本文描述了湿润烧伤膏如何通过动态调控糖尿病创面新生血管形成及血浆外泌体miR-31-5p的表达，促进糖尿病创面修复。
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研究文章
湿润暴露烧伤膏对糖尿病小鼠创面新生血管及血浆外泌体miR-31-5p的影响
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
湿润烧伤膏（MEBO）是一种用于治疗慢性糖尿病创面的传统中药，但其潜在作用机制尚不明确。近期研究表明，外泌体及功能性miRNA在创面新生血管形成中发挥重要作用。本研究旨在探讨MEBO对糖尿病小鼠创面新生血管化及血浆外泌体miR-31-5p（pExo-miR-31-5p）表达的影响。共120只C57BL/6小鼠随机分为非糖尿病对照组（n = 24）和链脲佐菌素诱导的糖尿病组（n = 96），后者进一步随机分为糖尿病对照组、MEBO组、贝复新组和MHY1485组（每组n = 24）。建立五组全层皮肤切除模型，分别以生理盐水、生理盐水、MEBO、贝复新和MHY1485进行处理。在第1、7、13和18天，分别采用ImageJ软件、苏木精-伊红（HE）染色、实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质印迹法（WB）分析创面愈合率、微血管密度、pExo-miR-31-5p表达水平以及创面组织中VPS4a和Rab27a的mRNA与蛋白表达水平。此外，分析VPS4a、Rab27a蛋白、pExo-miR-31-5p表达与微血管密度之间的相关性。研究发现，MEBO可促进糖尿病小鼠创面修复（p < 0.050）。MEBO在创面愈合的早期和中期阶段促进新生血管形成，但在后期阶段则抑制该过程（p < 0.050）。MEBO在愈合早期和中期上调创面组织中Vps4a和Rab27a的mRNA和蛋白表达，以及pExo-miR-31-5p的表达水平，而在后期阶段则下调这些指标（p < 0.050）。此外，在MEBO处理的小鼠中，VPS4a、Rab27a蛋白、pExo-miR-31-5p表达水平与微血管密度呈正相关（p < 0.050）。综上所述，MEBO在糖尿病小鼠中动态调控创面新生血管化及pExo-miR-31-5p的表达，为其临床应用提供了新的理论依据。
引言
老年患者中糖尿病的患病率较高，且每年呈上升趋势。该疾病常伴随慢性糖尿病伤口（CDWs），对患者的健康状况、功能以及整体生活质量产生不利影响1。通常，伤口愈合包括四个明确的阶段：止血期、炎症期、增殖期和再上皮化期2。其中，增殖期最为关键。在增殖期早期，毛细血管内皮细胞增殖并迁移至伤口部位，出芽形成新血管，并构建复杂的血管网络3。然而，在伤口修复的后期，大多数毛细血管管腔会发生闭塞，仅有少数转变为小动脉和小静脉。在CDW患者中，组织缺失、坏死和坏疽，以及不同程度的炎症和高血糖状态，会破坏血管生成与抗血管生成之间的动态平衡，从而延缓伤口愈合，尤其是在血管生成受损的情况下尤为明显4,5,6。湿润烧伤膏（MEBO）是一种用于治疗CDWs的中药，但其作用机制尚不明确。近年来，多项研究表明，外泌体携带的miRNA可促进血管生成，从而加速糖尿病伤口的愈合7,8。然而，目前关于MEBO与外泌体携带miRNA之间关联的研究仍较少。因此，亟需从外泌体及功能性miRNA的角度揭示MEBO促进CDWs血管生成的作用....
