方法文章

一种建立同基因型小鼠肺肿瘤原位模型的微创方法

DOI：

10.3791/68676

⸱

2025年8月19日

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1Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa Health Care, 2Department of Neuroscience and Pharmacology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Department of Radiation Oncology, Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 4Free Radical Radiation Biology Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Geminii, Inc., 6Interdisciplinary Graduate Program in Molecular Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa Health Care

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺癌新疗法研发面临的主要挑战之一在于，当局部疾病进展为转移性疾病时，如何对肿瘤微环境进行有效建模。本文介绍一种建立肺癌同系正位模型的简便方法，该方法能够实现 体内 对疾病进行长期追踪

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

非小细胞肺癌（NSCLC）仍然是全球范围内导致男性和女性癌症相关死亡的首要原因。需要进一步收集信息，以深入了解癌细胞、免疫系统、肿瘤微环境以及宿主组织之间的相互作用，从而开发出更有效的治疗手段。本文报道了一种简单且可重复的小鼠肺部肿瘤诱导方法，能够对肿瘤从早期到晚期的生长过程进行监测。该手术操作包括在皮肤上做一个小的表层切口，并通过肋间肌将癌细胞注射至肺部。体内成像系统（IVIS）结合经基因工程改造表达荧光素酶的细胞，为在研究过程中评估肿瘤生长和疾病进展提供了便捷手段。该技术可轻松应用于多种肺癌模型，可用于测试新型治疗药物在模拟自然肿瘤微环境的肺癌临床前模型中的可行性和疗效。该方法还扩展了标准治疗手段（包括手术切除、放疗和免疫治疗）联合实验性疗法在疗效及安全性/毒性研究中的应用价值。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺癌仍然是全球男性和女性中最常见的癌症之一，也是癌症相关死亡的首要原因1,2,3。非小细胞肺癌（NSCLC）约占美国所有肺癌病例的近90%，尽管近年来治疗手段已显著改善，但人们对开发能够改善治疗效果的新疗法仍抱有极大兴趣4。尽管在针对特定驱动基因突变的靶向治疗以及对特定NSCLC亚型有效的免疫治疗方面已取得诸多进展，但肺癌整体的五年生存率仍然较低，所有分期加总的五年生存率约为20%2,5,6,7。此外，尽管免疫治疗在提高晚期疾病患者生存率方面取得了显著进展，但其效果仅使五年总生存率从6.8%提升至10.7%，中位生存时间也仅从7个月延长至8个月8。目前仍迫切需要深入理解该疾病的发病机制，并开发能与现有标准治疗方案产生协同作用的新疗法。要阐明NSCLC自然进展过程中的作用机制以及对新疗法的响应，就需要具备可靠可重复性、易于诱导、并能真实反映肿瘤发生所处微环境的临床前模型。

在过去几十年中，已开发出多种不同方法用于评估啮齿类动物中的肺癌原位模型。这些方法的侵入性各不相同：高度侵入性的方法需要较高的操作技术，例如打开胸腔进行肺内植入或移植手术9,10,11,12,13；中度侵入性方法包括经气管和口咽气管操作14,15,16,17；而微侵入性方法则包括经皮注射、尾静脉注射或鼻内诱导18,19,20,21。各种方法均具有不同的风险与优势——侵入性越强的技术通常可实现更高的定位精度，但可能导致更高的动物死亡率；而侵入性较低的方法虽有助于提高动物存活率，但肿瘤植入部位的变异性较大。在这些不同实验方案中，部分研究选择不进行活体（in vivo）肿瘤生长监测，仅在处死后进行离体（ex vivo）肿瘤评估9,11,12,16。在那些对肿瘤生长进行动态监测的方案中，早期研究更多依赖于计算机断层扫描（CT）14,19、正电子发射断层成像（PET）18和磁共振成像（MRI）17等系统；而随着生物发光成像（BLI）系统和基因修饰细胞的广泛应用，后续的研究方案则更倾向于采用BLI技术对肿瘤生长进行长期动态追踪20,21。

