本手术方案是将鞘内导管插入啮齿类动物脊髓硬膜下腔以递送靶向治疗药物的逐步操作指南。
本手术方案是将鞘内导管插入啮齿类动物脊髓硬膜下腔以递送靶向治疗药物的逐步操作指南。
治疗脊髓疾病或损伤具有挑战性,部分原因在于难以开发出可直接应用于脊髓的有效疗法。例如,目前对脊髓损伤(SCI)的治疗方法主要是硬膜外治疗。然而,硬膜外疗法无法与脊髓直接相互作用,从而降低了潜在的治疗效果。本文提出一种在啮齿类动物模型中进入硬膜下腔的方法,以实现治疗手段对脊髓更直接的作用。通过采用所述方案,成功实现了生物电子器件在硬膜下腔的植入,用于脊髓记录/刺激,同时也安全地植入了负载神经营养因子-3(neurotrophin-3)的水凝胶。在上述两种应用中,接受该操作的动物在术后未出现后肢或前肢功能改变,且在术后长达12周内均未出现功能障碍。尽管本文所展示的示例非常具体,但该方案可广泛应用于多种场景,以实现对脊髓神经系统疾病的更有效局部治疗。
脊髓疾病和损伤对全球数百万人具有毁灭性影响,导致重大的社会、经济和医疗负担1,2。脊髓损伤和神经退行性疾病可导致慢性运动、感觉和自主神经功能障碍,降低患者的生活质量和独立性。目前的治疗方法,如手术干预和药物治疗,主要集中在减轻初始创伤和管理继发性并发症3。然而,这些方法很少能实现显著的神经再生或功能恢复,因此迫切需要开发更有效的干预手段,以靶向其根本机制。
当前治疗策略的一个主要关注点是治疗的定位与递送方式。神经调节或药物干预等治疗手段能够影响神经元活动,促进功能恢复,并有可能重建受损脊髓回路中的连接4。脊髓刺激可改善运动控制并减轻疼痛5。然而,这些策略目前仅限于对损伤组织的间接递送,主要集中在硬膜外腔,未考虑脊髓硬脑膜屏障的影响6,7,8。尽管硬膜外治疗已显示出一定的临床益处,但由于对目标神经元群体的间接接触,可能导致治疗剂的效果减弱。
本研究团队致力于克服与硬膜外给药策略相关的上述局限,探索在脊髓损伤(SCI)模型中直接进行蛛网膜下腔治疗给药的潜力。将导管插入蛛网膜下腔可使治疗物质直接作用于脊髓,增强与受损神经组织的相互作用9,10。蛛网膜下腔给药还可减少硬脑膜的屏障效应,提高电刺激和靶向药物递送系统的有效性11,12。该方法有望提升治疗的精确性和有效性,从而改善功能恢复的治疗效果。
本文介绍了一种安全进入啮齿类动物脊髓硬膜下腔的逐步操作方案。该手术主要针对脊柱胸段区域(T10-T12),但也可根据需要在脊髓的其他部位实施。文中明确了相关解剖学标志,用于定位目标区域,并详细描述了椎板切除术、硬脊膜切开术以及穿透硬脊膜的具体操作步骤。本文还展示了该方案的两种应用实例,包括植入电刺激装置以及递送水凝胶药物递送系统(图1)。对于具备啮齿类动物外科手术经验的研究人员而言,所述步骤易于重复实现。本方案以脊髓挫伤模型(SCI)为背景撰写,但具体损伤模型可根据预期实验结果进行调整。此处描述的技术不仅有望推动脊髓损伤治疗的发展,还可能为未来通过精确、局部干预手段开展脊髓修复与再生研究提供一个可行平台。
所有操作均按照奥克兰大学的伦理准则进行,并获得了该校动物伦理委员会(AEC)和大学动物福利官员(AWO)的批准。实验选用体重为240–260 g的雌性Sprague-Dawley大鼠,群体饲养(21 °C;12 h:12 h明暗循环),术前和术后可自由摄取标准啮齿类动物饲料。建议首先在不建立损伤模型的情况下尝试本方案,目的是安全地进入啮齿类动物脊髓的硬膜下腔。这是关键的第一步,用以证明该方案可在不造成损伤的情况下实施,从而更准确地研究目标损伤模型。本方案适用于与各研究团队使用的多种不同损伤模型相结合。因此,本方案未描述特定的损伤操作步骤,因为这些步骤将根据具体应用而有所不同。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 术前准备
2. 手术准备
3. 动物准备
4. 脊柱组织解剖
5. 椎板切除术
6. 硬脑膜切开以进行治疗应用
7. 术后护理