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方案
所有动物实验方案均经中国百色右江民族医学院动物护理与使用委员会批准（2018051501）。将无特定病原体（SPF）级雄性C57BL/6小鼠（7周龄）饲养于右江民族医学院SPF级实验动物中心，给予普通或高脂饮食及清洁饮水。在整个研究期间，动物饲养室温度维持在23 °C至25 °C，湿度为40%至60%，光照/黑暗循环为12小时。动物护理遵循美国国立卫生研究院和中国北京国家卫生研究院的指导原则。所有手术操作均在戊巴比妥钠麻醉（0.3%，50 mg/kg）下进行，采用本实验室建立的标准化操作方案。所有努力均旨在减少使用动物数量并最大限度减轻动物不适。本报告的各个部分均遵循动物研究ARRIVE指南。
小鼠伤口模型及处理
共120只小鼠被随机分配至非糖尿病对照组（NDB-CTR；n = 24）或糖尿病组（n = 96）。为模拟人类2型糖尿病，糖尿病组小鼠先给予高脂、精制糖饮食喂养4周，随后在禁食16小时后，连续2天每天一次经腹腔注射（ip）链脲佐菌素（STZ，100 mg/kg）。STZ注射后第5天和第6天检测空腹血糖水平。若小鼠两次空腹血糖值均超过16.7 mmol/L，并伴有食欲亢进、多饮、多尿和体重减轻等症状，则判定为糖尿病造模成功26。造模1周后，剃除小鼠背部毛发，在腹腔注射戊巴比妥钠（0.3%，50 mg/kg）麻醉后，于每只小鼠背部制作一个直径为15 mm的圆形全层皮肤伤口。糖尿....
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结果
MEBO促进糖尿病小鼠的伤口愈合
为验证MEBO在糖尿病伤口中的疗效，我们建立了糖尿病伤口模型，并在第1、7、13和18天拍摄了伤口照片。各组伤口随时间逐渐愈合（图2A）。NDB-CTR组的伤口在第18天完全愈合。在糖尿病伤口各组中，MEBO组愈合速度最快，第7天出现少量粉红色肉芽组织颗粒，第13天脱痂后形成大片鲜红色肉芽组织，至第18天基本修复，肉芽组织明显减少。BFX组的伤口在第18天几乎完全愈合。DB-CTR组的愈合速度较BFX组更慢。MHY组的愈合时间最长。为定量分析伤口愈合情况，将照片导入ImageJ软件以计算伤口闭合率。结果显示，各组的伤口闭合率随时间逐渐升高（图2B）。在第7、13和18天，MEBO组的伤口闭合率显著高于其他三个糖尿病伤口组（p < 0.050）。各组小鼠在实验期间的空腹血糖水平如图2C所示。上述结果证实，MEBO可加速糖尿病小鼠的伤口愈合。
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讨论
糖尿病创面（CDWs）是糖尿病的一种并发症，可导致显著的死亡率和残疾率，常与血管疾病相关29。湿润烧伤膏（MEBO）对治疗CDWs有效，但其潜在机制尚不明确30。因此，本研究旨在从外泌体及功能性miRNA的角度探讨其作用机制。本研究发现，在糖尿病小鼠模型中，MEBO组在各个时间点的创面愈合率和微血管密度均为最高。qPCR和WB结果显示，MEBO组在各个时间点的创面组织中VPS4a和Rab27a的mRNA及蛋白表达水平，以及pExo-mir-31-5p的表达水平均最高，且表达趋势均呈现先升高后降低的特点：第7天达到峰值，第13天略有下降，第18天逐渐下降。此外，相关性分析显示，在MEBO组中，VPS4a、Rab27a、pExo-mir-31-5p与微血管密度呈正相关。综上所述，MEBO可能通过动态调控糖尿病创面新生血管形成及pExo-mir-31-5p的表达，促进糖尿病创面修复。
目前，慢性糖尿病伤口（CDWs）的管理标准主要包括血糖控制、感染预防、患者教育以及局部伤口清创，其中局部伤口管.......
