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小鼠双侧肾淋巴结切除术

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DOI：

10.3791/68695

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2025年12月30日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Section of Rheumatology, Yale University, 4Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种安全且耐受性良好的小鼠双侧肾淋巴结切除术的存活手术操作。

摘要

自身免疫性疾病是由免疫细胞异常攻击自身组织所导致，可引起病理改变并对重要器官造成损害。次级淋巴器官是B细胞和T细胞活化以及外周免疫耐受发生的场所，这依赖于抗原通过局部淋巴管的引流以及抗原呈递细胞（APC）的迁移。局部引流淋巴结作为淋巴细胞初始活化位点的作用已在肿瘤、感染及器官特异性自身免疫性疾病中得到描述，但在系统性自身免疫中尚未阐明。系统性红斑狼疮便是此类疾病之一，是一种累及广泛的自身免疫性疾病，常累及肾脏，导致肾损伤并最终发展为肾功能衰竭。目前对肾引流淋巴结作用的进一步理解受到限制，因为尚无法选择性地干预这一组织。本文介绍了一种安全且耐受性良好的小鼠双侧肾淋巴结切除存活手术方法，包括详细的操作步骤、可视化辅助图示、提高成功率的实用技巧以及常见操作问题的解决方案。术后长期生存率良好，已观察到至少术后4个月的存活情况。切除的肾淋巴结结构完整，可立即用于后续分析处理。该手术方法最适合用于研究肾淋巴结的局部作用。

引言

自身免疫性疾病可累及人体各个器官，包括相对局限于特定器官的疾病，如自身免疫性肝炎、葡萄膜炎和1型糖尿病，以及全身性分布的疾病，如系统性硬化症和干燥综合征1,2,3,4,5免疫耐受是B细胞和T细胞发育过程中的关键阶段，用以防止自身反应性6. 虽然中枢耐受 通过 胸腺中的克隆清除是必要且有效的，但仅靠这一机制仍会在自身免疫防御中留下漏洞7,8外周耐受是防止自身反应性的第二道屏障 通过 B细胞和T细胞失能、删除或T细胞耗竭，这些过程发生在次级淋巴器官中，包括抗原引流后相应的组织引流淋巴结9,10然而，越来越多的证据表明，在具有遗传和/或环境易感性的个体中，自身反应性细胞可能在异常激活后驻留于这些淋巴结并从中迁移而出11,12.

系统性红斑狼疮是一种典型的自身免疫性疾病，其发病机制中B细胞和T细胞在多个器官系统中均发挥明确作用13。其中一种常见且严重的临床表现为狼疮性肾炎，并可进展至终末期肾病14。目前，由于缺乏选择性干扰这些局部节点的技术手段，尚难以明确区分驻留于肾脏局部的B细胞和T细胞在自身免疫性肾病中的直接作用与循环系统全身性病理生理过程的影响。针对这一研究空白，本文建立并描述了一种小鼠双侧肾淋巴结切除的存活手术方法。

本方案的总体目标是在小鼠中安全、可靠地切除双侧肾淋巴结，并实现较高的术后存活率和耐受性。该操作特别适用于研究肾淋巴结对与肾脏疾病相关的免疫细胞的启动、活化及耐受过程的局部作用。当与影响肾脏的自身免疫或肿瘤模型联合使用时，该方法尤为理想。

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方案

所有操作均按照耶鲁大学动物护理与使用委员会（Yale Institutional Animal Care and Use Committee）的规程进行。为建立该操作流程，选用8至12周龄的Balb/c品系、易患狼疮的MRL/MpJ-Fas小鼠lpr/ J / J）以及年龄/性别/基因型匹配的假手术对照组被采用15此外，还对8-12周龄的野生型C57BL/6品系小鼠进行了检测，并安全切除了淋巴结。实验包括雄性和雌性小鼠。所用试剂和设备列于下文 材料表.

