一种集成诊断与治疗功能的智能结构色水凝胶贴片用于慢性骨髓炎的管理

摘要

本研究介绍了一种用于慢性骨髓炎（COM）诊断与治疗的智能结构色水凝胶贴片（CPG）。该贴片集成了温度响应性 GelMA 水凝胶、pH 敏感性 CSMA-PBA 支架以及水杨酸，可实现药物的可控释放、感染状态监测以及促进组织再生。

摘要

慢性骨髓炎（COM）是一种持续性骨感染，由于耐药性和不良副作用等问题，常规抗生素治疗难度较大。为应对这一挑战，我们开发了一种新型智能结构色水凝胶贴片（CPG），用于COM的诊断与治疗。该贴片以苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化壳聚糖（CSMA-PBA）为支架，温敏性GelMA水凝胶为填充材料，水杨酸（SA）用于药物递送。表征结果显示其具有优异的机械性能和粘附强度。药物释放实验表明，CPG能有效响应pH变化，实现可控药物释放。CPG还可通过检测感染部位的pH和温度变化发挥诊断作用，辅助术后恢复。抗菌实验显示其对细菌生长具有显著抑制作用， 体外 实验表明，CPG 能够促进血管内皮生长因子的表达，同时降低炎症标志物。该研究强调了水凝胶贴片的多功能特性，包括抗菌、抗炎和促血管生成作用，使其成为慢性骨髓炎的一种有前景的治疗选择。

引言

慢性骨髓炎因其治疗过程复杂且漫长、治疗失败风险高以及易复发，已成为患者面临的主要问题¹。目前治疗骨髓炎的策略主要包括坏死组织的外科清创和全身性抗生素治疗。然而，为在作用部位达到有效治疗浓度而需使用高剂量抗生素，仍难以有效控制疾病。此外，高剂量抗生素的使用还可能引发多种不良反应，如肾毒性、耳毒性、抗生素耐药性以及胃肠道副作用。局部抗生素递送可能是克服上述缺陷的更合适策略。虽然局部递送抗生素可在最小副作用下治疗骨感染，但诱导骨再生对于实现成功治疗至关重要²。因此，同时递送抗生素与骨生长因子似乎是一种具有前景的治疗策略。在过去几十年中，不可降解的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）一直是骨髓炎局部抗生素治疗的主要载体。然而，PMMA作为局部抗生素递送系统存在诸多局限性，包括需要二次手术取出珠粒、易形成细菌生物膜从而促进表面定植、长期以亚治疗浓度释放抗生素导致耐药性、残留单体的全身毒性，以及缺乏骨诱导性能³。因此，开发基于生物相容性聚合物的可降解局部递送系统可能有助于克服这些缺点。文献表明，将丝素蛋白纳米颗粒（SFNPs）整合入丝素支架中用于万古霉素的局部递送，可用于治疗重度骨髓炎。然而，由于该纳米复合材料中缺乏任何骨诱导性生物活性分子，所制备的支架未能显著促进骨再生。因此，设计适用于慢性骨髓炎治疗的纳米复合支架材料一直是备受关注的难题。基于天然聚合物的水凝胶因其结构与细胞外基质（ECM）相似，并具备调控药物释放的能力，已受到广泛关注⁴。

水凝胶的一个显著特性是其对温度和pH等不同因素的响应性。由于微生物负荷增加、再生-降解平衡失调以及代谢分解反应增强，慢性感染可能导致pH升高。此外，通过手术切除清创物质（如坏死组织和脓液）可能进一步加速pH向更高值转变⁵。因此，使用能够感知慢性感染pH的pH敏感型水凝胶对于慢性骨髓炎的预后至关重要。

本研究提出一种利用智能结构色水凝胶贴片的综合诊疗方法，该贴片具备治疗慢性骨髓炎所需的各项特性，如图1所示。超分子水凝胶由超分子聚合物网络组装而成，是一种类似于天然细胞外基质（ECM）的有吸引力的材料。由于其具有适宜的机械强度、自愈合、抗菌和抗炎等优异性能，超分子水凝胶已在生物医学领域得到广泛应用⁶。相比之下，结构色是一种由光与内在周期性纳米结构独特相互作用产生的颜色，在光学显示、防伪标签和可穿戴电子设备等领域受到广泛关注。特别是当结构色材料由响应性聚合物构建时，其颜色可通过这些聚合物的膨胀或收缩，对外界不同刺激作出响应而发生改变，表明此类材料具有作为传感器的潜力。因此，可以设想将超分子水凝胶与结构色相结合，将为构建用于治疗慢性骨髓炎的新型水凝胶贴片提供一种独特的策略^7,8,9。