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
本研究由国家自然科学基金（项目编号 81960875）、广西自然科学基金（项目编号 2023GXNSFDA026008）、广西医疗卫生适宜技术开发与应用项目（项目编号 S2022134）、广西壮族自治区卫生健康委员会西医自筹科研项目（项目编号 20210234）以及广西壮族自治区中医药管理局自筹科研项目（项目编号 GZZC2020255）资助。
作者贡献：
徐媛媛：撰写初稿，软件，方法学，调查，正式分析，概念化。徐建昌：资源，方法学，调查。周安邦：调查，正式分析。岑妮苗：可视化。黄丽娜：监督。吴彪亮：撰写审阅 & 编辑、资源、项目管理、方法学、资金获取、数据管理、概念化。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1×PBS | 索莱宝（中国北京） | #P1020 | 缓冲液 |
| 4% 多聚甲醛溶液 | 索莱宝（中国北京） | #P1110 | 固定组织 |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Affinity | #S0001 | 二抗 |
| 贝复欣凝胶 | 艾斯试剂（中国珠海） | #042404A06 | 治疗慢性伤口的药膏 |
| CD81 抗体 | Signalway Antibody | #41779 | 一抗 |
| 增强型化学发光检测试剂盒 | 易沛（中国） | #SQ101 | 用于蛋白条带的化学发光检测 |
| 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体 | Affinity | #AF7021 | 一抗 |
| GraphPad Prism | https://www.graphpad.com/prism/ | 数据可视化 | |
| ImageJ | https://imagej.net/ij/ | 测量伤口面积 | |
| 快速双辛酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒 | 易沛（中国） | #ZJ102 | 测定蛋白浓度 |
| LightCycler96 系统 | 罗氏 | qPCR 仪器 | |
| MHY1485 | MedChemExpress（美国） | #326914-06-1 | mTORC1（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1）激活剂 |
| miRNeasy 小量试剂盒 | 天根（中国） | #217004 | RNA 提取（miRNA） |
| 湿润烧伤膏 | 美宝（中国汕头） | #2403103B | 治疗慢性伤口的药膏 |
| MonAmp SYBR Green qPCR Mix（无ROX） | Monad（中国） | #MQ10101S | qPCR 试剂盒（mRNA） |
| MonScript RTIII 一步法反转录试剂盒（含dsDNase） | Monad（中国） | #MR05101S | 反转录试剂盒（mRNA） |
| 纳米流式细胞仪系统 | N30E（中国） | 用于分析外泌体大小和浓度的设备 | |
| 光学显微镜 | 奥林巴斯（日本东京） | 观察组织病理形态 | |
| 生理盐水 | 科伦（中国四川） | #L24041709 | 生理盐水 |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore（美国） | #IPVH00010 | Western blot 转膜 |
| 引物 | 生工生物工程有限公司（中国上海） | ||
| Rab27a 抗体 | Cell Signaling Technology | #69295 | 一抗 |
| RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒 | 赛默飞世尔（美国） | #K1622 | 反转录试剂盒（miRNA） |
| RIPA 裂解缓冲液 | 索莱宝（中国北京） | #R0010 | 总蛋白提取 |
| 十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺– | 易沛（中国） | #PG222 | 电泳缓冲液 |
| 戊巴比妥钠 | 默克（中国上海） | #P3761 | 麻醉剂 |
| SPF级雄性C57BL/6小鼠 | 广东维通利华实验动物技术有限公司（中国广东） | 实验动物 | |
| SPSS | https://www.ibm.com/spss | 统计分析 | |
| 链脲佐菌素 | 索莱宝（中国北京） | #S8050 | 诱导糖尿病小鼠模型 |
| SYBR Green qPCR 主混合液 | 罗氏（瑞士） | #4943914001-SR | qPCR 试剂盒（miRNA） |
| 透射电子显微镜 | 日立（日本） | HT-7700 | 用于确定外泌体形态的设备 |
| TRIZOL | 英坦科技（美国） | #15596026CN | RNA 提取（mRNA） |
| TSG101 抗体 | Abcam | # ab125011 | 一抗 |
| Vps4a 抗体 | Abcam | # ab197896 | 一抗 |
参考文献
- Zhi, Q., et al. The effectiveness of cell-derived exosome therapy for diabetic wound: A systematic review and meta-analysis. Ageing Res Rev. 85, 101858(2023).
- David, S., Vikrant, R., Sarah, M., Kira, C., Devendra, K. A.
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重印与许可