1. 仪器、动物及手术室的准备

  1. 对所有手术器械进行灭菌。确保手术台面和麻醉鼻罩用70%乙醇擦拭消毒。
  2. 设置手术显微镜，确保主刀医生操作时具有良好的人体工学舒适性。
  3. 设置一台吸入式麻醉蒸发器装置，配备鼻罩和废气抽吸系统，用于清除多余的麻醉气体。准备一个带有循环温水垫的手术操作台面，以维持动物体温，并将所需物品置于方便取用且无菌的位置。
  4. 通过给予2%-3%的吸入式异氟烷并以2 L/min的氧气流速诱导麻醉 通过 吸入麻醉蒸发器设备的鼻锥（遵循机构批准的方案）。
    1. 通过确认呼吸频率约为30-40次/分钟且对后肢足部夹捏无反应，确保麻醉深度适当。定期重新检查麻醉深度，并相应调整异氟烷流量。
      注意：也可使用可注射麻醉剂。
  5. 遵循所在机构关于适当镇痛和局部麻醉的指导原则。例如，可皮下注射长效镇痛剂，如每公斤体重3.25 mg的缓释型丁丙诺啡（buprenorphine XR），并在计划切口部位按每5克体重最多0.04 mL的剂量皮下注射浓度为1 mg/mL的利多卡因溶液。
  6. 为动物进行手术准备：涂抹眼用润滑剂，双侧拔除或剪除背部毛发，先用聚维酮碘溶液消毒，再用70%乙醇擦拭，然后置于右侧卧位（右侧朝下）。
    1. 用胶带将动物的左前肢向上固定，尾部向下固定，以形成放松但伸长的体位（图1A这将使肾脏更向下移位，从而改善其可视化和暴露效果。
  7. 佩戴无菌手套，并在动物身上覆盖无菌手术巾，留出暴露手术区域的窗口。整个操作过程中须保持无菌状态。
    1. 可选：在动物体位固定前，向双侧后足垫注射 10–20 μL 无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水配制的 5% 伊文思蓝，以更清晰地识别肾淋巴结 通过 沿髂淋巴管引流16 (图1D- G).
      注意：该染料可能会干扰染色和流式细胞术分析。此外，随着时间推移，伊文思蓝也会渗入乳糜池，相关建议请参见“故障排除”部分。表1).

Anatomy dissection, diagram of mouse midsection, adrenal glands, kidney, spleen, lymph nodes.
图1小鼠及器官的解剖定位与伊文思蓝注射（可选） (A动物体位摆放与固定，以暴露左侧肾脏。B解剖方位在手术视野中的定位。左侧肾淋巴结链位于肾血管上方，紧邻肾上腺血管和主动脉。右侧肾淋巴结位于肾血管稍上方。C动物体位摆放及固定，以暴露右侧肾脏。D-G) 注射20 μL 5%伊文思蓝溶液。D左后足和左侧肾淋巴结链（白色箭头）在注射染料前的情况。注意乳糜池的大致位置（虚线框），其通常透明且/或难以辨认，除非因充满淋巴液而明显膨大。E注射染料5分钟后左侧后足及左侧肾周淋巴结链（白箭头）。注意传入淋巴管（黑箭头）。F右后足和右肾淋巴结（白色箭头）注射染料前。G）右后足和右肾淋巴结（白色箭头）注射染料后5分钟。注意传入淋巴管（黑色箭头）。比例尺： A，C = 1.0 cm D-G （后足位视图）= 0.5 cm； D-G （内部视图）= 0.1 厘米。 请点击此处以查看此图的放大版本。

2. 左肾淋巴结切除术

  1. 在脾脏下方约1 cm处（约在最末肋骨下方1 cm）做一长度为1 cm的斜切口，切开皮肤。钝性分离皮肤与腹壁/胸壁，并在腹腔内辨认脾脏。
    1. 在脾脏下方约1 cm处切开腹壁肌肉，以进入腹膜腔（图2A、B）。
      注：在皮肤无色素的小鼠中，脾脏在准备好的皮肤下清晰可见，表现为位于腹腔外侧、最末肋骨稍下方的一个深色、可移动的器官。
  2. 在腹后壁、脾脏稍下方处辨认左肾，其为一表面光滑的器官。肾脏及其相关的肾淋巴结位于腹膜后间隙。使用两把弯头镊子，钝性分离左肾后方，以进入腹膜后间隙（图2C）。
    注：正确且安全的钝性分离技术包括：将闭合的镊子轻压于目标组织平面，然后让镊子缓慢张开，从而轻柔地分开组织层。
  3. 将左肾向前内侧翻转。
  4. 在解剖显微镜下，辨认包裹左肾淋巴结的脂肪垫，该脂肪垫位于左肾后方、左肾血管上方。注意辨认并避开上方的肾上腺、后方的主动脉以及前内侧的乳糜池（图1B、D）。
  5. 使用尖头精细镊子，在淋巴结被膜周围进行钝性分离（将其与周围血管分离），同时用弯头镊子施加轻柔的反向张力（图2E）。也可使用尖头精细剪刀钝性分离该层面。
  6. 使用尖头直镊将左肾淋巴结向头侧牵拉，同时使用尖头剪刀锐性切断淋巴结的后内侧附着结构。操作时注意避免损伤邻近的血管及乳糜池/胸导管（图2F）。
  7. 观察手术区域是否止血完全（图2G）。
  8. 将肾脏复位至解剖位置，使用6-0单丝聚丙烯缝线连续缝合方式分两层（腹壁和皮肤）关闭腹腔。在切口处涂抹无菌外科胶。

Dissection process in animal model; step-by-step surgical method; tissue removal sequence.
图2左侧肾淋巴结切除术. (A在脾脏阴影的下方和后方做左斜切口。B) 上方为脾脏（白线），后方为左侧肾上腺（黑箭头），下方为左肾（黑线）。C) 通过钝性分离肾脏后方区域，形成进入腹膜后的平面（黑色箭头）。D左侧肾淋巴结（白色箭头）位于脂肪鞘内，清晰可见。E在邻近血管和淋巴结之间创建一个平面（白色箭头）。F沿已建立的平面轻柔牵拉并锐性切除该淋巴结。G) 确认止血完成，并观察到空腔区域（来自（D）可见原先淋巴结所在位置（白色箭头所示）已无任何残留淋巴结。H左侧淋巴结通常为多个结点组成的链状结构（白色箭头）。插图为 离体 左侧淋巴结链（1 mm × 3.5 mm）。比例尺：0.2 cm。刻度=1 mm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

