，或在-80 °C保存长达1年。磁珠可在NFW中于4 °C保存1周，切勿冷冻磁珠。

15. 用于 Stereo-Seq 随机寡核苷酸引物 DNB 测序的 DNBSEQ-T7RS 系统

  1. 在 DNBSEQ-T7RS 系统上使用 PE75 试剂盒，将循环数分配为 Read 1 25 个循环和 Read 2 62 个循环（PE25+62），随后进行 10 bp 的索引读取：
    1. 第一轮测序（25 个循环的 Read 1）捕获基于芯片的条形码中的空间芯片标识符（CID）或位置特异性信息。
    2. 第二轮测序（62 个循环的 Read 2）捕获分子标识符（MID），该标识符为一段随机的 6 bp 序列，直接连接在基因插入片段上；其中额外使用 3 个暗循环用于相位校正和条形码偏移校准。随后从 Read 2 中获得 30–59 bp 的基因插入片段，通过比对至已知基因组或转录组进行鉴定。
      注意：更长的基因插入片段是可行的，但需要使用不同的双端测序试剂盒，并对比对分析流程进行相应修改。
    3. 用于样本解复用的索引循环基于第 13.2 步中混合的测序条形码，覆盖 10 个碱基（bp）。
      注意：75 PE 流通池的典型测序时间约为 10–12 小时。测序通常在测序核心实验室或商业测序服务机构完成，大多数实验室不自行开展，因为该过程需要 DNBSEQ-T7RS 或类似的测序仪器。

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结果

以下数据展示了利用SAW分析流程对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片中的非多聚腺苷酸化RNA（如tRNA（TRDMT1））进行单细胞分割及定位的能力。Stereo-seq提供的无偏倚数据使研究者不仅能够分析mRNA，还可系统评估tRNA、rRNA以及非宿主RNA（如适用）的功能重要性。分析直接采用SAW流程的原始输出结果16 以及用于 Stereo-seq 输出质量评估的 stereopy 图3A- G我们从细胞分箱（即生成的单细胞核叠加图像）中生成了标准的空间概览图、基因表达图以及聚类和质控结果 通过 锯切核图像）。检测到的转录本数量因组织类型而异：免疫细胞密集的组织通常表现出较低的转录本计数（每个细胞bin约100个基因），而非整倍体肿瘤细胞每个细胞bin可多达1,000个转录本。请注意，该样本的聚类仍需通过生物信息学分析以确定聚类身份，因为SAW的默认分辨率非常高（0.8至1），建议使用如stereopy等...

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讨论

Stereo-seq 方案非常详细，包含多个关键步骤，需要精确的操作、严格的时间控制以及洁净的环境，以确保实验成功，尤其是在进行微生物组或非宿主分析时，可能需要采取特定的预防措施。

所有步骤中均需使用无核酸酶水，且捕获芯片只能接触样本和试剂，不得被其他任何物品触碰。使用盒式组件时需格外小心，建议先利用练习芯片进行操作练习。组织区域的划痕会破坏组织的空间分辨率，而轨道线上的划痕则可能导致空间分辨率受损或样本无法自动对齐。此外，对于RNase/DNase含量较高的组织（如胰腺或肝脏），建议在切片过程中定期更换水。另外，为保持RNA质量，建议将FFPE组织块切面用少量石蜡密封后，于4 °C干燥器中保存，以防止降解。若以此方式储存，使用前仍需对样本表面进行再水合处理，并平衡至切片室温度25,26,27。切片室温度应控制在22至25 °C。此外，最适合进行Stereo-seq分析的样本其DV200值应高于5...

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披露

作者声明本研究未获得华大基因的资助。然而，华大基因正在支持本文发表的相关费用。  作者未向其提供文章提前副本，也未允许其对内容进行干预。

致谢

本研究部分由卵巢癌研究联盟（OCRA 811621 和 891490）、Sie 基金会以及 Stephanie C. Stelter 基金会资助。本研究与兽医医学系流式细胞术和细胞成像核心设施合作完成。 & 外科与先进基因组学技术核心，部分由美国国立卫生研究院通过MD安德森癌症中心支持基金P30 CA016672以及Jared Burks获得的美国国家癌症研究所研究专家奖1 R50 CA243707-01A1资助。