本方案已在两种不同的实验条件下应用。所展示的数据代表了未受伤组,目的是证明在未建立损伤模型的情况下,本方案中描述的硬膜下操作不会影响功能。在6至8周龄的Sprague-Dawley大鼠中植入了生物电子器件(图1A)或递送了水凝胶(图1B)。这些动物的运动功能与接受假手术但未进行硬膜下操作的对照组动物进行了比较,评估采用BBB运动功能评分量表。本研究包含了多组动物,以展示每种操作的可行性和安全性。每项操作后,所有动物均保持正常的运动功能,在术后7天各组之间的BBB评分无差异,表明所述方案的安全实施。此外,还展示了一组显示后肢运动功能受损的动物(图4C),以便与硬膜下操作组进行对比,进一步证明实验组未出现不良影响。该组动物接受了175 kdyn冲击装置造成的挫伤性脊髓损伤(SCI)操作,具体方法见既往文献12,13所述。
生物电子植入物
在设备植入过程中,该方案包括创建两个硬脑膜切口位点——一个用于导管进入,另一个用于导管穿出——以促进导引导管在硬脑膜下移动,并实现设备的可控定位。该生物电子设备由两个分叉臂组成,连接至一个印刷电路板(PCB)接口,并由生物相容性封装外壳包裹。分叉臂暂时连接于细小的鞘内导管。 通过 使用7-0丝线缝合以辅助植入物的定位。将导管缓慢穿过头端的硬膜切口,沿硬膜下方向滑行,再通过治疗部位尾端的硬膜切口引出。随后将连接的植入臂分别穿过切口,并置于脊髓的每侧半部分。植入物的尾端用缝线固定于附着在T13突起上的肌肉。将外壳缝合于椎板切除部位头端的斜方肌/背阔肌上。最后将皮肤在装置外壳基部周围缝合,以提供外部通路。
水凝胶处理
对于水凝胶递送,仅需一个进入点。水凝胶被递送 通过 与刺激装置位于相同位置的类似鞘内导管。导管中装载了10 µL的泊洛沙姆水凝胶12 并以与设备植入步骤相同的方式插入硬膜下腔。到位后,在持续向硬膜下释放水凝胶的同时,缓慢撤出导管(图1B) 放置到每侧半脊髓上。每次操作后,对动物进行为期7天的监测,以确保其充分恢复。
采用21分制Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分评估运动功能16两组动物均在术前(基线)以及术后1天、3天和7天进行评估。开放旷场行为直接进行评估。 通过 盲法视频记录。将每组动物左右后肢的运动功能评分与未手术对照组以及另一脊髓损伤(SCI)组进行比较,以确定手术可能带来的任何不良影响。与未手术对照组或损伤性SCI动物相比,植入组或水凝胶组动物在手术后均未出现运动功能缺陷。需要指出的是,已发表的前期研究中已有组织学分析证实脊髓无损伤。该研究证明,采用此方法植入装置在术后7天内不会造成额外的脊髓创伤。11植入设备后,与对照组动物相比,星形胶质细胞(GFAP)和小胶质细胞/巨噬细胞(Iba1)的活性均仅有轻微变化。同时检测了植入物正下方脊髓冠状切片的表面积和圆形度,结果显示形态学无明显改变。

图1:硬膜下治疗策略。(A)植入装置示例,以及(B)用于注射水凝胶的导管/注射器。(C)大鼠脊髓中植入装置与水凝胶插入的代表性模型。请点击此处查看该图的放大版本。

图2:椎板切除术的图像,代表手术视野。 (A) 手术图像中动物的体位方向 图2 和 图3. (B) 用于定位第13肋过程(T13)以指导肌肉解剖起始位置的肌腱解剖标志。C) 垂直切割以识别需去除的各个突起部分 通过 椎板切除术。D沿脊突平行切开肌肉通道,以暴露骨板并进行移除。E用于牵开脊柱两侧的肌肉/皮肤,以提供足够的手术空间的Bulldog止血钳。F) 椎板切除术开始前,去除连接各突起之间的白色肌腱。G) 开始椎板切除术时的手术视野,咬骨钳从T12椎板下方插入,准备开始切除骨质。H切除T12椎板的前半部分,以暴露脊髓,并为术者提供足够的操作空间,以便向头侧移动并开始切除剩余的椎板(T11/T10)。我) 切除T12的颅侧部分,并完全移除该节段。J) 使用较宽切口在 T11 节段进行半程椎板切除术,以实施示例性挫伤性脊髓损伤。K) 切除T10-T12节段后行完全椎板切除术,充分暴露脊髓背侧表面。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图3:进行硬脊膜切开及靶向治疗的操作步骤。(A)脊髓硬脊膜上打孔位置的示意图。(B)手术视野,显示27 G针头穿刺硬脊膜以完成硬脊膜切开;如图(A)所示,该操作在中央血管两侧均进行。