湿润暴露烧伤膏对糖尿病小鼠创面新生血管及血浆外泌体miR-31-5p的影响

摘要

本文描述了湿润烧伤膏如何通过动态调控糖尿病创面新生血管形成及血浆外泌体miR-31-5p的表达，促进糖尿病创面修复。

摘要

湿润烧伤膏（MEBO）是一种用于治疗慢性糖尿病创面的传统中药，但其潜在作用机制尚不明确。近期研究表明，外泌体及功能性miRNA在创面新生血管形成中发挥重要作用。本研究旨在探讨MEBO对糖尿病小鼠创面新生血管化及血浆外泌体miR-31-5p（pExo-miR-31-5p）表达的影响。共120只C57BL/6小鼠随机分为非糖尿病对照组（n = 24）和链脲佐菌素诱导的糖尿病组（n = 96），后者进一步随机分为糖尿病对照组、MEBO组、贝复新组和MHY1485组（每组n = 24）。建立五组全层皮肤切除模型，分别以生理盐水、生理盐水、MEBO、贝复新和MHY1485进行处理。在第1、7、13和18天，分别采用ImageJ软件、苏木精-伊红（HE）染色、实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质印迹法（WB）分析创面愈合率、微血管密度、pExo-miR-31-5p表达水平以及创面组织中VPS4a和Rab27a的mRNA与蛋白表达水平。此外，分析VPS4a、Rab27a蛋白、pExo-miR-31-5p表达与微血管密度之间的相关性。研究发现，MEBO可促进糖尿病小鼠创面修复（p < 0.050）。MEBO在创面愈合的早期和中期阶段促进新生血管形成，但在后期阶段则抑制该过程（p < 0.050）。MEBO在愈合早期和中期上调创面组织中Vps4a和Rab27a的mRNA和蛋白表达，以及pExo-miR-31-5p的表达水平，而在后期阶段则下调这些指标（p < 0.050）。此外，在MEBO处理的小鼠中，VPS4a、Rab27a蛋白、pExo-miR-31-5p表达水平与微血管密度呈正相关（p < 0.050）。综上所述，MEBO在糖尿病小鼠中动态调控创面新生血管化及pExo-miR-31-5p的表达，为其临床应用提供了新的理论依据。

引言

老年患者中糖尿病的患病率较高，且每年呈上升趋势。该疾病常伴随慢性糖尿病伤口（CDWs），对患者的健康状况、功能以及整体生活质量产生不利影响¹。通常，伤口愈合包括四个明确的阶段：止血期、炎症期、增殖期和再上皮化期²。其中，增殖期最为关键。在增殖期早期，毛细血管内皮细胞增殖并迁移至伤口部位，出芽形成新血管，并构建复杂的血管网络³。然而，在伤口修复的后期，大多数毛细血管管腔会发生闭塞，仅有少数转变为小动脉和小静脉。在CDW患者中，组织缺失、坏死和坏疽，以及不同程度的炎症和高血糖状态，会破坏血管生成与抗血管生成之间的动态平衡，从而延缓伤口愈合，尤其是在血管生成受损的情况下尤为明显^4,5,6。湿润烧伤膏（MEBO）是一种用于治疗CDWs的中药，但其作用机制尚不明确。近年来，多项研究表明，外泌体携带的miRNA可促进血管生成，从而加速糖尿病伤口的愈合^7,8。然而，目前关于MEBO与外泌体携带miRNA之间关联的研究仍较少。因此，亟需从外泌体及功能性miRNA的角度揭示MEBO促进CDWs血管生成的作用机制。

外泌体是由活细胞释放的球形膜性囊泡，大小为30-200 nm，密度为1.1-1.2 g/mL，含有CD81和肿瘤易感基因101（TSG101）等标志蛋白⁹。外泌体的生成与分泌可分为依赖于运输所需内体分选复合物（ESCRT）和非依赖于ESCRT的两条途径。这两条途径中最关键的调控因子是空泡蛋白分选4同源物a（VPS4a）和Ras相关蛋白Rab-27a（Rab27a）^10,11,12。Vps4a作为一种ATP酶，催化依赖ESCRT的膜重塑过程，从而调控外泌体的大小及形成速率^13,14。Rab27a是一种重要的小GTP酶，可调控多泡体与质膜的锚定¹⁵。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）对外泌体分泌起负向调控作用¹⁶，而MHY1485通过竞争性结合雷帕霉素的ATP结构域激活mTORC1¹⁷。因此，MHY1485可能间接抑制外泌体的合成与分泌。外泌体几乎可在所有体液中被检测到，其中血浆来源的外泌体产量高于其他体液中的外泌体¹⁸。此外，外泌体可保护其所携带的核酸免于降解¹⁹。