我们还要感谢Complete Genomics公司，特别是Brandon Vanderbush和Tanzeen Yusuff在技术培训和故障排除方面提供的支持，同时感谢Jia "Jackie" Zhao、Yongfu Wong和Erin Petrilli。作者从Complete Genomics公司以优惠价格获得了一套FFPE OMNI和测序试剂，以及T7早期使用计划的访问权限。此外，部分试剂由该公司免费提供，用于本研究。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管，普通DNA酶/RNA酶赛默飞世尔科技 / 英维特罗根3456混合试剂（其他条带也可） 
100% 乙醇Sigma-AldrichE7023分子生物学级
15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管赛默飞世尔科技 / 英维特罗根339650用于分装 
20倍浓缩液 盐水柠檬酸钠（SSC）缓冲液Sigma-AldrichS6639-1L用于配制染色用的5X SSC以及洗涤步骤和盖玻片去除用的1X SSC。
2100 Bioanalyzer 仪器安捷伦已停用仪器：Bioanalyzer
3孔培养板，可拆卸Ibidi80381用于减少再水化和甲醇固定过程中液体体积的硅胶室
405 nm 紫外光源各种N/A用于固化紫外光树脂
50 mL 无菌聚丙烯锥形离心管赛默飞世尔科技 / 英维特罗根339652用于分装和脱蜡 
70% 无菌异丙醇酒精Texwipe TX3270用于表面去污染 
安捷伦高灵敏度DNA试剂盒安捷伦5067-4626用于cDNA和文库的Bioanalyzer表征
安捷伦 RNA 6000 Pico 试剂盒安捷伦5067-1513用于RNA的Bioanalyzer表征
铝箔各种N/A用于覆盖载玻片，以进行单链DNA染色。
Beckman Coulter SPRIselect贝克曼库尔特生命科学 B23317/B23318/B23319SPRI磁珠cDNA及文库纯化
漂白剂各种N/A清洁工作台以去除微生物组污染
CONSTIX 密封泡沫拭子Contec19161023用于精确清洗树脂
盖玻片Sigma-AldrichBR470045-2000EA
干燥剂包各种N/A无RNase、无尘干燥剂包
一次性口罩赛默飞世尔科技 / 英维特罗根12-888-001防护，RNA酶污染和 &和无菌性 
DNA清除湿巾Sigma-AldrichL9060-250EA通过擦拭表面进行去污（湿巾）
DNA LoBind 离心管 1.5 mLEppendorf 22431021用于cDNA及文库扩增后收集。
DNA LoBind 管 2 mLEppendorf 22431048用于扩增前cDNA的收集。
DNBSEQ OneStep DNB制备试剂盒Complete Genomics940-001891-00DNA纳米球（DNB）制备与扩增试剂
DNBSEQ-T7RS 清洁试剂盒Complete Genomics940-001903-00测序完成后用于清洗的 cartridge
DNBSEQ-T7RS DNB上样试剂盒Complete Genomics940-001894-00用于将DNB加载至流动池的试剂和载片
DNBSEQ-T7RS 测序流动池Complete Genomics940-001902-001个泳道/流动池
DNBSEQ-T7RS Stereo-seq 可视化试剂盒Complete Genomics940-001893-00测序用的芯片和试剂。
DNBSEQ-T7RS 系统Complete Genomics该立体测序可视化系统采用DNBSEQ技术。测序运行始于DNA锚定序列的杂交，随后通过组合探针锚定测序（cPAS）化学方法将荧光探针连接至DNA纳米球（DNB）。最后，高分辨率成像系统捕获荧光信号。经光学信号的数字化处理后，测序仪生成高质量且准确的测序信息。
Dust-Off 压缩空气MatinM-6318重要的是使用此品牌或具有相似推进剂的产品 
Edge-Rite切片机刀片赛默飞世尔科技 / 英维特罗根4280L组织学——用于样本切片时
防爆冰箱各种N/A在甲醇固定步骤之前及过程中对甲醇进行预冷。
组织学刷各种N/A组织学——用于样本切片时
盐酸Sigma-Aldrich2104-50ML用于将预多聚化酶稀释于 0.01 N HCl（pH 2）中。HCl 溶液的标准储备浓度为 0.1 N。