(C)用于给药治疗的导管初始插入状态。(D)电刺激装置已放置于脊髓上。(E)装载有水凝胶、用于脊髓表面注射的导管。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4:术后状态与运动功能。(A)装置植入和水凝胶递送后动物的代表性图像。(B)脊髓挫伤动物的代表性BBB评分,与仅接受硬膜下手术(植入物或水凝胶)或未进行任何操作的对照动物进行比较。对照组(未手术)、SCI组和植入物组的样本量为 n = 5,水凝胶组样本量为 n = 3。误差条表示标准误。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图1:手术器械。 所用手术器械的照片。(1)#10刀片手术刀。(2)Vannas显微剪刀。(3)Graefe镊子。(4)Serrefine鳄嘴夹。(5)咬骨钳。(6)27 G针头用于硬脑膜切开。(7)精细镊子。(8)1 mL注射器用于按需滴加生理盐水。(9)解剖剪刀。(10)止血钳用于缝合。(11)尖头棉签。(12)灭菌棉球。(13)卷状无尘擦拭纸。请点击此处下载该图。
补充图2:硬膜下 与硬膜外间隙 脊柱和脊髓的示意图,显示硬膜外腔 与硬膜下腔 请点击此处下载该图片。
本文介绍的方法提供了进入脊髓蛛网膜下腔的分步操作指南,并通过两种向脊髓胸段递送治疗的实例,证明了该方法的安全性和可行性11,12。许多研究团队已开发出多种策略,试图通过电刺激或化学干预手段治疗脊髓损伤(SCI)。目前的策略包括用于光遗传学17或电刺激18的可植入装置,以及利用水凝胶的药物治疗方案19,20,这些方法在促进功能恢复和康复方面已显示出不同程度的成效。然而,精准靶向仍是一个关键挑战,因为大多数现有治疗手段均未直接作用于蛛网膜下腔。本文所述技术为直接向脊髓递送干预措施提供了一种有前景的方法,包括实现对蛛网膜下腔的长期通路(补充图2),从而支持对SCI及神经退行性疾病进行持续且靶向的治疗剂递送。该方法对于克服血-脊髓屏障这一脊髓疾病治疗中的主要障碍具有重要意义。
椎板切除术
尽管啮齿类动物的椎板切除术被广泛应用17,21,22,但本方案中有若干关键点必须注意。上述方案中使用的解剖标志(步骤 4.3;图 2A)可通向脊髓的下胸段,且专用于本课题组的研究。若需应用于不同的脊髓节段,可通过从初始椎骨向头侧或尾侧计数椎体节段来确定目标位置。另一个关键考虑因素是椎板切除的范围。为尽量降低手术过程中对脊髓造成意外损伤的风险,应至少连续切除两个节段的椎板。这样做可为硬脊膜切开提供足够的操作空间,并确保良好的视野。该措施有助于降低导管插入过程中损伤小血管的风险。同时应避免过度切除脊柱侧壁的骨质,以防术后出现不必要的出血或脊柱不稳定。通过在充分暴露与最小组织干扰之间保持平衡,该手术可实现更安全、更精确的治疗操作。
硬膜切开与导管置入
进行硬脊膜切开时需精准操作,以避免损伤脊髓。不当的插入可能导致脊髓或硬膜下血管挫伤或撕裂。在硬脊膜上所创建的切口应仅足够容纳预期的治疗策略,在本例中即为鞘内导管的直径,同时不破坏膜的完整性。实施硬脊膜切开时,当硬脑膜被穿刺后可能会有脑脊液渗漏,但渗漏量通常极少。尽管硬脊膜的大面积撕裂可能引发并发症,但既往文献表明,如本方案所述(步骤6.4)所用的小型穿刺孔具有自愈能力。 通过 胶原沉积/血管生成23,术后未观察到可测量的不良反应。置入导管时,必须尽可能与脊髓平行插入,以最大限度降低因直接受力造成损伤的风险。操作过程中需小心谨慎,避免导管弯曲或受压,确保其顺利插入并准确定位。
术后护理
考虑到啮齿类动物通常在标准条件下群养,手术后的护理是一个重要的考量因素。术后可能出现的攻击性行为或社会互动可能会影响实验结果,具体影响取决于所采用的处理方式。本方案会在动物背部形成一条长6-8 cm的皮肤缝合线。建议术后将动物单只饲养7-10天,以促进伤口愈合并防止笼伴可能将缝线拔除。若为药物递送应用,在切口愈合后,动物可重新放回原先的群体饲养,通常不会出现明显的攻击性行为或与手术相关的并发症。若涉及可植入装置,动物仅可成对饲养。我们发现,将动物以三只或更多为一组饲养时,可能导致与攻击行为相关的并发症,从而影响处理效果。