本研究中，我们开发了一种集成诊断与治疗功能的一体化方法，采用智能结构色水凝胶贴片（CPG），该贴片由苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化壳聚糖（CSMA-PBA）作为抗蛋白石支架、温敏性 GelMA 水凝胶作为填充材料，并负载水杨酸（SA）¹⁰构成。由于网络内部氢键及非共价相互作用具有可逆性，所制备的水凝胶贴片不仅表现出优异的力学性能，还具备自愈合能力。此外，由于含有 CSMA，该水凝胶贴片还展现出显著的抗菌生物活性。同时，利用 GelMA 聚合物的温敏特性，当贴片置于炎症部位相对较高温度环境中时，可实现活性物质的释放。此外，由于 CSMA-PBA 中含有硼酸酯键，该水凝胶对环境 pH 的变化具有响应性¹¹。基于上述优势，我们证明了所提出的结构色超分子水凝胶贴片可通过下调炎症因子表达、发挥抗菌作用以及促进血管生成来治疗慢性骨髓炎。值得注意的是，得益于抗蛋白石支架独特的光学特性，该水凝胶贴片甚至可在温度刺激下呈现变色能力，在慢性骨髓炎的监测与管理以及指导临床治疗方面展现出重要潜力。

方案

所有实验程序均经医学伦理委员会批准，并遵循《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物第 80-23 号，1978 年修订版）进行。实验使用雄性 Sprague-Dawley 大鼠（8 周龄）。

二氧化硅胶体晶体模板（SCCs）的制备
SCCs 的制备方法如前所述^12,13,14。将清洗并经等离子体处理的玻璃载片浸入含有单分散二氧化硅纳米颗粒（直径为 12 nm）的去离子水溶液中，溶液中纳米颗粒浓度为 5%。在室温（25 °C）下持续搅拌溶液 1 小时，以确保二氧化硅纳米颗粒均匀分散。随后将载片从溶液中取出，在室温下空气中干燥 1 小时。干燥过程对于确保纳米颗粒在玻璃载片表面的充分附着至关重要。空气干燥后，将载片置于通风烘箱中，在 60 °C 下加热 2 天，以蒸发残留溶剂并促进胶体晶体的形成。在此蒸发过程中，将载片以 45° 角度放置，以促进有序胶体晶体阵列的形成。这些有序胶体晶体阵列通过自组装形成，并因颗粒间距不同而呈现出不同的结构色。随后将这些阵列用作水凝胶贴片制备的模板。

一体化诊疗智能结构色水凝胶贴片（CPG）的制备
抗蛋白结石支架通过复制二氧化硅胶体晶体模板（SCCs）中的孔隙结构获得。首先将洁净的玻璃载片浸入去离子水中含5%单分散二氧化硅纳米颗粒（直径12 nm）的溶液中，在室温（25 °C）下搅拌1小时，以确保纳米颗粒在表面均匀分散。搅拌过程至关重要，可防止颗粒聚集并保证纳米颗粒分布均一。浸渍后，载片在室温（RT）下自然晾干1小时，随后在60 °C烘箱中干燥2天，以促进溶剂蒸发，并推动二氧化硅纳米颗粒自组装形成高度有序的胶体晶体阵列。在溶剂蒸发过程中，将载片置于45°倾斜角度，以利于纳米颗粒的定向排列，促进形成具有可控粒子间距的周期性阵列。该有序阵列呈现出胶体晶体特有的结构色，作为后续水凝胶结构的模板。

将制备好的二氧化硅胶体晶体（SCCs）浸入CPG预凝胶溶液中，该溶液由浓度为10% w/v的GelMA溶解于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中组成。样品在室温（RT）下静置5分钟，以确保GelMA充分渗入二氧化硅纳米颗粒之间的孔隙，从而在模板结构内实现均匀分布。此步骤至关重要，可确保水凝胶基质均匀地整合进模板中，并使最终形成的水凝胶结构能够复制SCCs的有序纳米颗粒排列。浸渍完成后，在365 nm紫外光、光强为3 mW/cm²的条件下照射5分钟，使预凝胶溶液发生聚合。该紫外照射引发GelMA的交联反应，从而使水凝胶基质固化。照射时间和光强经过仔细优化，以实现充分交联，同时避免对水凝胶过度照射，防止产生过度凝胶化或模板结构破坏。

CPG 的表征
在用金对样品（1 mm × 1 mm）进行镀膜后，采用 5 kV 加速电压的扫描电子显微镜（SEM）观察水凝胶的横截面形貌¹⁵。该方法使我们能够观察纳米多孔结构，并确认水凝胶网络的均匀性。通过将 10 mg 水凝胶样品浸入 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，在不同时间点（0、30、60、120 和 180 分钟）测定其溶胀行为。通过测量水凝胶体积随时间的增加来计算溶胀率百分比，从而了解水凝胶在不同条件下吸水的能力。采用流变仪在 1% 应变下进行流变学分析，施加 1 rad/s 至 100 rad/s 的角频率，测定储能模量（G'）和损耗模量（G''）。该步骤对于理解水凝胶的机械性能至关重要，包括其在应力作用下的黏弹性行为。剪切黏附性能依据 ASTM F2255-05（2015）标准，使用万能拉伸试验机（Instron）以 10 mm/min 的速度和 0.01 N 的预载荷进行评估，以测定水凝胶对生物组织的黏附能力。药物释放行为通过紫外分光光度计测定，将水凝胶浸入 5 mL PBS（pH 7.4）后，在 λ = 280 nm 处监测吸光度。利用水杨酸浓度的标准曲线对释放量进行定量，以验证 CPG 水凝胶的可控释放能力。最后，将水凝胶分别浸入 pH 4.5 和 pH 7.2 的缓冲溶液中 30 分钟，评估其 pH 响应性，观察在不同 pH 条件下体积和外观的变化¹⁶。

