小鼠脑内胰岛素受体A和B的RNA精确可视化 原位 杂交实验

摘要

我们建立了一种双联检测方法 原位 杂交检测技术用于绘制小鼠脉络丛中胰岛素受体亚型IR-A和IR-B的分布图谱，克服了传统方法的局限性。该高分辨率方法揭示了亚型特异性表达特征，为脑内胰岛素信号传导机制提供了新的见解，并为神经系统疾病的亚型靶向治疗带来潜在可能。

摘要

胰岛素受体（IRs）在所有组织和细胞类型中广泛表达。该受体存在两种功能不同的亚型——IR-A 和 IR-B，二者因外显子 11 的选择性剪接而相差 12 个氨基酸。这些亚型具有组织和细胞特异性的表达模式，其相对丰度在发育、衰老及疾病过程中发生变化。由于两种亚型序列高度相似，使用传统免疫学方法区分 IR-A 与 IR-B 一直具有挑战性。本文中，我们描述了一种新型的双重检测方法 原位 原位杂交（ISH）检测技术可实现组织中IR-A和IR-B表达的可视化。利用该方法，我们首次证明，尽管两种亚型均在小鼠脉络丛中表达，但以IR-A为主导。该技术为研究胰岛素受体亚型的空间分布提供了有力工具 原位 在不同组织中。尽管实时定量PCR能够检测单细胞中IR-A和IR-B的转录本 体外 在复杂组织中缺乏空间定位能力，凸显了双联原位杂交（Duplex ISH）技术的必要性与应用价值。

引言

胰岛素受体（IR）是一种单次跨膜的酶受体，介导胰岛素多种多样的生理效应。该受体以二聚体蛋白形式发挥作用，每个单体由两条通过二硫键连接的肽链组成：包含配体结合域的胞外α亚基，以及具有内在酪氨酸激酶活性的跨膜β亚基¹。通过第11外显子的可变剪接，IR基因的转录产生两种IR mRNA变异体。IR-A缺失第11外显子，而IR-B保留该外显子。因此，IR-A与IR-B在α亚基C末端附近存在一段12个氨基酸的序列差异，导致两者在结合成熟胰岛素以外的生长因子以及下游信号传导特性方面有所不同。尽管两种亚型对胰岛素具有相似的亲和力，但IR-A对胰岛素样生长因子-II（IGF-II）和胰岛素原的亲和力高于IR-B。IR-A和IR-B的表达模式因组织类型、细胞类型及疾病状态而异²。

它们在组织和疾病中的差异性表达凸显了其在生理和病理过程中所发挥的独特作用。脉络丛（choroid plexus, CP）是一种特化的结构，可产生脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF），并构成血-脑脊液屏障（blood-CSF barrier）的一部分，在营养物质转运、代谢废物清除以及神经保护中发挥关键作用，尤其在炎症状态下更为重要。两种胰岛素受体（IR）亚型均在脉络丛中表达，可能参与调控脑脊液的体积与成分。IR-A 通过与胰岛素样生长因子 II（IGF-II）的高亲和力结合，可能促进脉络丛上皮细胞的增殖及....

方案

所有动物实验均按照美国国家衰老研究所（NIA）批准的方案进行，该研究所已获得美国实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）的全面认证。实验方案经NIA院内研究计划（IRP/NIA）动物护理与使用委员会审查并批准。小鼠饲养于温度受控的设施中，采用12小时光照/12小时黑暗循环，自由饮水并提供标准饲料，除非另有说明。实验所用C57BL/6J雄性小鼠购自杰克逊实验室，实验时年龄为3–4个月。

1. 固定冷冻样本制备

1. 用新鲜配制的4%多聚甲醛（PFA）在1×PBS中灌注小鼠，并将完整脑组织置于新鲜配制的4% PFA中，在4 °C下固定17–24小时。 
   注意：脑组织（每个脑组织使用10 mL）在4% PFA中固定时间不得超过24小时。
2. 将组织浸入含10%（10 mL）蔗糖的1×PBS溶液中，于4 °C下孵育直至组织沉入容器底部。随后依次将组织转移至20%蔗糖溶液，最后转移至30%蔗糖溶液，每一步均需等待组织完全下沉。
   注意：组织下沉所需时间因组织类型和大小而异。对于脑组织，大约需要18小时。
3. 将组织在OCT包埋介质中冷冻，并将组织块存放在密封容器中，于-80 °C保存。
4. 将甲醛固定的冷冻脑组织进行冠状面切片，厚度为10 µm，切片后于−80 °C保存备用。
   注意：应将切片贴附于带正电荷的载玻片上；使用其他类型的载玻片....