成像系统各种N/AGC Stomics Imager，Leica，Evo Revolution
Invitrogen RNaseZap RNase 去污染溶液赛默飞世尔科技 / 英维特罗根AM9780清除RNA酶污染的工作站清洁方法
Kimtech 精密作业擦拭纸 Kimtech34155用于干燥实验台、仪器、移液器等
实验服各种N/A个人防护装备（PPE）
镜头纸赛默飞世尔科技 / 英维特罗根11-997各种防止脱片的玻片干燥方法
Lookout DNA 擦拭纸Sigma-AldrichL9060清除PCR污染的清洁工作站
5微升-0.2磁力分离架 Permagen 实验耗材MSRLV08用于PCR管中的珠子分离
Magjet 12x1.5 mL 架赛默飞世尔科技 / 英维特罗根MR02用于1.5 mL离心管中的珠子分离
手动旋转切片机LeicaRM2235组织学——用于样本切片时
甲醇 ≥99.9%，适用于免疫荧光、高效液相色谱Sigma-Aldrich34860用于固定（需为HPLC级）
显微解剖镊Sigma-AldrichF4142-1EA组织学——用于样本切片时
微量移液器各种N/A
分子生物学级无核酸酶水，非DPEC处理水各种N/A珠子的稀释与洗脱
腈类手套各种N/A个人防护装备
烘箱各种N/A烘烤芯片
带盖PCR 0.2 mL管各种N/A用于PCR应用
PCR 相关内容 各种N/A若所提供盖子的粘合剂粘性不足，则需更换
PCR 超净工作台 &和工作站MystaireMY-PCR24-010用于PCR前步骤（RNA逆转录为cDNA）
pH计各种N/ApH计用于确认盐酸的pH值。
聚-L-赖氨酸溶液Sigma-AldrichA005-C可选步骤，用于增强组织与芯片的黏附性
Qubit 4 荧光仪赛默飞世尔科技 / 英维特罗根Q33226仪器；DNA 定量测量
Qubit dsDNA 定量检测试剂盒赛默飞世尔科技 / 英潍捷基Q32851用于cDNA和文库定量的测量
Qubit ssDNA 定量试剂盒赛默飞世尔科技 / 英维特罗根Q10212ssDNA染色（仅使用染料）
无RNA酶冰块各种N/A组织学——在切片前用于对样本包埋块进行水化处理
RNaseZap RNase 去污染溶液赛默飞世尔科技 / 英维特罗根AM9782一种可破坏RNase的表面去污溶液
RNeasy FFPE 试剂盒Qiagen73504 && 19093用于RNA提取 & DV200 测量 
Sculpt Ultra White 树脂Siraya TechN/A耐高温紫外光固化树脂
Stereo-seq 16 重条形码文库构建试剂盒STOmics / Complete Genomics111KL160用于构建 Stereo-seq OMNI FFPE 文库
Stereo-seq FFPE 辅助试剂盒STOmics / Complete Genomics310AK002211SN114 试剂盒的 Spatial OMNI 附件部件
Stereo-seq N-芯片载玻片（1 cm × 1 cm）STOmics / Complete Genomics210CN114211SN114试剂盒中的Spatial OMNI芯片部分
Stereo-seq PCR 接头 STOmics / Complete Genomics301AUX001适用于PCR杂交步骤的改进，以适配三种类似的PCRmax原位杂交适配器
Stereo-seq 转录组 N 试剂盒STOmics / Complete Genomics211KN114211SN114试剂盒中的空间OMNI试剂部分
外科设计通用工业剃须刀片赛默飞世尔科技 / 英维特罗根13-812-236组织学——用于样本切片时
TE缓冲液溶液，pH 8.0Sigma-Aldrich8890用于洗脱 cDNA 和文库
热循环仪伯乐 / 各种1861096 / 12015392 / 多种PCR仪，手动盖或深孔板型（T100 Thermal Cycler / PTC Tempo Deepwell Thermal Cycler 等）
赛默飞世尔科技 Orion 一体式 pH 缓冲液试剂盒赛默飞世尔科技 / 英维特罗根13-624-500
组织漂浮浴 - 数字XH-1003首映NC0779538组织学——用于样本切片时
防紫外线护目镜各种N/A紫外光固化过程中的安全防护
二甲苯Sigma-Aldrich247642用于脱蜡