开发本实验方案的目的是借鉴已有方法的经验，建立一种简单且可靠的诱导单发性肺部肿瘤的方法，以研究非小细胞肺癌（NSCLC）从早期局限性肺部病变开始的疾病进展过程。本文的总体目标是描述建立一种可重复且微创的同基因型原位小鼠肺癌模型的方法，该模型可通过以下方式监测 体内 成像技术，可使研究人员在肿瘤起源器官中研究肺癌。该方法可用于构建异种移植原位小鼠模型（使用人肺癌细胞系）和同源原位小鼠模型（使用小鼠肺癌细胞系并在免疫系统完整的小鼠中进行），因而具有广泛适用性，既可用于研究人类肺癌类型，也可用于探究免疫系统与非小细胞肺癌之间的复杂相互作用。

我们重点在具有完整免疫功能的非小细胞肺癌（NSCLC）小鼠模型——刘易斯肺癌（Lewis Lung Carcinoma, LLC）中优化该实验方案，因为该模型有助于研究人员更好地理解在化疗、放疗、免疫治疗及其他靶向治疗存在或不存在的情况下免疫系统的反应22,23,24,25。该方案建立的模型在接种时可模拟早期疾病状态（肿瘤位于肺实质内），并在实验结束时出现转移，因为肿瘤通常会超出肺实质并播散至其他组织。

研究原位模型的一个重要方面是能够在对动物造成最小应激的情况下，快速重复地监测肿瘤生长，从而在同一时间点评估研究中的每只动物。尽管磁共振成像（MRI）或计算机断层扫描（CT）等成像技术可提供更高的肿瘤分辨率，但这些成像方式成本高昂、耗时较长，且在小动物模型（如小鼠）中难以有效追踪早期肿瘤的生长情况26,27,28,29,30,31因此，我们选择通过生物发光成像监测肿瘤生长，使用经荧光素酶改造的癌细胞。在本实验方案中，我们注射了25,000–50,000个经萤火虫荧光素酶改造的LLC细胞（LLC-luc），并于次日即可通过生物发光成像（BLI）检测到肿瘤。荧光素与荧光素酶的反应是追踪肿瘤生长的有效工具。 体内 使用光谱成像仪器。由于这些成像系统对光子信号具有高灵敏度，因此可追踪表达荧光素酶的癌细胞 体内 早期，通常在小鼠模型中通过 MRI 或 CT 尚无法检测到肿瘤时，且经常26,32,33,34.

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有涉及动物的操作均须经爱荷华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准。C57BL6/N小鼠（4至6周龄）购入后，在手术前至少适应环境1周。所有动物均保持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。每笼饲养4只动物，并在麻醉前可自由获取食物和饮水。

1. 注射用细胞的筛选与培养

  1. 按照文献35所述方法进行荧光素酶检测以筛选细胞系。
    1. 在含10%胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2及高湿度条件下培养LLC-luc细胞。当细胞融合度达到50%-100%时进行检测。
    2. 检测前，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
    3. 在6孔板中每孔加入200 µL裂解缓冲液（25 mM Tris/磷酸盐，4 mM EGTA，1% Triton X-100，10%甘油）。刮取孔中细胞并转移至微量离心管中。在室温下以16,000 × g离心5分钟。确认管底形成致密的细胞沉淀后，将上清液转移至新的微量离心管中。
    4. 将一半细胞提取物转移至新的微量离心管中，用于蛋白质定量。向剩余的一半中加入2 mM二硫苏糖醇并充分混匀。
    5. 取8 µL含2 mM二硫苏糖醇的细胞提取物，与42 µL检测缓冲液（25 mM Tris/磷酸盐，20 mM MgSO4，4 mM EGTA，2 mM ATP，1 mM二硫苏糖醇）混合。再加入50 µL浓度为0.5-1 mM的荧光素。
    6. 测定峰值发光强度，以相对光单位（RLU）表示，并采用合适的蛋白质定量方法测定蛋白含量，将发光强度表示为每毫克蛋白的相对光单位（RLU/mg）。
  2. 选择发光强度在8,000-15,000 RLU/mg之间的细胞系。
    注：避免选择荧光素酶表达过高（>15,000 RLU/mg）的细胞系，因其可能导致生物发光成像（BLI）仪器信号饱和。

