流感病毒冷冻电子断层扫描血凝素的亚纳米分辨率结构测定

冷冻电子断层扫描 （cryoET） 在过去几十年中一直被用于捕获蛋白质复合物、病毒、细胞和生物体的快照。冷冻电子显微镜 （cryoEM） 的一种模式，冷冻 ET 是一种结构生物学方法，其中生物样品被快速冷冻，然后通过倾斜 ^1,2,3 通过各种方向成像。然后，在每个方向拍摄的图像通过计算对齐到它们的公共倾斜轴，并重建为断层扫描以提供三维视图⁴。

X 射线晶体学和单颗粒冷冻电镜需要纯化的、结构均匀的分子，而冷冻电镜可以直接在其天然环境中对分子进行成像⁴。因此，冷冻ET的一个主要优点是它能够可视化多形性样本，例如膜病毒，包括流感^5,6,7。冷冻ET的另一个承诺是它能够跨尺度成像。虽然断层扫描通常不会在5-10 nm以上分辨^8，但亚断层扫描平均的集成，其中识别、对齐和平均同一颗粒的副本，可以在某些生物分子（如核糖体）中产生接近原子的分辨率^9,10。然而，只有有限类型的分子可以达到这种分辨率;亚断层扫描平均值通常不会超过 10-15 Å 分辨率。相比之下，单颗粒冷冻电镜在分辨率旋转后通常达到3-4 Å的分辨率¹¹。冷冻ET数据采集和分析软件的更高通量方面的最新进展允许在其天然环境中对其他生物分子进行亚纳米分辨率结构测定12,13,14,15,16,17,18。

冷冻ET的一个常见用途是可视化病毒的形态、组织和结构。尽管与单颗粒冷冻电镜或 X 射线晶体学相比，该技术提供的分辨率较低，但冷冻 ET 与亚断层扫描平均相结合可以提供有关病毒蛋白在其天然环境中如何表现的信息，并提供有关其在病毒粒子背景下的组织的关键细节。病毒冷冻ET的常见靶标是通常用于宿主细胞附着和融合的表面糖蛋白，因为它们通常是治疗或疫苗的主要抗原和靶标。随着冷冻ET处理包的最新进展，实现这些糖蛋白19,20,21,22的亚纳米分辨率平均值变得越来越可行。其中一个例子是血凝素 （HA），它是流感病毒粒子表面的主要蛋白质。这种蛋白质不仅可以进行受体结合和膜融合，而且还以令人难以置信的致密方式覆盖病毒粒子，在单个病毒粒子上有数百到数千个 HA⁵。此处介绍的协议（图 1）将几个常用的软件包与内部脚本集成在一起，以描述从预处理到模型细化的阶段，以获得流感 HA 的亚断层扫描平均值。

注意：用于此协议的示例数据集可在 EMPIAR-12864 访问，其中包括用于该协议的两组倾斜系列。倾斜系列是从物理像素尺寸为 2.09 Å/像素的纯化甲型流感病毒的手动插入网格中收集的，以确保足够大的视野，以便每个倾斜系列包含多个病毒粒子，并呈现尽可能高分辨率的重建。对于用户自己的数据集，建议使用原始倾斜影片开始工作流程。这些数据集使用高性能工作站进行处理和可视化。 材料表 列出了用于此协议的硬件和软件。该协议中使用的所有软件包都是开源的，可供下载;材料 表中列出了安装链接和说明。推荐的用于处理冷冻ET数据集的工作站应至少配备一个8核处理器、一个具有6 GB VRAM的专用GPU卡、64 GB RAM和2 TB本地存储。