CPG 贴片对温度和 pH 的响应性
将直径约 2 mm 的 CPG 贴片置于 5 mL、pH 7.2 的缓冲溶液中，并在恒温水浴中保持 37 °C 30 分钟，以模拟生理条件。使用紫外-可见分光光度计在 400 nm 至 800 nm 波长范围内测量反射光谱。初始测量完成后，将贴片转移至不同 pH 值（如 pH 4.5、7.2 和 9.0）的缓冲溶液中，并在 37 °C 下维持 30 分钟。通过肉眼观察贴片对微环境（包括任何颜色变化）的响应，并再次记录反射光谱以分析颜色偏移。该温度与 pH 响应性可提供有关水凝胶如何响应伤口环境变化的重要信息。

体外 抗菌测试
采用标准方法进行抗菌试验。 金黄色葡萄球菌 (S. aureus，ATCC 25923）和 大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli），ATCC 53868）菌株用于评估CPG贴片的抗菌活性。这些标准参考菌株购自美国模式培养物集存库（ATCC），并作为质量控制（QC）菌株以验证抗菌检测程序。根据CLSI M100指南，采用肉汤微量稀释法进行抗菌药物敏感性试验。细菌悬液制备于Mueller-Hinton肉汤中，该培养基是抗菌试验的标准培养基。悬液浊度调整至0.5麦氏标准，相当于约1.5 × 10⁸ CFU/mL。随后将悬浮液接种含有CPG贴片（直径2 mm）的培养物，贴片使用去离子水或pH 6.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液（10 mM）制备。每1 mL菌液加入1片贴片。将悬浮液在37 °C下孵育24 h。孵育后，通过将培养物进行系列稀释后涂布于营养琼脂平板，评估细菌生长情况，并在37 °C孵育24 h后计数菌落形成单位（CFUs）。该程序可定量评估抗菌效果。

生物相容性评价
实验按照先前描述的方法进行。CPG 贴片经 PBS（pH 7.4）透析处理 4 小时，随后用 70% 乙醇灭菌 10 分钟，并在 365 nm 紫外线下消毒 30 分钟，以确保去除所有生物污染物。L929 细胞（ATCC CCL-1）在含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中，于 37 °C、5% CO² 条件下培养以维持细胞活力。将细胞以 2 × 10⁵ 个/mL 的密度接种于 24 孔板中，每组设三个复孔，分别加入或不加入直径为 2 mm 的 CPG 贴片。实验分为三组：空白对照组、CPG 组和 CPG（MES）组。培养 24 小时后，采用 MTT 法检测细胞活力，该方法是评估细胞代谢活性的常用手段。MTT 实验中，每孔加入 20 µL MTT 溶液（5 mg/mL），于 37 °C 孵育 4 小时。孵育结束后，吸除培养基，每孔加入 150 µL DMSO 溶解活细胞生成的甲臜结晶。使用酶标仪在 570 nm 处测定吸光度，以定量活细胞数量。该方法可可靠地评估水凝胶贴片的细胞毒性和生物相容性。

抗炎活性
采用活性氧（ROS）检测试剂盒评估CPG的抗氧化活性。将L929细胞（ATCC CCL-1）接种于添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，在37 °C、5% CO₂条件下培养24小时，以促进细胞贴壁和初始增殖。为诱导氧化应激，使用3 µg/mL过氧化氢（H2O2）处理细胞12小时。在诱导氧化应激后，向细胞中加入水凝胶提取物（通过将1 mg CPG水凝胶溶于1 mL DMEM培养基中制备）。随后将细胞继续孵育12小时，以评估CPG水凝胶可能具有的抗氧化作用。之后，用10 µM DCFH-DA溶液（以DMEM培养基稀释）对细胞进行染色，并在37 °C孵育20分钟。DCFH-DA是一种荧光探针，用于检测细胞内活性氧（ROS）水平。染色后，用PBS洗涤细胞，并在激发波长485 nm、发射波长530 nm条件下，使用荧光显微镜采集荧光图像。绿色荧光强度与水凝胶的抗氧化活性呈负相关，从而可直观评估该水凝胶减轻细胞氧化应激的能力。

大鼠骨髓炎动物模型
建立慢性骨髓炎模型：采用雄性Sprague-Dawley大鼠（8周龄），使用异氟烷（2–3% 氧气混合）进行麻醉，以确保手术过程中动物保持不动且无痛感。在左侧股骨外侧做一长约2 cm的切口，使用无菌27号针头将1 × 10⁷ CFU的S. aureus直接注射至股骨松质骨区域。注射部位为股骨骨髓腔，以在骨髓腔内诱导感染，该部位是骨髓炎的主要发生部位。缓慢注入细菌，以确保其在骨髓内充分沉积。术后10天，通过吸入CO₂对大鼠实施安乐死，仔细解剖取出感染的股骨。从感染部位切除肉芽组织，并立即浸入4%多聚甲醛中固定24小时，以保持组织完整性。固定后，根据骨组织大小，使用脱钙剂（如EDTA）对骨组织进行48–72小时的脱钙处理，以便后续进行组织学和免疫组织化学分析时能够充分切片。脱钙后的骨组织样本随后用于组织学检查、免疫组织化学（IHC）和免疫荧光染色。用于定量实时PCR（qPCR）分析的肉芽组织则储存于-80 °C，以备后续提取RNA，用于分析与炎症、骨再生及免疫反应相关的基因表达谱