2. 细胞制备

  1. 在使用前至少一周，将LLC-luc细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM培养基中，置于37 °C、5% CO2及高湿度的培养箱内。
    注意：监测细胞生长情况，将汇合度控制在70%–80%，根据需要使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化传代，以获得如前所述注射所需的细胞数量36。

3. 术前准备

  1. 对于有毛发的小鼠，应在手术前一天进行剃毛。
  2. 将小鼠放入诱导室，使用异氟烷进行麻醉。设定氧气流速为 2.0 L/min，蒸发器浓度为 2% 异氟烷；根据小鼠体型大小适当调整参数。
  3. 监测小鼠呼吸，并通过足底回缩反射判断麻醉是否充分。
  4. 将小鼠以俯卧位固定于经 IACUC 批准的加热装置上的鼻罩中。在继续操作前，使用足底回缩反射确认小鼠已充分麻醉。
  5. 在双眼涂抹眼用软膏。
  6. 当小鼠达到适当麻醉状态后，使用电动剪毛器去除小鼠左侧背部一大片矩形区域（2 cm × 3 cm）的毛发。内侧剃至脊柱，外侧剃至手术台边缘直至无可见毛发，下界至第13根肋骨，上界至肩胛骨上缘靠近头部方向。
  7. 将小鼠置于一个空笼子中，放置于经 IACUC 批准的加热装置上，持续观察其呼吸，直至小鼠清醒并警觉。此时可将小鼠放回其原饲养笼，等待手术。

4. 注射用细胞悬液的制备

  1. 在细胞收获当天（步骤 2.2），于收集前 3-4 小时加入含有 50 mg/mL 庆大霉素的新鲜培养基，以去除死亡和脱落的细胞。
  2. 吸除培养基，用 1× PBS 洗涤细胞。加入胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 孵育 1-2 分钟。
  3. 吹打分散细胞，并加入培养基以中和胰蛋白酶。将细胞收集至 50 mL 圆底离心管中。
  4. 在室温下以 1,200 ×g 离心 3 分钟。确认管底形成致密的细胞沉淀，吸除上清液后用 1× PBS 洗涤沉淀。重复此步骤 3 次。
  5. 用 1× PBS 重悬细胞沉淀，浓度约为 1-2 × 10⁶ 个细胞/mL，用于计数。计数前经 40 µm 细胞滤网过滤。
  6. 取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合，使用血细胞计数板进行计数。重复制备细胞悬液 2 次并分别计数，以验证结果一致性。计算总细胞数和细胞活力。
  7. 将细胞在室温下以 1,200 × g 离心 3 分钟，用于后续重悬至最终注射体积。吸除 PBS。
  8. 用含 0.5 mg/mL Matrigel 的 1× PBS 将细胞重悬至每只小鼠注射所需的细胞数量，总体积为 50 µL。操作全程将最终细胞悬液置于冰上，防止 Matrigel 凝固。
    注意：本方案使用 LLC-luc 细胞。每只小鼠注射 25,000–50,000 个细胞，体积为 50 µL。

5. 手术准备

  1. 在经 IACUC 批准的无菌手术室中进行操作。使用经兽医认可的消毒剂清洁手术台。
  2. 在手术区域放置一个已消毒且经 IACUC 批准的加热垫。在加热垫上铺上无菌手术单。

6. 外科麻醉

  1. 将小鼠放入诱导室中，使用异氟烷进行麻醉。设置氧气流速为 2.0 L/min，蒸发器浓度为 2% 异氟烷。
    注意：可根据小鼠体型调整异氟烷浓度。
  2. 监测小鼠呼吸，并通过足底回缩反射判断麻醉程度是否合适。
  3. 将小鼠以右侧卧位置于无菌手术巾上的鼻罩中。在继续操作前，使用足底回缩反射检查确认小鼠已充分麻醉。
  4. 术前皮下注射镇痛药美洛昔康（2 mg/kg 体重），并在双眼涂抹眼用软膏。