1. Warp ²³ 和 IMOD ²⁴ 中倾斜电影的数据预处理和冷冻电子断层扫描的重建

1. 在终端中，使用以下命令激活安装了 Warp 的 conda 环境：
   conda activate warp_environment
2. 创建用于处理帧系列的帧系列设置文件。这是一个配置文件，其中包含有关显微镜的元数据、要处理的数据的位置以及输出文件的存储位置。
   WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
   注意：这些数据是在超分辨率模式下收集的。
3. 进行对比度传递函数 （CTF） 估计和运动校正。
   WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
   注意：m_grid参数应对应于倾斜电影中的子帧数 - 我们的数据集由每个倾斜电影中的 5 个子帧组成。
4. 导入倾斜系列元数据，以便 WarpTools 可以识别哪些电影属于哪个倾斜系列。
   WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
5. 填充 tomostar 文件夹后，创建用于倾斜系列处理的倾斜系列设置文件
   WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
6. 使用 IMOD 的 batchruntomo 程序使用 Etomo^{GUI 24} 写出倾斜堆栈并进行基于基准的自动倾斜系列对齐。
   1. 在终端中运行以下命令：
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      注意：倾斜系列以物理像素大小的 4 倍导出，以减少对齐时间和计算资源。
   2. 选择一个示例数据集，首先设置对齐参数，然后再将其应用为 batchruntomo 的模板。
   3. 如果使用 batchruntomo，请从 IMOD 导入对齐参数。
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      注意：对于此数据集，使用 Etomo GUI 产生的结果比 WarpTools 中的包装器更好。
   4. 或者，使用 WarpTools 中的 AreTomo²⁵ 包装器进行自动无基准倾斜系列对齐。
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      注意：AreTomo 包装器使用 AreTomo1.3.4 进行了测试。
7. 在终端中运行以下命令，估算倾斜系列的CTF参数：
   WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
8. 使用 WarpTools 重建断层扫描。
   1. 设置环境变量：
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      注意：此步骤确保断层扫描将与该协议中使用的其他软件中图像处理和可视化的后续阶段兼容。
   2. 要重建断层扫描，请在终端中执行： WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
9. 对所有数据集重复步骤 1.2 - 1.8.2。