体内骨髓炎治疗效果评估
将肉芽组织包埋于石蜡中，使用切片机切取5 µm厚的组织切片。采用马松三色染色法（苏木精染色15分钟，苯胺蓝染色1小时）评估胶原沉积及组织重塑情况。采用苏木精-伊红（HE）染色（苏木精染色5分钟，伊红染色2分钟）观察组织的一般形态结构及炎症情况。进行免疫组织化学（IHC）染色，使用抗CD31抗体（1:100）和抗EGF抗体（1:200），37 °C孵育1小时，随后根据一抗种类选用相应的二抗（抗小鼠IgG或抗兔IgG，稀释比例1:200），室温孵育30分钟，以评估血管生成及生长因子表达情况。免疫荧光染色使用抗VEGF抗体（1:100）和抗bFGF抗体（1:200），37 °C孵育1小时，随后二抗室温孵育30分钟。使用荧光显微镜观察CD31、EGF、VEGF和bFGF的表达。进行定量实时PCR（qPCR）分析时，先使用RNAiso Plus提取RNA，并利用PrimeScript反转录试剂盒合成cDNA，随后检测促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的mRNA表达水平。PCR反应采用SYBR Green PCR Master Mix进行，以在分子水平上定量评估炎症反应。

质量控制措施
为确保实验结果的可靠性和可重复性，所有操作均按照标准化方案进行。每次实验均设置适当的对照组，包括空白对照组（感染金黄色葡萄球菌S. aureus但未接受任何治疗的大鼠）、对照组（仅接受手术操作但未感染细菌且未接受治疗的大鼠）以及比较治疗组（接受不同骨髓炎治疗方案的大鼠，如抗生素或实验性药物），以尽量减少实验变异。所有检测均重复三次，以确保结果一致性并降低实验偏差。每组包含6只大鼠，以保证统计学意义。仪器（包括紫外-可见分光光度计、流变仪和拉伸试验机）在使用前均按照制造商的规格进行常规校准。细菌和细胞培养均在生物安全柜内受控的环境条件下进行，染色程序也采用一致的方案以确保可重复性。数据采集采用统一的显微镜设置，以尽量减少样本间的差异并确保测量准确。

统计分析
统计分析使用 GraphPad Prism（版本 8.0）进行。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。对于多组之间的比较，采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验，以评估机械性能、热响应行为、抗菌活性和细胞活力的差异。当仅比较两组时，采用 Student t 检验，例如比较不同 pH 值或温度变化下 CPG 贴片反射峰的情况。所有分析中，p < 0.05 被认为具有统计学显著性。所有实验均重复三次，以确保结果的一致性和可重复性。

结果

CPG 贴片的制备与表征（图 1）
在典型实验中，单分散二氧化硅纳米颗粒通过溶剂蒸发自组装形成紧密排列的阵列，从而得到结构色涂层（SCC）^17,18,19，随后用于制备多功能结构色水凝胶贴片，如图 1所示。该过程包括通过毛细作用将预凝胶溶液渗透至SCC的纳米级间隙中，随后采用紫外光聚合形成SCC与水凝胶的复合薄膜。在去除SCC后，获得具有周期性多孔结构的反蛋白石支架。最后，将温敏性GelMA水凝胶填充至反蛋白石支架的纳米级间隙中，并经固化处理，从而制得独立的CPG贴片。

水凝胶的强交联网络赋予了CPG贴片优异的机械性能。观察发现，这些贴片足够坚韧，能够承受拉伸而不会造成任何损伤，并可拉伸至原始长度的2.5倍。重要的是，CPG贴片呈现出鲜明的结构色，并在拉伸过程中发生动态的颜色变化，这一独特特性源于贴片内部高度有序纳米结构的周期性排列。这些纳米结构形成了光子带隙（PBGs），使得处于PBG特定波长范围内的光被选择性反射而非透射，从而赋予CPG贴片其特有的结构色和反射峰。

CPG 贴片的反射峰位置可通过以下公式估算²⁰：

λ = 1.633dn_average

其中，d 为衍射面之间的距离，n_average 为材料的平均折射率，通过计算各组分（包括 GelMA 水凝胶及补片中使用的其他材料）折射率的平均值得到。该方程表明，当补片被拉伸且 d 减小时，反射波长随之减小，导致补片的结构色发生蓝移。此外，还测试了补片的拉伸强度，发现由于 GelMA 水凝胶填充至抗蛋白石支架的纳米级间隙中，补片的应变能力有所下降。CPG 补片在拉伸过程中的形变可为应变检测提供一种高灵敏度的方法，使其适用于需要力学监测的应用场景。

CPG 贴片的温敏性和 pH 敏感性行为（图 2）
由于 GelMA 水凝胶的存在，CPG 贴片表现出显著的温敏特性。当环境温度升高至 37 °C 时，水凝胶发生收缩，释放出水分子及负载的物质。这种收缩导致 CPG 贴片内部纳米孔尺寸减小，从而改变其光子带隙（PBG），并引起反射光谱的偏移。图 2 展示了这一现象，显示了贴片的结构色如何随温度和 pH 的变化而发生改变。