7. 原位肺注射

  1. 使用无菌纱布，交替以70%乙醇和碘伏对术区进行3次清洁。将带有3 cm × 4 cm开口的灭菌窗式手术单覆盖于小鼠体表，并将经高压灭菌的手术器械置于手术单上。
  2. 使用镊子定位肩胛骨颅侧边缘与胸廓肋骨笼尾侧边缘，以确定切口位置。术者以拇指和食指绷紧皮肤，使用10号刀片在肩胛骨正下方仅切开皮肤，制作一个表浅的5 mm切口。
    注意：术者必须佩戴无菌手套。
  3. 使用115 mm直剪钝性分离肋骨与肋间肌表面的皮下脂肪组织，切勿剪断肋间肌。
    注意：需小心避免损伤位于肩胛骨附近的胸背动脉及颈横动脉深支。由于切断皮肤及皮下脂肪内的毛细血管，可能出现轻微出血。使用灭菌棉签轻压止血。
  4. 使用Micro-Adson镊子撑开切口。从第七根真肋开始，用中弯尖头镊向上计数，确定第四和第五肋的位置。标记该区域以备注射。
  5. 轻轻倒置混匀细胞悬液3–4次。注射前立即使用无菌300 µL 31 G 8 mm胰岛素注射器吸取50 µL细胞悬液，并确保无气泡存在。
  6. 在针头处紧贴注射器连接一条4 mm厚的灭菌金属胶带作为限位器，确保针头插入肺组织深度仅为4 mm。
  7. 将50 µL细胞悬液以90°垂直于肺表面的角度，直接注入第四肋下方、第四与第五肋之间的肋间隙。注射完成后，保持针头原位2–3秒，以使Matrigel凝固，防止细胞从注射部位溢出。
  8. 以相同角度缓慢拔出针头，并将其弃置于锐器容器中。
  9. 使用2–3针缝合皮肤，打方结关闭切口，并涂抹兽用外科粘合剂，确保伤口充分闭合。

8. 术后操作

  1. 将小鼠放入一个空笼子中，并置于经 IACUC 批准的加热装置上。监测小鼠直至其完全从麻醉中恢复，通常需要 1-2 分钟。
  2. 当小鼠恢复清醒并开始活动后，将其转移至铺有新鲜垫料的笼子中。术后最初 24 小时内应频繁观察，注意是否有疼痛或感染迹象。
  3. 术后连续两天通过皮下注射给予非甾体抗炎镇痛药美洛昔康（2 mg/kg 体重）。