2. 断层扫描预处理和颗粒拾取

1. 在终端中，激活安装了 IsoNet²⁶ 的 conda 环境。
   conda activate isonet_env
2. 通过首先创建一个子文件夹并将所有断层扫描移动到该文件夹中来准备断层扫描处理。
   mkdir tomo_folder
mv tomograms*.mrc tomo_folder/
3. 在项目文件夹中生成星形文件。
   isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
4. 使用文本编辑器，打开生成的星形文件，并在每张断层扫描的第四列 （_rlnDefocus） 中输入 0 度倾斜图像的近似散焦值，该值可以位于 warp_tiltseries 文件夹的 processed_items.json 文件中。
   注意：散焦值应以 IsoNet 的埃为单位。Warp 以 μm 为单位写出散焦值，这需要 10,000 的乘法系数。
5. 在终端中运行 CTF deconvolve 命令。
   isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
6. 反卷积后，启动 EMAN2 GUI²⁷ 开始预处理断层扫描以进行颗粒拾取。
   conda activate eman_env
e2projectmanager.py
7. 在“断层扫描”下，左键单击 “原始数据” 旁边的箭头，然后从下拉菜单中选择 “导入断层扫描” 。
8. 左键单击 分割 旁边的箭头，然后选择 预处理断层扫描。
   注意：默认参数可能适用于许多数据集。对于这些断层扫描，应用了 4 Å 的低通滤波器并对倾斜图像进行了归一化。预处理后，EMAN2 将自动生成一个信息目录，其中包含空白.json文件（与预处理文件具有相似的基本名称）。在粒子拾取之前，需要将 angpix 添加到 json 文件中。
9. 训练卷积神经网络 （CNN） 以识别 HA 糖蛋白。
   1. 将工作目录更改为用于 CNN 训练和粒子拾取的断层扫描的位置：
      cd path/to/tomograms
   2. 使用终端打开 CNN 培训窗口。
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
   3. 确认打开了四个窗口：一个包含目录中的 CNN 参数和断层扫描信息，另外三个窗口包含良好参考（正）、不良参考（负）和 CNN 选择的粒子（粒子）的图像。
   4. 左键单击 CNN GUI 上的 “新建 ”按钮以初始化新的 CNN。将默认学习率设置为 0.0001，将盒子大小设置为 8。
   5. 在 “文件名 ”列下，左键单击具有代表性的断层扫描以在新窗口中将其打开。
      注意：一次只能打开一张断层扫描。
      1. 要在断层扫描的 z 轴上移动，请将光标放在打开的断层扫描上，然后按计算机鼠标的滚轮打开一个新窗口。标记为 N# 的滑块将更改 z 轴。
   6. 在打开的断层扫描上，使用 “阳性”面板中的鼠标左键选择与 HA 相对应的 10-20 个特征。
      注意：选择HA的俯视图和侧视图，它们在膜上方显示为圆柱体或三角形，作为更稳健网络的良好参考。
      1. 正面参考的图像将出现在 正面 窗口中。要删除引用，请按住 Shift 键并左键单击参考图像。
   7. 切换到 “负”面板，选择 10-20 个与空膜贴片、vRNP 密度、基准标记和碎片等特征相对应的参考。
      注意：参考文献将出现在 “负片” 窗口中。
   8. 通过左键单击主窗口中的 “训练” 按钮启动 CNN 训练。
      注意：主窗口中的迭代次数 （Niter） 会改变 CNN 所经历的训练迭代次数。建议将参数设置为 50。
   9. 在所选参考文献上训练 CNN 后，左键单击 “应用” 以使用 CNN 拾取开放断层扫描中的粒子。
      注意：拾取粒子的图像可以在“粒子”窗口中看到。选定的颗粒也将以蓝色圆圈显示在断层扫描上。
   10. 继续根据应用的网络选择正负参考，通过 保存 按钮定期保存进度。
   11. 满意后，选择 “全部应用” ，让 CNN 选择目录中所有断层扫描中的粒子，并在多个断层扫描上评估结果;根据需要进行额外的培训。
10. 将坐标保存到每个断层扫描的文本文件中。
    1. 使用命令 e2projectmanager.py 打开 EMAN2 GUI。
    2. 单击 “子断层图平均值 ”旁边的箭头，然后单击 “手动装箱”。
    3. 输入断层扫描的名称，然后单击 启动。
    4. 通过选择 文件>保存框坐标> tomogram_ha.txt，将坐标保存到文本文件。
    5. 导航到 neuralnets 子文件夹和 info 子文件夹以备份 nnet_save.hdf、trainouts.hdf、segouts.hdf 和 boxes3dref.hdf。
11. 为确保仅对基质 （M1） 蛋白层和病毒核糖核蛋白 （vRNP） 复合物存在明显的完全组装病毒粒子进行分析，请训练第二个卷积神经网络来识别 M1 蛋白。
    1. 遵循步骤 2.9 中概述的相同协议，将训练框大小从 8 更改为 14。

3. 粒子策展

1. 从 https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis 下载笔记本。
2. 打开 CNN_Particle_Cleaning.ipynb 笔记本并加载所需的模块。
   注意：该脚本使用 Open3D²⁸ 作为包将粒子坐标可视化为 3D 点云。
3. 加载与 HA 和 M1 坐标相对应的文本文件，并使用 Open3D 包查看为 3D 点云。
4. 使用 Open3D 中实现的统计异常值去除来过滤掉 HA 坐标异常值。
   注意：HA 的建议初始值为 nb_neighbors = 50（坐标周围的相邻坐标数）和 std_ratio = 0.5。
5. 计算 HA 和 M1 点云之间的距离。然后，距离 M1 点云 20 像素以上的所有 HA 坐标都将被识别为异常值。所有未标识为异常值的粒子坐标将保存在输出.txt文件中。
   注意：20 像素对应于大约 16 nm 的距离，像素尺寸为 8.35 Å/像素。在我们的断层扫描中，HA 三聚体到 M1 层的中心约为 15 nm。
6. 使用 pts2starfile.ipynb 连接所有粒子并另存为星标文件。