为验证这些观察结果，将CPG贴片置于37 °C、pH 7.2的模拟慢性感染伤口环境中。随着溶液pH值升高，CPG贴片的反射峰出现蓝移，表明纳米孔尺寸减小；相反，当pH值降低时，贴片出现红移，对应纳米孔的扩张。这种pH敏感性行为归因于酸性条件下CSMA-PBA中硼酸酯键的水解，导致化学键断裂并引起结构色的红移。然而，在碱性条件下，贴片未表现出显著的颜色变化，表明其在碱性环境中具有稳定性。这些结果表明，CPG贴片可用于监测伤口环境中的温度和pH变化，这对于有效的伤口管理至关重要。

CPG 贴片的抗菌活性（图3）
通过将 CPG 贴片与S. aureus和E. coli共培养，评估其抗菌性能。图3A、B显示，CPG 贴片显著抑制了细菌生长，表明其具有有效的抗菌特性。这种抗菌效果归因于贴片带正电荷的 CMCSMA 表面与带负电荷的细菌细胞壁之间的静电相互作用²¹。该相互作用破坏了细菌膜结构，导致细菌死亡。CMCSMA 的阳离子基团可与细菌膜中的阴离子成分结合，引起膜去极化并增加通透性²²。此外，由于 CMCSMA 分子相对较小且聚合物链具有柔韧性，能够更有效地穿透脂质双层，导致细胞内物质泄漏并干扰代谢活动。CMCSMA 分子的小尺寸进一步促进了其穿透细菌细胞膜，在膜内与关键生物分子相互作用，破坏细菌的代谢过程和酶系统²³。另外，考虑到S. aureus具有较强的生物膜形成能力，值得注意的是，已有研究报道，以壳聚糖为基础的材料（如 CMCSMA）可通过穿透胞外聚合物（EPS）基质并破坏其完整性，从而干扰生物膜结构。这使得抗菌剂能够接触并杀灭嵌入生物膜内的细菌——这些细菌通常对传统抗生素具有耐药性^24,25。如图3A所示，细菌菌落的直观对比清晰地显示出经 CPG 贴片处理后菌落数量显著减少，突显了其高效的杀菌活性以及在易感染伤口环境中应用的广阔前景。

CPG 贴片的生物学功能（图 4）
除了具有抗菌特性外，CPG 贴片还表现出显著的生物学功能。图 4C、D 显示，CPG 贴片能有效清除细胞内的活性氧（ROS），表现为 CPG 组绿色荧光信号减弱。在伤口愈合过程中，清除 ROS 至关重要，因为过量的 ROS 生成会损害组织再生。如图 4A所示，通过活/死细胞染色评估了与 CPG 贴片共培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的存活率。结果表明，大多数细胞存活，仅有少量细胞死亡，提示 CPG 贴片可促进细胞存活并支持细胞增殖。

图4B显示了MTT实验的结果，表明CPG贴片显著促进了细胞增殖。此外，图4F、G显示CPG贴片通过促进血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达，增强了血管生成，而这些因子对内皮细胞增殖和新生血管形成至关重要。这些结果凸显了CPG贴片不仅具有预防感染的潜力，还能促进组织再生并加速伤口愈合。

体内评估 CPG 贴片（图 5）
采用慢性骨髓炎模型进行的体内实验表明，CPG 贴片显著减轻了感染和炎症。图 5A 显示了组织学分析（H&E 染色）结果，对照组表现出典型的炎症反应、骨质破坏、坏死组织以及大量防御细胞浸润，而治疗组的感染、炎症及防御细胞浸润均显著减少。在 CPG 组中，观察到成骨细胞迁移增加、成骨细胞向骨细胞转化、血管形成、新骨生成以及感染减轻，进一步证实了 CPG 贴片在促进组织再生方面的有效性。

此外，图5B 显示了血管生成染色结果，证实CPG补片可促进新血管的形成，而这对组织修复至关重要。这些发现表明，CPG补片在控制感染和促进组织再生方面具有双重作用，因此非常适用于慢性伤口愈合和骨再生应用。