9. 通过监测肿瘤生长 体内 生物发光成像

  1. 手术后最早可在次日开始使用生物发光成像（BLI）监测肺部肿瘤生长情况，可每日监测一次。
  2. 执行 体内 使用成像技术 体内 成像系统（IVIS）
    1. 用不含镁和钙的1×PBS将荧光素配制成15 mg/mL的溶液。对于一只20 g的小鼠，相当于注射200 µL的15 mg/mL荧光素溶液。
      注意：荧光素溶液对光敏感，不使用时应使用铝箔包裹以避光保存。
    2. 打开软件并设置参数 生物发光成像设置 曝光时间 到 自动设置 分箱因子 到 4.
    3. 每公斤体重小鼠腹腔注射 150 mg 荧光素。
    4. 首次对新的癌细胞模型进行成像时，应进行动力学曲线实验以确定荧光素的最佳吸收时间，该时间点表现为发光信号达到峰值并开始进入平台期之前。
      1. 向小鼠注射荧光素。等待3分钟以使荧光素被吸收。
      2. 每5-10分钟对小鼠进行一次成像，持续60分钟。
        注意：不同细胞系的最佳摄取时间通常为5-15分钟。
    5. 在所有后续成像过程中，均应采用最佳的荧光素摄取时间。在此期间，对小鼠进行麻醉以准备成像。将小鼠放入诱导室，使用2%异氟烷，气体流速为2.0 L/min。
    6. 内吞完成后，通过选择获取两张图像 获取.
      1. 首先将小鼠置于右侧卧位进行成像。此体位可使相机捕捉到位于小鼠左侧体壁的注射部位，便于定量评估肿瘤生长。此后在此体位下采集的图像将记为 左侧视图.
      2. 第一张图像完成后，立即采集小鼠仰卧位的第二张图像。这能使相机从腹侧视角捕获胸腔内肿瘤发出的光子。采用此视角（下文记为 腹侧视图以估算癌症在胸腔内的位置。
  3. 为了分析图像，将单位从 计数 到 辐射度.
  4. 打开 工具腭前往 图像调整，选择 手动选择最适合所拍摄图像的色标最小值和最大值。
  5. 打开 ROI 工具. 单击圆形下拉菜单，将一个感兴趣区域（ROI）圆形添加到图像中。对于左侧位视图，将圆形移至切口位置；对于腹侧视图，将圆形移至胸部中心。
  6. 选择 测量感兴趣区域.

10. 纳入与排除标准的评估

  1. 首先，通过观察左侧侧面图像，确认肺部是否存在肿瘤发光信号。
  2. 接着，在腹侧视图图像中确认左侧胸腔存在肿瘤发光信号，然后确认腹侧视图中仅存在单一发光位点。
  3. 若满足上述两项标准（步骤 10.1 和 10.2），则进一步评估排除标准：确保在腹侧视图中胸腔内的发光信号未跨越中线。若术后 4 天内连续两次 IVIS 成像均无法在左侧侧面图像中检测到发光信号，则将该小鼠排除于后续研究之外，因为癌细胞可能未成功植入。

11. 研究结束时对肿瘤的评估

  1. 当肿瘤发光的总通量达到 1 × 108 光子/秒 (p/s) 或更高时，处死小鼠并进行终点评估。
  2. 收集肿瘤用于大体解剖分析或组织学检查，并按照前述步骤对小鼠进行麻醉和肺灌注37。
    1. 将小鼠放入诱导室，使用异氟烷进行麻醉。设置氧气流速为 2.0 L/min，蒸发器浓度为 2% 异氟烷。监测小鼠呼吸，并通过足底回缩反射确认麻醉程度适当。
      注意：可根据小鼠体型调整异氟烷浓度。
    2. 将小鼠仰卧位固定于鼻罩中。在继续操作前，使用足底回缩反射检查以确认小鼠已充分麻醉。
    3. 打开小鼠胸腔，以观察膈肌后方的肺和心脏。
    4. 沿小鼠中线向下做一条长的纵向切口。移开肠道以暴露左侧肾动脉。
    5. 切开膈肌以暴露心脏。
    6. 切断左侧肾动脉。
    7. 以约 5 mL/min 的速度，经右心室注入约 5–10 mL 的 1× PBS。
    8. 沿颈部做一切口，清除气管上方的皮下脂肪。注意避免损伤气管。
    9. 用针平行穿刺气管，将 10% 甲醛直接注入气管，以膨胀并固定肺组织。
    10. 在肺尖上方切断气管，取出肺组织；同时剪断将肺固定于胸腔的胸膜和韧带。
    11. 将肺组织置于 10% 甲醛中固定。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中，C57BL6/N小鼠按照所示方案进行注射（图1）。使用经基因工程改造表达荧光素酶的LLC细胞（LLC-luc）。此外，一只假手术小鼠被注射不含癌细胞的Matrigel。IVIS上的生物发光成像（BLI）可在术后1天即开始。本研究针对LLC-luc模型优化了BLI，用于评估早期肺癌。本文所用BLI系统的最低可检测辐射通量（MDR）为10 photons∙s-1∙cm-2∙sr-1，最小图像像素分辨率为50 µm，依据制造商技术规格。

