方法文章

一种建立同基因型小鼠肺肿瘤原位模型的微创方法

DOI：

10.3791/68676

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2025年8月19日

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1Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa Health Care, 2Department of Neuroscience and Pharmacology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Department of Radiation Oncology, Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 4Free Radical Radiation Biology Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Geminii, Inc., 6Interdisciplinary Graduate Program in Molecular Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa Health Care

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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肺癌新疗法研发面临的主要挑战之一在于，当局部疾病进展为转移性疾病时，如何对肿瘤微环境进行有效建模。本文介绍一种建立肺癌同系正位模型的简便方法，该方法能够实现 体内 对疾病进行长期追踪

摘要

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非小细胞肺癌（NSCLC）仍然是全球范围内导致男性和女性癌症相关死亡的首要原因。需要进一步收集信息，以深入了解癌细胞、免疫系统、肿瘤微环境以及宿主组织之间的相互作用，从而开发出更有效的治疗手段。本文报道了一种简单且可重复的小鼠肺部肿瘤诱导方法，能够对肿瘤从早期到晚期的生长过程进行监测。该手术操作包括在皮肤上做一个小的表层切口，并通过肋间肌将癌细胞注射至肺部。体内成像系统（IVIS）结合经基因工程改造表达荧光素酶的细胞，为在研究过程中评估肿瘤生长和疾病进展提供了便捷手段。该技术可轻松应用于多种肺癌模型，可用于测试新型治疗药物在模拟自然肿瘤微环境的肺癌临床前模型中的可行性和疗效。该方法还扩展了标准治疗手段（包括手术切除、放疗和免疫治疗）联合实验性疗法在疗效及安全性/毒性研究中的应用价值。

引言

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肺癌仍然是全球男性和女性中最常见的癌症之一，也是癌症相关死亡的首要原因1,2,3。非小细胞肺癌（NSCLC）约占美国所有肺癌病例的近90%，尽管近年来治疗手段已显著改善，但人们对开发能够改善治疗效果的新疗法仍抱有极大兴趣4。尽管在针对特定驱动基因突变的靶向治疗以及对特定NSCLC亚型有效的免疫治疗方面已取得诸多进展，但肺癌整体的五年生存率仍然较低，所有分期加总的五年生存率约为20%2,5,6,7。此外，尽管免疫治疗在提高晚期疾病患者生存率方面取得了显著进展，但其效果仅使五年总生存率从6.8%提升至10.7%，中位生存时间也仅从7个月延长至8个月8。目前仍迫切需要深入理解该疾病的发病机制，并开发能与现有标准治疗方案产生协同作用的新疗法。要阐明NSCLC自然进展过程中的作用机制以及对新疗法的响应，就需要具备可靠可重复性、易于诱导、并能真实反映肿瘤发生所处微环境的临床前模型。

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方案

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所有涉及动物的操作均须经爱荷华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准。C57BL6/N小鼠（4至6周龄）购入后，在手术前至少适应环境1周。所有动物均保持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。每笼饲养4只动物，并在麻醉前可自由获取食物和饮水。

1. 注射用细胞的筛选与培养

  1. 按照文献35所述方法进行荧光素酶检测以筛选细胞系。
    1. 在含10%胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2及高湿度条件下培养LLC-luc细胞。当细胞融合度达到50%-100%时进行检测。
    2. 检测前，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
    3. 在6孔板中每孔加入200 µL裂解缓冲液（25 mM Tris/磷酸盐，4 mM EGTA，1% Triton X-100，10%甘油）。刮取孔中细胞并转移至微量离心管中。在室温下以16,000 × g离心5分钟。确认管底形成致密的细胞沉淀后，将上清液转移至新的微量离心管中。
    4. 将一半细胞提取物转移至新的微量离心管中，用于蛋白质定量。向剩余的一半中加入2 mM二硫苏糖醇并充分混匀。
    5. 取8 µL含2 mM二硫苏糖醇的细胞提取物，与42 µL检....