图1：结构色水凝胶贴片（CPG）的制备与表征。（A）：CSMA与PBA之间的反应；（B）：CPG的照片，显示拉伸时的颜色变化；（C）：CPG的扫描电镜（SEM）表征；（D）：CPG的溶胀行为；（E）：CPG的降解曲线；（F）：CPG的药物释放动力学。比例尺：100 nm。误差条表示标准差（SD）。实验组使用了六只大鼠。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：CPG贴片的智能感知功能。（A）：环境温度和pH变化对CPG贴片结构色的影响；（B）：不同温度下CPG贴片的光谱分析；（C）：不同pH条件下CPG贴片的光谱分析。比例尺：1 mm。数据表示为均值 ± 标准差（SD），采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后检验进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：CPG贴片的抗菌活性。（A）：金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）与CPG贴片共培养的代表性图像；（B）：光密度（OD）值分析。比例尺：5 mm。误差线表示标准差（SD）。统计学显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后检验确定。每组使用六个重复样本。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：CPG贴片的生物学功能评价。（A）：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）与CPG贴片共培养48小时后的活力染色结果，显示活细胞（绿色）和死细胞（红色）；（B）：通过MTT法检测的细胞增殖情况；（C）：CPG贴片的活性氧（ROS）染色结果；（D）：VEGF组的DPPH自由基清除率；（E）：炎症因子的q-PCR分析结果；（F）：CPG贴片对血管生成的促进作用；（G）：VEGF和bFGF表达的Western印迹结果；（H）：VEGF和bFGF灰度值的统计分析。比例尺：100 µm。误差线表示标准差（SD）。数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后检验进行分析。每组使用六只大鼠。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：CPG补片的体内实验。（A）：HE染色；（B）：血管生成染色。比例尺：100 µm。数据表示为均值±标准差（SD），采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后检验进行分析。每组包含6只动物。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本研究的结果表明，CPG水凝胶贴片具有多种功能，尤其体现在其结构色变化、温度敏感性、pH响应性以及抗菌性能方面。这些水凝胶贴片在受到机械形变时可发生可见的结构色变化，从而提供一种高度敏感的应变监测机制。这一特性与以往探索材料结构色用于传感器应用的研究一致，此类颜色变化被用作应变或压力的指示信号^26,27。本研究进一步拓展了这些发现，将结构色变化应用于无创监测伤口应力，这对于实时评估伤口愈合过程至关重要。监测此类机械应变的能力为临床医生提供了关键信息，有助于及早发现并发症的征兆（如缝线裂开），从而支持更具针对性和及时的干预措施。重要的是，该光学读出方式提供了一种直接且直观的传感机制，无需额外电源或成像设备，是一种理想的去中心化监测方案，适用于即时诊疗或术后居家护理。

CPG水凝胶贴片的温敏性和pH敏感性行为增强了其在临床应用中的潜力。随着伤口愈合，温度和pH值的波动十分常见，尤其是在存在感染或炎症的情况下²⁸。已知伤口部位温度升高和pH值改变与这些状况相关。在本研究中，CPG贴片表现出对这些变化的敏感性，从而实现对局部伤口环境的实时监测。这一特性在临床环境中尤为重要，因为早期发现感染或炎症对于优化治疗策略至关重要。在伤口管理中，监测温度和pH变化尤为关键，因为它们可作为反映伤口状态的早期、非侵入性生物标志物²⁹。体温升高可能在临床症状出现之前提示感染的发生，而pH向碱性偏移通常表明伤口慢性化、微生物定植以及愈合受损。相反，酸性环境则与急性伤口和更佳的愈合潜力相关²⁴。因此，将温度和pH响应性元件整合到伤口敷料中，可实现及时干预和对愈合进程的持续评估，从而防止伤口恶化或发展为全身性感染。该水凝胶能够动态适应这些变化的特性，也为临床医生提供了连续监测伤口状态的新工具，使愈合过程的追踪更加准确。此外，这种动态响应性还实现了治疗药物释放的时空可控性，确保药物递送与病理信号同步，这也是现代智能生物材料的核心目标之一。

此外，CPG水凝胶贴片的抗菌特性对于降低伤口部位的细菌负荷至关重要。壳聚糖因其阳离子特性，可与带负电荷的细菌细胞壁发生静电相互作用，长期以来被认为具有抗菌性能²⁹。然而，基于壳聚糖材料的抗菌机制并不仅限于简单的电荷吸引。当与细菌膜接触时，壳聚糖可增加膜通透性，导致钾离子、蛋白质和核酸等细胞内物质外泄。此外，壳聚糖还能螯合二价金属离子（如Ca²⁺和Mg²⁺），干扰酶活性和代谢功能。低分子量的壳聚糖还可能穿透细菌细胞壁并与DNA结合，抑制mRNA转录和蛋白质合成。这些多方面的抗菌机制已有广泛报道。水凝胶支架的多孔结构进一步通过增大表面积和增强与细菌的接触而放大了这些效应，从而产生协同抗菌效果。这一特性在治疗慢性感染（如骨髓炎）时尤为重要，因为生物膜的形成会显著阻碍愈合过程^25,30。本研究结果表明，CPG水凝胶贴片能够有效抑制细菌生长，降低伤口部位的细菌负荷，并可能为组织再生创造更有利的微环境。这种抗菌活性结合水凝胶的其他特性，使该贴片成为管理慢性伤口的有力候选材料，此类伤口常因细菌污染和愈合延迟而难以处理。此外，通过抑制局部细菌定植，水凝胶间接防止了在感染性慢性伤口中常持续升高的促炎性细胞因子的上调，从而促进有利于再生的微环境形成。

尽管活性氧（ROS）通常与氧化应激和组织损伤相关，但目前普遍认为，受控生成的活性氧在细菌清除过程中发挥着关键作用。羟基自由基和超氧阴离子等活性氧可氧化细菌的蛋白质、脂质和DNA，最终导致细胞膜破裂和细菌死亡。因此，适度水平的活性氧是先天抗菌防御机制中的重要组成部分。在慢性骨髓炎的情况下，细菌定植和生物膜形成持续存在，清除病原体是实现有效组织再生的前提条件。CPG水凝胶通过抑制过量活性氧的产生，同时借助CMCSMA介导的细胞膜破坏和生物膜穿透作用维持有效的抗菌活性，提供了一种平衡的策略。这种双重功能可避免因细菌持续存在而导致炎症延长，从而促进免疫激活状态向再生微环境的转变。因此，该系统并非无差别地清除活性氧，而是调控氧化微环境，以同时支持细菌清除和组织修复。