4. 迭代亚断层扫描平均与分类

1. 使用 WarpTools，以 4 的分箱因子提取粒子，并在^{RELION4 29} 中进行初始轮次亚断层图平均。
   WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
   注意：建议的盒子尺寸为 48 x 48 x 48 像素，对应于 ~360 ų盒子，该盒子足够大，可以容纳 7-8 HA 的阵列。
   1. 将扭曲星文件转换为 RELION 4 兼容文件
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
   2. 使用粒子子集上的relion_refine_mpi生成初始参考。
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
   3. 使用 relion_refine_mpi 对亚断层扫描进行 3D 自动细化。
      1. 示例命令： mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
         注意：初始全局和局部采样设置为 7.5 和 1.8 度，对应于 4 的 healpix 阶数和 2 的局部 healpix。最初的改进主要利用膜、M1 蛋白和 HA 阵列的强密度。允许平移偏移范围更大，以包含对齐数组时可能发生的任何偏移。
   4. 在第一次细化运行收敛后重复细化，将平移更改为 8，步长更改为 2。
2. 利用 2D 分类，使用 relion_refine 丢弃垃圾颗粒。
   1. 示例命令： relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002。
      注意：使用 2D 分类代替 3D 分类，因为它的计算效率更高。亚断层图可以直接用作二维分类作业的输入，无需额外的图像处理。
   2. 使用 relion_star_handler 组合包含包含圆柱形 HA、膜和 M1 密度的可识别 HA 阵列的类。
   3. 首先，创建包含良好类的星型文件。
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
   4. 然后，使用以下relion_star_handler命令合并各个星形文件。
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
3. 在 bin2 处重新提取未装箱的颗粒，以进行迭代局部细化。
   1. 对于 bin2 细化，使用较小的框尺寸 80 提取颗粒，并在 healpix 和局部 healpix 设置为 4（1.8 度局部角度采样）的情况下进行局部搜索。
   2. 在此阶段，使用 relion_star_handler 组合来自不同数据集的粒子集。
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
   3. 在第一轮细化之后，在包含中央 HA 加膜和 M1 密度的 EMAN2 环境中使用 e2filtertool.py 创建一个圆柱形掩模。
      注意：用于圆柱形掩模的参数：cx=24、cy=24、outer_radius=8、zmax=40、zmin=12;所有其他参数均未选中。
   4. 在应用面膜的情况下再进行一轮细化。
   5. 进行另一轮 2D 分类，以消除与中央 HA 不对齐的异常值和其他碎片。
   6. 对盒子尺寸为 120 的未装箱颗粒重复该过程，并创建一个覆盖中央 HA 的软掩模，将参考与 C3 对称性对齐，并在此细化阶段应用对称性。
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      注意：使用 RELION 实现的最终分辨率为 6.1 Å。
4. MTools⁹ 中的最终改进
   1. 创建细化群体（激活扭曲conda环境后）。
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
   2. 为每个数据集添加数据源。
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. 对其他数据集重复上一步。
   3. 创建细化种类。
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
   4. 多颗粒细化。
      1. 首先使用以下命令细化粒子姿势： MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. 随后，使用以下命令细化粒子姿势和球面像差： MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
         注意：由于进一步的迭代没有提高分辨率，因此此处停止了细化。然而，未经过详尽测试的不同参数组合可能会继续提高结果。

5. 模型细化

1. 使用 ChimeraX³⁰，加载最终映射和 HA 的原子模型。
2. 对与 HA 外域相对应的所有段进行映射和组合，并使用 “拟合到段 ”工具对接在 HA 模型中。
   1. 保存模型的变换坐标。
3. 打开 Phenix GUI³¹，然后使用 Real Space Refinement 工具。
   1. 当提示添加文件时，添加转换后的HA模型和地图，并填写最终重建的分辨率。
   2. 进行五轮全局最小化、局部旋转器拟合、占用细化、组ADP细化。
4. 使用 ChimeraX 可视化最终重建和建模。

为了证明该处理协议的利用（图1），将前面概述的工作流程应用于从H1N1甲型流感病毒株（A/Puerto Rico/8/1934）获得的25张断层扫描的两个数据集。数据收集参数概述在 表 1 中。 图 2 说明了多形性流感病毒粒子的代表性断层扫描和放大视图。该断层扫描捕捉到了不同的形态，因为病毒粒子的形状从球形到椭圆形/细长不等。虽然大多数流感颗粒含有组织良好的 M1 和 vRNP 组装体，但一些病毒粒子似乎更加杂乱无章并且缺乏关键的结构成分。