miRNA 是一类调控细胞活动的小分子非编码 RNA²⁰外泌体被发现富含多种对促进伤口血管生成至关重要的miRNA，特别是mir-126、mir-125a和mir-31-5p。先前一项研究表明，来源于过表达mir-126的骨髓间充质干细胞的外泌体可促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及成管能力。 体外 通过转移 mir-126²¹另一项研究表明，人脂肪来源的间充质干细胞分泌的外泌体将miR-125a转移至内皮细胞，通过抑制伤口中血管生成抑制因子Delta-like 4促进血管生成⁹Yan 等报道，载有 mir-31-5p 的乳源性外泌体可改善内皮细胞功能 体外，促进血管生成，并增强糖尿病伤口愈合 体内²²在这些miRNA中，mir-31-5p 是唯一在糖尿病小鼠伤口中相较于正常小鼠伤口显著下调的miRNA。²².

MEBO 是一种油性软膏，可用于治疗难愈性创面，如糖尿病创面（CDWs）^23,24。然而，MEBO 促进创面愈合的作用机制尚未阐明。既往研究显示，MEBO 可通过上调糖尿病大鼠血管内皮生长因子的表达来促进创面新生血管形成²⁵。但仅有少数研究从外泌体携带的miRNA角度探讨该问题。本研究中，为探讨MEBO对糖尿病创面（CDWs）的影响，我们采用链脲佐菌素（STZ）联合高脂饮食在糖尿病小鼠中建立全层皮肤缺损创面模型。结果显示，MEBO显著加速了糖尿病小鼠的创面愈合。此外，我们还检测了MEBO对创面组织中微血管密度、pExo-mir-31-5p表达水平以及VPS4a和Rab27a的mRNA和蛋白表达的影响。因此，我们提出假设：MEBO通过调控pExo-mir-31-5p，进而调节糖尿病小鼠创面的血管生成，从而促进创面愈合。本研究设计的示意图见图1。

方案

所有动物实验方案均经中国百色右江民族医学院动物护理与使用委员会批准（2018051501）。将无特定病原体（SPF）级雄性C57BL/6小鼠（7周龄）饲养于右江民族医学院SPF级实验动物中心，给予普通或高脂饮食及清洁饮水。在整个研究期间，动物饲养室温度维持在23 °C至25 °C，湿度为40%至60%，光照/黑暗循环为12小时。动物护理遵循美国国立卫生研究院和中国北京国家卫生研究院的指导原则。所有手术操作均在戊巴比妥钠麻醉（0.3%，50 mg/kg）下进行，采用本实验室建立的标准化操作方案。所有努力均旨在减少使用动物数量并最大限度减轻动物不适。本报告的各个部分均遵循动物研究ARRIVE指南。

小鼠伤口模型及处理
共120只小鼠被随机分配至非糖尿病对照组（NDB-CTR；n = 24）或糖尿病组（n = 96）。为模拟人类2型糖尿病，糖尿病组小鼠先给予高脂、精制糖饮食喂养4周，随后在禁食16小时后，连续2天每天一次经腹腔注射（ip）链脲佐菌素（STZ，100 mg/kg）。STZ注射后第5天和第6天检测空腹血糖水平。若小鼠两次空腹血糖值均超过16.7 mmol/L，并伴有食欲亢进、多饮、多尿和体重减轻等症状，则判定为糖尿病造模成功²⁶。造模1周后，剃除小鼠背部毛发，在腹腔注射戊巴比妥钠（0.3%，50 mg/kg）麻醉后，于每只小鼠背部制作一个直径为15 mm的圆形全层皮肤伤口。糖尿病组小鼠进一步随机分为MEBO组、BFX（倍复欣）组、DB-CTR（糖尿病对照）组和MHY1485（MHY）组。MEBO组和BFX组小鼠分别每天一次在伤口处涂抹MEBO（0.2 g/cm²）和BFX凝胶（0.2 g/cm²）。BFX凝胶的通用名为牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶，是一种用于治疗慢性伤口的外用药物²⁷。NDB-CTR组、DB-CTR组和MHY组小鼠则使用生理盐水处理。MHY组 additionally 接受MHY1485（10 mg/kg，ip）连续2天腹腔注射治疗。糖尿病小鼠每日一次皮下注射胰岛素（剂量为2–4 IU/kg），以控制血糖水平。

标本采集
在第1、7、13和18天，每组随机选取6只小鼠，通过颈椎脱位法实施安乐死，并使用无菌组织剪从伤口边缘0.5 cm处取包含伤口的环形表皮组织。随后收集伤口组织用于苏木精-伊红（HE）染色、实时荧光定量PCR（qPCR）分析及蛋白质印迹（WB）检测。在戊巴比妥钠麻醉下，采用眶后静脉丛采血法采集糖尿病对照组（DB-CTR）和湿润烧伤膏组（MEBO）小鼠的血液样本。血液样本收集至含肝素的抗凝管中，于3,000 × g 离心15分钟，收集血浆上清液。所有样本均储存于-80 °C。为计算伤口愈合率，使用数码相机在固定时间点、固定距离下拍摄伤口愈合情况，并在旁边放置带刻度的标尺。使用ImageJ软件测量伤口面积。伤口愈合率按以下公式计算：