参考文献

  1. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  2. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  3. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 1-12 (2025).
  4. Fang, S., et al. Computational approaches and challenges in spatial transcriptomics. Genomics Proteomics Bioinformatics. 21 (1), 24-47 (2023).
  5. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-seq technologies and related computational data analysis. Front Genet. 10, 317(2019).
  6. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 882114(2022).
  7. Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
  8. Ma, Y., Zhou, X. Spatially informed cell-type deconvolution for spatial transcriptomics. Nat Biotechnol. 40 (9), 1349-1359 (2022).
  9. Zhou, Z., Zhong, Y., Zhang, Z., Ren, X. Spatial transcriptomics deconvolution at single-cell resolution using Redeconve. Nat Commun. 14 (1), 428(2023).
  10. Wei, R., et al. Spatial charting of single-cell transcriptomes in tissues. Nat Biotechnol. 40 (8), 1190-1199 (2022).
  11. Cheng, M., et al. Spatially resolved transcriptomics: a comprehensive review of their technological advances, applications, and challenges. J Genet Genomics. 50 (9), 625-640 (2023).
  12. To, A., Yu, Z., Sugimura, R. Recent advancement in the spatial immuno-oncology. Semin Cell Dev Biol. 166, 22-28 (2025).
  13. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  14. McKellar, D. W., et al. Spatial mapping of the total transcriptome by in situ polyadenylation. Nat Biotechnol. 41 (4), 513-520 (2023).
  15. Kuemmerle, L. B., et al. Probe set selection for targeted spatial transcriptomics. Nat Methods. 21 (12), 2260-2270 (2024).
  16. Gong, C., et al. an efficient and accurate data analysis workflow for stereo-seq spatial transcriptomics. Gigabyte. 2024, 1-12 (2024).
  17. Zhou, Y., Jia, E., Pan, M., Zhao, X., Ge, Q. Encoding method of single-cell spatial transcriptomics sequencing. Int J Biol Sci. 16 (14), 2663-2674 (2020).
  18. Patel, P. G., et al. Reliability and performance of commercial RNA and DNA extraction kits for FFPE tissue cores. PLoS One. 12 (6), e0179732(2017).
  19. Zhao, Y., et al. Stereo-seq V2: Spatial mapping of total RNA on FFPE sections with high resolution. Cell. , (2025).
  20. Russell, A. J. C., et al. Slide-tags enables single-nucleus barcoding for multimodal spatial genomics. Nature. 625 (7993), 101-109 (2024).
  21. Stenbeck, L., Taborsak-Lines, F., Giacomello, S. Enabling automated and reproducible spatially resolved transcriptomics at scale. Heliyon. 8 (6), e09651(2022).
  22. Vol. Rev A. , 10X Genomics. Pleasanton, CA. (2022).
  23. Su, G., et al. Spatial multi-omics sequencing for fixed tissue via DBiT-seq. STAR Protoc. 2 (2), 100532(2021).
  24. Stickels, R. R., et al. Highly sensitive spatial transcriptomics at near-cellular resolution with Slide-seqV2. Nat Biotechnol. 39 (3), 313-319 (2021).
  25. Groelz, D., Viertler, C., Pabst, D., Dettmann, N., Zatloukal, K. Impact of storage conditions on the quality of nucleic acids in paraffin embedded tissues. PLoS One. 13 (9), e0203608(2018).
  26. Yi, Q. Q., et al. Effect of preservation time of formalin-fixed paraffin-embedded tissues on extractable DNA and RNA quantity. J Int Med Res. 48 (6), 030006052093125(2020).
  27. Eccher, A., et al. Pathology laboratory archives: Conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 14 (4), 333(2024).
  28. Chen, T. Y., You, L., Hardillo, J. A. U., Chien, M. P. Spatial transcriptomic technologies. Cells. 12 (16), 2042(2023).
  29. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  30. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nat Biotechnol. 38 (5), 586-599 (2020).
  31. Janesick, A., et al. High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun. 14 (1), 3602(2023).
  32. You, Y., et al. Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods. Nat Methods. 21 (9), 1743-1754 (2024).
  33. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
  34. Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), eaat5691(2018).

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