除了具有抗菌活性外，CPG水凝胶贴片还表现出对组织修复与再生至关重要的生物学功能。³¹. 体外 实验结果表明，该水凝胶能够支持细胞存活、增殖以及血管生成。这些发现与以往研究一致，突显了血管生成在伤口愈合过程中的重要性。³²血管生成对于为受损组织提供充足的氧气和营养供应、促进组织再生至关重要。此外，水凝胶的促血管生成作用在治疗慢性伤口方面尤为重要，因为此类伤口常伴有血管化不良，从而阻碍愈合过程。^33,34通过促进血管形成，CPG水凝胶不仅有助于组织再生，还为新生组织的长期存活创造了更有利的环境。此外，该水凝胶促进成骨细胞迁移和分化的特性，在骨愈合过程中具有重要价值，尤其适用于慢性骨感染或骨缺损患者。³⁵促进成骨是改善骨髓炎及相关骨病治疗效果的一个有前景的方向，这些疾病的愈合过程常受到阻碍。将此类成骨诱导功能与局部感染控制相结合，可应对肌肉骨骼组织工程中的一个核心挑战：即需要在同一平台上实现抗菌防御与组织再生的协同解决方案。

该 在体内 结果进一步证实了CPG水凝胶贴片的治疗潜力，表明其具有支持组织修复、减少感染和促进成骨的能力。在慢性伤口模型中，这些水凝胶有效促进了伤口闭合和组织再生。在骨再生模型中，CPG水凝胶促进了成骨细胞的迁移与分化，增强了骨愈合。这些发现与其他研究中关于水凝胶介导的伤口愈合和骨再生策略的结果一致³⁶CPG水凝胶贴片能够同时应对感染、促进血管生成并支持成骨，为全面的伤口护理提供了一个强有力的平台，使其成为临床应用的有力候选方案。

尽管这些结果令人鼓舞，但本研究仍存在若干局限性。首先，尽管 体外 和 体内 尽管模型显示出积极的结果，但这些临床前研究主要在小鼠模型中进行。虽然小鼠被广泛用于伤口愈合研究，但其可能无法完全模拟人类伤口愈合的复杂性。因此，有必要在更大体型的动物模型中进一步验证，并开展人体临床试验，以确认这些水凝胶贴片在真实临床环境中的安全性和有效性。其次，尽管CPG水凝胶在短期内表现出良好的机械性能和生物学功能，但其长期稳定性及降解行为仍需深入研究。 体内 尚不明确。水凝胶会随着时间推移而降解，其降解产物可能影响愈合过程，甚至引发不良反应。未来的研究应着重优化这些水凝胶的降解速率，以确保其以受控方式降解，且不释放有害副产物。此外，还需进一步优化水凝胶中掺入的生物活性物质的控释性能，以确保长期维持治疗效果，特别是在慢性伤口治疗中。

尽管本研究聚焦于基于水凝胶的超分子支架，但针对相同治疗假设的其他替代方法包括电化学生物传感器、微流控伤口芯片系统以及整合了用于环境感知的电子元件的智能敷料。然而，与那些通常需要电源和复杂接口的技术不同，本研究开发的水凝胶贴片提供了一个无需外部仪器、可自我维持且视觉可读的平台，因此在资源有限的环境中尤为具有吸引力。

本研究的重要性在于其转化潜力。除了骨髓炎之外，CPG 平台还可针对其他与炎症相关的疾病进行定制化开发，例如糖尿病足溃疡、手术部位感染以及肿瘤切除术后的监测。将诊断与治疗功能整合于单一水凝胶基质中，为下一代智能伤口敷料的开发提供了独特机遇。此外，基于光子晶体的结构色系统为实时比色生物传感开辟了新途径，可应用于个体化医疗。同时，CPG 设计的模块化特性使其能够适应未来与干细胞、外泌体或基因递送载体的整合，从而进一步拓展其再生能力，契合当前精准再生医学的发展方向。

展望未来，后续研究应聚焦于以下几个关键领域。首先，优化CPG水凝胶贴片的组分与结构对于提升其长期稳定性和性能至关重要。通过调节交联密度，以及引入其他生物活性因子（如生长因子或细胞因子），有望增强该水凝胶在特定临床应用中的治疗潜力。其次，将此类水凝胶的应用范围从慢性伤口拓展至其他类型的组织再生领域，例如神经或软骨修复，将进一步验证其多功能性。有必要开展研究，探索如何针对特定类型的伤口（如糖尿病足溃疡或压疮）定制化设计CPG水凝胶，以扩大其临床适用范围。第三，将干细胞治疗或基因治疗等先进疗法与水凝胶贴片相结合，可能增强其再生能力，从而实现更全面且有效的治疗方案。最后，开展大规模、多中心的临床试验以及真实世界应用研究，对于评估CPG平台的安全性、可制造性、用户依从性及监管准备程度至关重要，从而推动其最终实现临床转化。