伤口闭合率（%）= [W1-Wn] / W1 × 100%

其中 W1 和 Wn 分别表示第 1 天和第 n 天的伤口面积。

组织病理学检测
采用苏木精-伊红（HE）染色法动态观察创面愈合的病理过程。创面组织经4%多聚甲醛溶液固定16小时后，进行脱水、石蜡包埋，并切成3 µm厚的切片。对组织切片进行HE染色。为评估创面组织中的微血管密度，使用光学显微镜对切片进行成像。为定量分析每个样本的微血管密度，我们首先在10倍物镜下选择毛细血管密度最高的区域，随后在20倍物镜下选取三个无重叠的视野进行拍照。使用ImageJ软件对微血管密度进行计算并取平均值。

血浆外泌体的分离与表征
采用已发表方案并稍作修改，通过超速离心法分离血浆外泌体²⁸。简言之，取 2 mL 血浆在 4 °C 条件下以 2,000 × g 离心 30 分钟。将上清液转移后，在 4 °C 条件下以 10,000 × g 再次离心 45 分钟，以去除较大的囊泡。将上清液经 0.45 µm 滤膜过滤，并收集滤过液。随后将滤过液在 4 °C 条件下以 100,000 × g 离心 70 分钟。弃去上清液后，将沉淀物用 10 mL 预冷的 1× PBS 重悬，并在 4 °C 条件下以 100,000 × g 再次离心 70 分钟。弃去上清液后，将沉淀物用 150 µL 预冷的 1× PBS 重悬，并于 -80 °C 保存。为验证上述收集的血浆外泌体，我们采用透射电子显微镜（TEM）检测外泌体的形态，使用纳米流式细胞仪分析外泌体的大小和浓度，并通过 WB 检测外泌体标志物 CD81 和 TSG101 的表达水平。

RNA提取、逆转录（RT）和qPCR
采用qPCR检测Vps4a、Rab27a和pExo-mir-31-5p的mRNA表达水平。收集伤口组织，使用RNA提取试剂提取总RNA，RNA浓度在400–700 ng/µL范围内视为合格。按照制造商说明书，使用含dsDNase的逆转录酶将RNA样本逆转录为cDNA。采用SYBR Green qPCR Mix（无ROX）进行qPCR检测。对于mir-31-5p，从血浆外泌体中提取RNA，使用小型试剂盒（mini kit），并通过First Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，随后使用SYBR Green qPCR Master Mix进行扩增。采用2-ΔΔCt法对mRNA和miRNA的表达水平进行相对定量分析 β-actin 和 cel-mir-39，分别。所用引物列于 表1.

Western blot
采用WB检测Vps4a和Rab27a蛋白的表达水平，以及外泌体标志物CD81和TSG101的水平。使用RIPA裂解缓冲液提取创面组织和血浆外泌体的总蛋白，并利用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取50 µg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。转膜至聚偏二氟乙烯膜后，用牛血清白蛋白封闭，随后在4 °C下与一抗孵育过夜，一抗包括Vps4a（1:3000）、Rab27a（1:1000）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（1:5000）、CD81（1:3000）和TSG101（1:3000），之后在37 °C下与辣根过氧化物酶标记的二抗（抗兔IgG，1:3000）孵育1小时。使用增强型化学发光试剂盒显影膜信号。

统计学分析
本研究中所有数据均使用 SPSS 软件进行统计学显著性分析。分析所得结果均通过 GraphPad Prism 软件进行可视化展示。两组之间的差异采用独立样本 t 检验进行评估。对于多组比较，方差齐性数据采用单因素方差分析，而方差不齐数据则采用 Welch 检验。此外，对于方差齐性数据的两两比较，采用最小显著差异法（LSD 法）；对于方差不齐数据，则采用 Tamhane's T2 检验。定量数据以均值 ± 标准差表示。非正态分布变量的相关性采用 Spearman 相关性分析，并以相关系数及 95% 置信区间描述。P < 0.050 被认为具有统计学显著性。所有实验均至少重复三次。