从该数据集中，一组初始的 40,995 个子断层图用于粒子拾取和管理后的 bin4 （8.35 Å/pix） 重建。这两个数据集最初在RELION4中独立处理，具有 C1 对称性和包含整个 HA 阵列的宽球形掩模。对这些亚断层扫描进行了三个细化循环，然后进行二维分类。分类后，分辨率差的亚断层扫描和垃圾颗粒被丢弃;在bin2（4.17 Å / pix）处提取剩余的亚断层扫描，并将两个数据集合并在一起。首先在一轮亚断层扫描平均中将 Bin2 亚断层扫描对齐在一起，然后在中央 HA 周围应用圆柱形掩模以进行焦点对齐。在这个阶段，可以清楚地可视化HA重建的三聚体对称性。在bin2和2.8 Å/pix处进行了额外的几轮细化。最后一轮 2D 分类是使用一个小掩模进行的，该掩模仅覆盖中央 HA 三聚体，并带有对齐的亚断层扫描。主要类别由~94%的剩余亚断层照片组成，被提取到未分箱的颗粒中，并在应用C3对称性的情况下进行3D细化。最后，将这些亚断层扫描输出到M，在那里进行粒子位姿和球差细化循环（补充图1）。

最终的亚断层扫描平均值（图3A）由15,970个HA颗粒组成，达到6.0 Å的全局分辨率和5-7 Å的局部分辨率范围（图4）。将PR8 HA模型灵活细化为密度;在FSC=0.5和FSC=0.143时，映射到模型的分辨率分别为8.1 Å和6.6 Å。HA 重建的架构与以前的冷冻电镜和冷冻电镜图非常相似。在此分辨率下，可以区分α螺旋和β折叠（图3B）;此外，可以在HA头部和茎上的四个糖基化位点开始鉴定聚糖（图3C）。

我们的结果表明，冷冻ET在从天然流感病毒粒子重建HA中的适用性。通过该方案，观察到垂直于病毒膜的圆柱形糖蛋白的透明密度，并且每个步骤的分辨率都有所提高。对于自己的数据，建议从分箱粒子堆栈开始进行亚断层平均，并在每个细化周期密切监测结果。如果糖蛋白密度从开始阶段就不明显，建议将亚断层扫描位置映射回断层扫描上，以验证定位准确。否则，可以调整对齐参数或实施额外的分类阶段以获得最佳结果。

图 1：流感病毒冷冻 ET 中 HA 的亚断层扫描平均的总体管道。 顶部面板表示用于演示协议的两个数据集的摘要工作流程。第二组对应于协议的第 1 节，第三组对应于第 2-3 节，第四组对应于第 4-5 节。 请点击此处查看此图的大图。

图2：PR8流感病毒的代表性断层扫描。 （A）切片重建的断层扫描。比例尺为 100 nm。（B-D）放大视图 （B） 球形，（C） 圆柱形，（D） 无 M1 PR8 病毒粒子。BD 中的所有比例尺对应于 50 nm。 请点击此处查看此图的大图。

图3：PR8 HA的亚断层扫描平均值。 （A）灵活地安装PR8 HA单颗粒冷冻电镜结构的两个轮廓水平的HA重建的俯视图和侧视图。（B） 房委会重建的剪裁视图。彩色箭头对应于彩色框。（C）在较低轮廓处显示的HA重建，以揭示聚糖密度。还显示了冷冻ET图中棒状表示中的聚糖的特写视图。 请点击此处查看此图的大图。

图 4：HA 亚断层扫描平均值的分辨率估计值。 （A） 映射到重建上的 HA 亚断层扫描平均值的局部分辨率估计值。色条在蓝-白-红调色板上描绘 5-7 Å。（B）半图和图到模型分辨率的FSC曲线。蓝色曲线是未遮罩的重建，红色是遮罩的。 请点击此处查看此图的大图。

表1：PR8流感病毒冷冻ET数据集的数据采集参数。

补充图 1：HA 的亚断层扫描平均工作流程。 通过逐步拆箱对 HA 亚断层图进行迭代比对、平均和分类。 请点击此处下载此文件。

作者没有什么可透露的。