综上所述，CPG水凝胶贴片为先进的伤口护理和组织再生提供了一个极具前景的平台。该材料能够监测伤口应力，响应温度和pH值变化，具有抗菌性能，并可促进组织再生，从而为慢性伤口的治疗提供了多方面的综合策略。尽管临床前研究结果令人鼓舞，但仍需进一步优化并开展临床验证，以充分实现这些水凝胶贴片在临床应用中的潜力。未来的研究方向应包括材料组分的改进、更广泛的应用探索、与先进治疗策略的整合，以及开展临床试验以确立其在人体中的有效性和安全性。

在本实验中，我们采用甲基化CSMA-PBA作为反蛋白石支架，温敏性GelMA水凝胶作为填充材料，并负载SA，构建了一种集成诊断与治疗功能的智能结构色水凝胶贴片（CPG）。实验结果表明，该水凝胶贴片具有优异的机械性能和粘附强度。它能够抑制细菌生长，显著上调血管内皮生长因子的表达，同时下调炎症因子水平，因而为慢性骨髓炎（COM）的治疗提供了重要的临床前景。此外，尤为重要的是，基于CPG能够检测感染部位温度和pH变化的能力，该贴片在慢性骨髓炎术后恢复过程中具有实时监测作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙烯酰胺（AM，99%）	Sigma-Aldrich	A8887	水凝胶聚合的单体
丙烯酰氯（AC，99%）	TCI Chemicals	A0376	用于化学修饰反应
碱性氧化铝（200-300目）	Aladdin	A112336	用于纯化甲基丙烯酸甲酯
抗bFGF抗体	Santa Cruz	sc-9084	生长因子检测的免疫荧光染色
抗CD31抗体	Abcam	ab28364	血管标志物检测的免疫组织化学
抗EGF抗体	Sigma-Aldrich	E9644	免疫组织化学染色
抗VEGF抗体	Santa Cruz	sc-7269	血管生成检测的免疫荧光染色
双丙烯酰胺（BIS，97%）	Sigma-Aldrich	M7279	水凝胶网络中的交联剂
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）	Dojindo	CK04	细胞活力评估
甲基丙烯酰化壳聚糖（CSMA-PBA）	Sigma-Aldrich	C3641	水凝胶贴片中的支架形成
DCFH-DA探针	Beyotime	S0033	活性氧（ROS）检测
二甲基亚砜（DMSO）	中国医药集团有限公司	DMSO-AR	水凝胶配制的溶剂
大肠杆菌（E. coli）	ATCC	-	用于抗菌测试
荧光显微镜	Olympus	BX53	免疫荧光和细胞成像
明胶甲基丙烯酰（GelMA）	Sigma-Aldrich	G1894	温度响应性水凝胶组分
盐酸（HCl）	重庆天原	HCl-AR	合成过程中的pH调节
过氧化氢（H2O2）	Sigma-Aldrich	H1009	诱导细胞氧化应激
氢氟酸（HF，4%）	国药集团	H814912	蚀刻二氧化硅胶体晶体
Instron万能拉伸试验机	Instron	3345	机械性能和粘附强度测试
L929细胞	ATCC	CCL-1	用于细胞毒性和生物相容性检测
Leica切片机	Leica	RM2235	用于组织石蜡切片
雄性Sprague-Dawley大鼠（8周龄）	瑞昂生物技术	-	体内慢性骨髓炎模型
Masson’s三色染色试剂盒	Solarbio	G1340	纤维化组织学染色
甲基丙烯酸甲酯（MMA，99%）	Sigma-Aldrich	M27805	支架形成的单体
MTT检测试剂盒	Beyotime	M5655	细胞增殖和细胞毒性评估
多聚甲醛（4%）	Servicebio	G1101	组织固定
石蜡	Sigma-Aldrich	P1003	组织学包埋介质
PBS缓冲液	Gibco	10010023	用于细胞和水凝胶处理
苯丙氨酸（99%）	Sigma-Aldrich	P5482	用于化学修饰
苯硼酸（PBA）	TCI Chemicals	P0157	水凝胶中的pH敏感组分
过硫酸钾（KPS）	北京博凌微	KPS-AR	聚合反应中的自由基引发剂
PrimeScript RT试剂盒	Takara	RR047A	用于cDNA合成
活性氧（ROS）检测试剂盒	凯基生物	KGAF019	抗氧化活性评估
实时PCR系统	Applied Biosystems	StepOnePlus	基因表达定量
RNAiso Plus	Takara	9108	RNA提取试剂
流变仪（HR-1）	TA Instruments	HR-1	水凝胶的流变学表征
水杨酸（SA）	Sigma-Aldrich	S3254	水凝胶中的药物分子
扫描电子显微镜（SEM）	JEOL	JSM-7500F	水凝胶结构的形态学分析
二氧化硅纳米颗粒（12 nm）	Sigma-Aldrich	637246	二氧化硅胶体晶体模板的形成
氢氧化钠（NaOH）	中国医药集团有限公司	NaOH-AR	pH调节
金黄色葡萄球菌（S. aureus）	ATCC	-	用于抗菌测试
SYBR Green PCR主混合液	Applied Biosystems	4367659	qPCR检测试剂
紫外光源（365 nm，3 mW/cm²）	Herolab	UVT-28	用于紫外光聚合
紫外分光光度计	岛津	UV-2600	药物释放测定