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结果

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本研究中，C57BL6/N小鼠按照所示方案进行注射（图1）。使用经基因工程改造表达荧光素酶的LLC细胞（LLC-luc）。此外，一只假手术小鼠被注射不含癌细胞的Matrigel。IVIS上的生物发光成像（BLI）可在术后1天即开始。本研究针对LLC-luc模型优化了BLI，用于评估早期肺癌。本文所用BLI系统的最低可检测辐射通量（MDR）为10 photons∙s-1∙cm-2∙sr-1，最小图像像素分辨率为50 µm，依据制造商技术规格。

小鼠肿瘤研究示意图：细胞制备、注射及用于研究分析的活体成像监测。

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讨论

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本方案描述了一种经过优化的微创操作流程，可实现较短的恢复时间并几乎立即进行肿瘤监测，这与先前报道的更具侵入性的外科方法有所不同10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45。 由于该操作流程简便，研究人员可在短时间内建立大量此模型。异氟烷的使用有助于动物快速恢复，并可严密监测.......

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披露

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S.C.H. 和 C.S.C. 是 Geminii 公司的创始人。此安排的相关条款已由爱荷华大学研究利益冲突办公室审查并批准。其余所有作者均无利益冲突需要声明。

致谢

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我们感谢Carter实验室和Sheffield实验室的成员、Susan Walsh、Bryan Allen以及Kranti Mapuskar提供的宝贵讨论。我们还要感谢动物资源办公室高级临床兽医Samantha Eckley给予的指导和建议。我们在此致谢爱荷华大学放射学系资助的小动物影像核心设施（Small Animal Imaging Core Facility）所提供的IVIS Lumina S5成像系统的使用支持。图中部分示意图由BioRender软件（https://biorender.com）生成。本研究得到了美国国立卫生研究院资助：NCI R21CA256301（C.S.C.，V.C.S.）、自由基辐射生物学项目NCI T32CA078586（S.C.H.），以及通过1S10OD026835项目购置的IVIS Lumina S5成像系统。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1x)Gibco25200-056
10% 中性缓冲福尔马林VWR16004-112
100 mm x 20 mm 组织培养处理培养皿Dot Scientific Inc.667621
190 证明纯乙醇Decon Labs2801
3/10 mL 胰岛素注射器，配 BD Ultra-Fine 31 G x 5/16 英寸针头Beckton Dickinson328438
3M Vetbond3M1469SB
ATPSigmaA5394
贝塔碘溶液 10% 聚维酮-碘消毒剂Arvio Health L.P.67618-150-04
C57BL6/N 小鼠Charles River Laboratories
40 µm 尼龙细胞筛 Falcon352340
紧凑型麻醉机Vetamac Anesthesia 
带控制器的远红外加热垫Kent Scientific Corporation 
常规手术刀柄，3 号Brad-Parker371030
中等尖头弯头通用镊子Fisherbrand16-100-110
二硫苏糖醇Research Products InternationalD11000
D-荧光素（钠盐）Cayman Chemical14682
手术单，18” x 26”，无孔，无菌Dealmed783410
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基 (1x)Gibco11965-092
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 (PBS) 1xGibco14190-144
EGTASigmaE3389
胎牛血清GibcoA5670402
FL150 光纤显微镜光源Meiji 
硫酸庆大霉素溶液IBI ScientificIB02030
甘油Research Products InternationalG22025
异氟烷Primal Pharma Limited66794-013-25
IVIS Lumina S5PerkinElmer 
Living Image 软件PerkinElmer 
LL/2 (LLC1)ATCCCRL-1642使用最符合研究需求的癌细胞系 
硫酸镁Fisher ScientificM63
Matrigel 基底膜基质Corning354234
Mayo-Hegar 持针器，6”，带齿钳口Miltex8-44TC
显微有齿镊Fine Science Tools10018-12
N5 双刀片狗爪修剪器Oneisall 
非无菌，12 层纱布海绵NDCP157112
Optixcare 眼部润滑膏Aventix5914304
青霉素-链霉素Gibco15140-122
Perma-Hand 丝线 6-0，1 x 18”Ethicon K802H
85% 磷酸Fisher ScientificA242
10 号手术刀片，不锈钢，无菌Cincinnati Surgical110
带盖锥形管，50 mLSarstedt62.547.100
4.5” 直头优质组织剪OnsungSCT115
Triton X-100SigmaT6878
Trizma BaseSigmaT1503
台盼蓝染液 (0.4%)Gibco15250-061
带衬里的实用型铝箔胶带IPGALF150L
木柄棉签NDC76200

参考文献

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  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  2. Luo, G., et al.

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