小鼠肿瘤研究示意图：细胞制备、注射及用于研究分析的活体成像监测。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种经过优化的微创操作流程，可实现较短的恢复时间并几乎立即进行肿瘤监测，这与先前报道的更具侵入性的外科方法有所不同10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45。 由于该操作流程简便，研究人员可在短时间内建立大量此模型。异氟烷的使用有助于动物快速恢复，并可严密监测...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C.H. 和 C.S.C. 是 Geminii 公司的创始人。此安排的相关条款已由爱荷华大学研究利益冲突办公室审查并批准。其余所有作者均无利益冲突需要声明。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢Carter实验室和Sheffield实验室的成员、Susan Walsh、Bryan Allen以及Kranti Mapuskar提供的宝贵讨论。我们还要感谢动物资源办公室高级临床兽医Samantha Eckley给予的指导和建议。我们在此致谢爱荷华大学放射学系资助的小动物影像核心设施（Small Animal Imaging Core Facility）所提供的IVIS Lumina S5成像系统的使用支持。图中部分示意图由BioRender软件（https://biorender.com）生成。本研究得到了美国国立卫生研究院资助：NCI R21CA256301（C.S.C.，V.C.S.）、自由基辐射生物学项目NCI T32CA078586（S.C.H.），以及通过1S10OD026835项目购置的IVIS Lumina S5成像系统。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1x)Gibco25200-056
10% 中性缓冲福尔马林VWR16004-112
100 mm x 20 mm 组织培养处理培养皿Dot Scientific Inc.667621
190 证明纯乙醇Decon Labs2801
3/10 mL 胰岛素注射器，配 BD Ultra-Fine 31 G x 5/16 英寸针头Beckton Dickinson328438
3M Vetbond3M1469SB
ATPSigmaA5394
贝塔碘溶液 10% 聚维酮-碘消毒剂Arvio Health L.P.67618-150-04
C57BL6/N 小鼠Charles River Laboratories
40 µm 尼龙细胞筛 Falcon352340
紧凑型麻醉机Vetamac Anesthesia 
带控制器的远红外加热垫Kent Scientific Corporation 
常规手术刀柄，3 号Brad-Parker371030
中等尖头弯头通用镊子Fisherbrand16-100-110
二硫苏糖醇Research Products InternationalD11000
D-荧光素（钠盐）Cayman Chemical14682
手术单，18” x 26”，无孔，无菌Dealmed783410
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基 (1x)Gibco11965-092
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 (PBS) 1xGibco14190-144
EGTASigmaE3389
胎牛血清GibcoA5670402
FL150 光纤显微镜光源Meiji 
硫酸庆大霉素溶液IBI ScientificIB02030
甘油Research Products InternationalG22025
异氟烷Primal Pharma Limited66794-013-25
IVIS Lumina S5PerkinElmer 
Living Image 软件PerkinElmer 
LL/2 (LLC1)ATCCCRL-1642使用最符合研究需求的癌细胞系 
硫酸镁Fisher ScientificM63
Matrigel 基底膜基质Corning354234
Mayo-Hegar 持针器，6”，带齿钳口Miltex8-44TC
显微有齿镊Fine Science Tools10018-12
N5 双刀片狗爪修剪器Oneisall 
非无菌，12 层纱布海绵NDCP157112
Optixcare 眼部润滑膏Aventix5914304
青霉素-链霉素Gibco15140-122
Perma-Hand 丝线 6-0，1 x 18”Ethicon K802H
85% 磷酸Fisher ScientificA242
10 号手术刀片，不锈钢，无菌Cincinnati Surgical110
带盖锥形管，50 mLSarstedt62.547.100
4.5” 直头优质组织剪OnsungSCT115
Triton X-100SigmaT6878
Trizma BaseSigmaT1503
台盼蓝染液 (0.4%)Gibco15250-061
带衬里的实用型铝箔胶带IPGALF150L
木柄棉签NDC76200

参考文献

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