结果

胰岛素受体（IR）是一种跨膜酪氨酸激酶受体，由两个胞外α亚基和两个跨膜β亚基组成，形成一个功能性的异源四聚体。α亚基介导胰岛素的结合，而β亚基具有内在的酪氨酸激酶活性，可启动下游信号传导。IR mRNA 对外显子11的选择性剪接产生两种IR亚型：IR-A和IR-B。其中，IR-B在其α亚基的C末端区域包含由外显子11编码的12个氨基酸片段，而IR-A则缺少该片段。

为了区分脑组织中的这些同工型，我们使用了两种特异性探针：靶向外显子10-12连接区（跳过外显子11）的IR-A探针，以及靶向外显子11-12连接区的IR-B探针。采用双联检测方法 原位 杂交（ISH），我们在小鼠脑的第三脑室和侧脑室中观察到了亚型特异性表达（图1A,B）。该检测产生青绿色（IR-A）和红色（IR-B）的显色信号，每个点状信号代表一个单独的RNA分子。该方法可实现单细.......

讨论

在脑内，胰岛素受体（IR）的表达具有异质性，在嗅球、下丘脑、海马和脉络丛等区域观察到较高的密度¹⁰。对特定脑区和细胞类型中变异表达模式的全面表征将提供关键信息，有助于我们研究并理解胰岛素和IGF-II信号在突触可塑性、学习和记忆中的特定作用¹²。此外，这还将加深我们对复杂神经系统疾病中病理过程的认识。脑内IR-A和IR-B表达的失调已被证实与多种神经及神经精神疾病相关，包括阿尔茨海默病、抑郁症、自闭症和精神分裂症⁶。鉴定亚型特异性的表达模式将是开发靶向IR-A或IR-B的选择性治疗策略的基础步骤，这一方向在治疗这些复杂的中枢神经系统疾病中尚属全新的探索领域。

BaseScope 双重检测技术基于成熟的 RNAscope 技术，能够以高特异性和空间分辨率检测短 RNA 序列和外显子连接区域，为研究复杂的生物学机制提供独特见解。该方法特别适用于在细胞水平上可视化大脑中的胰岛素受体（IR）亚型 IR-A 和 IR-B，尤其是在研究涉及外显子 11.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨水	Electron Microscope Science	26754-4A
BaseScope 双重检测试剂盒	ACD Bio	323810
BaseScope 双重检测阳性对照探针-小鼠(Mm)-C1-Ppib-1ZZ/C2-Polr2a-1ZZ	ACD Bio	700121
BaseScope 双重检测阳性对照探针-C1-DapB-1ZZ/C2-DapB-1ZZ	ACD Bio	700141
吉尔苏木精 I	Sigma-Aldrich	GHS132-1L
山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32731
HybEZ 烤箱、托盘、支架和洗涤托盘	ACD Bio	321721, 310012, 321716, 321717
ImmEdge 疏水屏障笔	Vector Laboratory	H-4000
INSR 亚型 A 和 B 探针：BA-Mm-Insr-tv1-E10E11, BA-Mm-Insr-tv2-E11E12-C2	ACD Bio	717411, 717421-C2
胰岛素受体抗体	Cell Signaling	23413
RNAscope 10x 靶标修复液	ACD Bio	322000
RNAscope 过氧化氢，蛋白酶 Plus	ACD Bio	322381
20x 盐水-柠檬酸钠 (SSC)	Fisher Scientific	BP1325-1
SuperFrost Plus 载玻片	Fisher Scientific	12-550-18
VectaMount 永久封片介质	Vector Laboratory	H-5000