治疗应用
尽管本文所述操作主要针对胸段脊髓及两种特定治疗策略,但该方法可适用于脊柱其他区域以及更多治疗用途。类似椎板切除术已在啮齿类动物模型的不同脊髓节段成功实施。然而,啮齿类动物硬膜下腔空间狭小,给治疗实施带来挑战,操作容错空间极小。虽然有经验的实验人员可较容易地完成椎板切除和硬膜切开步骤,但将治疗装置或药物精确置入硬膜下腔而不造成组织损伤,可能需要额外的培训时间。除手术技能训练外,还有若干因素有助于提高治疗实施的准确性。治疗过程中保持清晰的视野至关重要。若采用本研究中所述的鞘内导管,需确保导管在置入硬膜下之前表面光滑,无任何毛刺或粗糙部位。如前所述,硬膜切开的位置极为关键:导管进入点距离残留的头端椎板越远,导管在插入过程中越容易与脊髓保持平行排列。此外,治疗策略实施的时机也需结合损伤时间综合考虑。未来的研究将包括在损伤后不同时间点的动物模型中建立这些操作流程,从而为评估针对慢性脊髓损伤的治疗手段提供可能。本方案代表了脊髓神经系统疾病治疗应用方面的重要进展,提供了一种灵活且精准的直接向脊髓组织递送治疗手段的方法。
作者无任何利益冲突需要披露。
本工作由 CatWalk 脊髓损伤基金会和 HRC 查尔斯·赫卡斯研究奖学金(BH)资助。本工作还得到了美国国防部卫生事务副部长办公室的支持,并由国防部认可,通过脊髓损伤研究计划(资助编号 HT9425-23-1-0492)提供金额为 534,258 美元的资金支持。图 2A 和 图 3A 中的示意图使用 Biorender.com 生成。 本出版物中使用的生物电子器件由查尔姆斯理工大学的 Maria Asplund 博士和 Lukas Matter 设计并提供。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 和 3 mL 注射器 | Amtech | ||
| 1ml 结核菌素注射器 | BD | 302100 | |
| 2 把 Graefe 镊子 | FST | 11051-10 | |
| 用于给药的 25G 针头 | Nipro | SH811 | |
| 用于硬脑膜切开的 27G 针头 | Nipro | SH816 | |
| 6 个组织止血夹 | FST | 18051-28 | |
| 70 % 乙醇 | |||
| Baytril 5 mg/kg | Elanco | KV04UHU | |
| Biogel 外科医生乳胶手套 | Molnlycke | 822775-01 | |
| 布比卡因 2 mg/kg | Aspen New Zealand | 2023-02 | |
| 布托啡诺 0.05 mg/kg | Ceva (Vetergesic) | 9000320 | |
| 氯己定与乙醇酊剂 | Perrigo | K076A | |
| 氯己定擦洗液 | Schulke | LBL11258 | |
| 弯头咬骨钳 | FST | 16021-14 | |
| Dumont #4 镊子 | FST | 11294-00 | |
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| Hamilton 注射器 | Hamilton | 80314 | |
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| Infinite Horizon 撞击器及配套软件 | Precision systems and instrumentation (PSI) | IH-0400 | |
| 异氟烷 | Medsource | unknown | |
| 美达辛(Metacam)2 mg/kg | Boehringer Ingelheim | D02818 | |
| 不可吸收缝线(Ethilon 4-0,P-3) | Ethicon | 1603G | |
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