结果

MEBO促进糖尿病小鼠的伤口愈合
为验证MEBO在糖尿病伤口中的疗效，我们建立了糖尿病伤口模型，并在第1、7、13和18天拍摄了伤口照片。各组伤口随时间逐渐愈合（图2A）。NDB-CTR组的伤口在第18天完全愈合。在糖尿病伤口各组中，MEBO组愈合速度最快，第7天出现少量粉红色肉芽组织颗粒，第13天脱痂后形成大片鲜红色肉芽组织，至第18天基本修复，肉芽组织明显减少。BFX组的伤口在第18天几乎完全愈合。DB-CTR组的愈合速度较BFX组更慢。MHY组的愈合时间最长。为定量分析伤口愈合情况，将照片导入ImageJ软件以计算伤口闭合率。结果显示，各组的伤口闭合率随时间逐渐升高（图2B）。在第7、13和18天，MEBO组的伤口闭合率显著高于其他三个糖尿病伤口组（p < 0.050）。各组小鼠在实验期间的空腹血糖水平如图2C所示。上述结果证实，MEBO可加速糖尿病小鼠的伤口愈合。

讨论

糖尿病创面（CDWs）是糖尿病的一种并发症，可导致显著的死亡率和残疾率，常与血管疾病相关²⁹。湿润烧伤膏（MEBO）对治疗CDWs有效，但其潜在机制尚不明确³⁰。因此，本研究旨在从外泌体及功能性miRNA的角度探讨其作用机制。本研究发现，在糖尿病小鼠模型中，MEBO组在各个时间点的创面愈合率和微血管密度均为最高。qPCR和WB结果显示，MEBO组在各个时间点的创面组织中VPS4a和Rab27a的mRNA及蛋白表达水平，以及pExo-mir-31-5p的表达水平均最高，且表达趋势均呈现先升高后降低的特点：第7天达到峰值，第13天略有下降，第18天逐渐下降。此外，相关性分析显示，在MEBO组中，VPS4a、Rab27a、pExo-mir-31-5p与微血管密度呈正相关。综上所述，MEBO可能通过动态调控糖尿病创面新生血管形成及pExo-mir-31-5p的表达，促进糖尿病创面修复。

目前，慢性糖尿病伤口（CDWs）的管理标准主要包括血糖控制、感染预防、患者教育以及局部伤口清创，其中局部伤口管...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1×PBS	索莱宝（中国北京）	#P1020	缓冲液
4% 多聚甲醛溶液	索莱宝（中国北京）	#P1110	固定组织
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG	Affinity	#S0001	二抗
贝复欣凝胶	艾斯试剂（中国珠海）	#042404A06	治疗慢性伤口的药膏
CD81 抗体	Signalway Antibody	#41779	一抗
增强型化学发光检测试剂盒	易沛（中国）	#SQ101	用于蛋白条带的化学发光检测
甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体	Affinity	#AF7021	一抗
GraphPad Prism	https://www.graphpad.com/prism/		数据可视化
ImageJ	https://imagej.net/ij/		测量伤口面积
快速双辛酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒	易沛（中国）	#ZJ102	测定蛋白浓度
LightCycler96 系统	罗氏		qPCR 仪器
MHY1485	MedChemExpress（美国）	#326914-06-1	mTORC1（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1）激活剂
miRNeasy 小量试剂盒	天根（中国）	#217004	RNA 提取（miRNA）
湿润烧伤膏	美宝（中国汕头）	#2403103B	治疗慢性伤口的药膏
MonAmp SYBR Green qPCR Mix（无ROX）	Monad（中国）	#MQ10101S	qPCR 试剂盒（mRNA）
MonScript RTIII 一步法反转录试剂盒（含dsDNase）	Monad（中国）	#MR05101S	反转录试剂盒（mRNA）
纳米流式细胞仪系统	N30E（中国）		用于分析外泌体大小和浓度的设备
光学显微镜	奥林巴斯（日本东京）		观察组织病理形态
生理盐水	科伦（中国四川）	#L24041709	生理盐水
聚偏二氟乙烯膜	Millipore（美国）	#IPVH00010	Western blot 转膜
引物	生工生物工程有限公司（中国上海）
Rab27a 抗体	Cell Signaling Technology	#69295	一抗
RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒	赛默飞世尔（美国）	#K1622	反转录试剂盒（miRNA）
RIPA 裂解缓冲液	索莱宝（中国北京）	#R0010	总蛋白提取
十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺–	易沛（中国）	#PG222	电泳缓冲液
戊巴比妥钠	默克（中国上海）	#P3761	麻醉剂
SPF级雄性C57BL/6小鼠	广东维通利华实验动物技术有限公司（中国广东）		实验动物
SPSS	https://www.ibm.com/spss		统计分析
链脲佐菌素	索莱宝（中国北京）	#S8050	诱导糖尿病小鼠模型
SYBR Green qPCR 主混合液	罗氏（瑞士）	#4943914001-SR	qPCR 试剂盒（miRNA）
透射电子显微镜	日立（日本）	HT-7700	用于确定外泌体形态的设备
TRIZOL	英坦科技（美国）	#15596026CN	RNA 提取（mRNA）
TSG101 抗体	Abcam	# ab125011	一抗
Vps4a 抗体	Abcam	# ab197896	一抗