3. 右肾淋巴结切除术

  1. 将动物重新置于左侧卧位（左侧朝下）。再次使用胶带将动物的右臂向上固定，尾部向下固定，以形成放松但伸长的体位。这一点在右侧尤为重要，因为肝脏可能影响暴露（图1C）。
  2. 在最后一根肋骨稍下方（位置略高于左侧）做一条长约1 cm的斜行皮肤切口。钝性分离皮肤与腹壁/胸壁，并在腹壁肌肉层做1 cm切口，以进入腹膜腔（图3A）。
  3. 在腹膜后壁且位于肝脏稍下方处识别右肾，其为一表面光滑的器官。必要时可用棉签将肝脏向头侧推开。使用两把弯头镊子钝性分离右肾后方，以进入腹膜后间隙（图3B、C）。
  4. 将右肾向前内侧翻转。
  5. 在解剖显微镜下识别包绕右肾淋巴结的脂肪垫，该脂肪垫位于右肾后方、右肾血管上方。注意识别并避开上方的肾上腺（图1B、D）。
  6. 使用尖头镊子或精细剪刀钝性分离淋巴结被膜周围组织（将其与周围血管分离），同时用弯头镊子施加轻柔的反向牵引（图3E）。
  7. 使用细直镊子将右肾淋巴结向头侧牵拉，同时用精细剪刀锐性切断淋巴结的后内侧附着结构（图3F）。注意避免损伤走行于淋巴结稍下方的肾血管。
  8. 观察术区是否止血（图3G）。
    注：通常右肾淋巴结具有一条较大且位于后方的引流血管，在成功摘取淋巴结后更易发生出血。该血管出血可通过棉签轻压直至实现止血进行控制。
  9. 将肾脏复位至解剖位置，并使用6-0单丝聚丙烯缝线连续缝合方式分两层（腹壁和皮肤）关闭腹部切口。在伤口处涂抹无菌外科胶。

Surgical procedure sequence; excision of tissue sample; step-by-step removal; medical study.
图3右肾淋巴结切除术. (A位于末根肋骨下方及后方的右斜切口。b肝脏上缘（白线）和左肾下缘（黑线）被识别。右肾上腺被肝脏边缘遮挡。C) 通过钝性分离肾脏后方区域，建立进入腹膜后的平面（黑色箭头）。D右侧肾淋巴结（白色箭头）在脂肪鞘内清晰可见。E然后在节点周围创建一个平面（白色箭头）。F沿已建立的平面轻柔牵拉并锐性切除该淋巴结。G) 确认止血完成，并观察到空腔区域（来自（D）可见原先淋巴结所在位置（白色箭头所示）已无任何残留淋巴结。H右侧淋巴结为单个球形结节（白色箭头所示）。插图为 离体 淋巴结（2 mm × 1.5 mm）。比例尺：0.2 cm。刻度=1 mm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

4. 术后护理

  1. 将动物转移至一个洁净的笼子中，笼子一半置于循环温水垫上，一半置于其外，并提供食物和水 随意摄取.
  2. 让动物从麻醉状态中恢复（约10–15分钟），并密切观察其是否出现痛苦迹象。若动物未能及时恢复麻醉后的正常行为（如呼吸频率增加、自主翻身、行走、理毛等），应按照机构批准的方案实施人道安乐死。
  3. 当所有动物从麻醉中完全恢复后，将笼具送回动物饲养设施，并提供水、食物、垫料和环境丰富化材料。 随意摄取.
  4. 术后每12小时对小鼠进行一次评估，持续3天，观察疼痛或痛苦迹象（如弓背姿势、活动减少、反应迟钝、理毛行为异常）。若小鼠表现出痛苦迹象，应实施人道安乐死。
  5. 若使用不可吸收缝线（如6-0单丝聚丙烯缝线），于术后第10天检查切口，并拆除所有残留的缝线材料。

5. 淋巴结处理

注意：切除的淋巴结可立即用于后续的下游应用流程。

  1. 初次学习该操作步骤及解剖结构时，应确认淋巴结切除的准确性 通过 组织学或流式细胞术，使用自行选择的抗体染色。
  2. 将组织置于冰上的细胞培养基（如DMEM、RPMI）或磷酸盐缓冲液（PBS）中用于活细胞实验，或置于固定液（如10%中性缓冲甲醛、4%多聚甲醛）中用于后续组织学分析。
    注意：一种快速但准确性较低的确认淋巴结的方法是将切除的样本置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。通常情况下，主要成分为淋巴结的样本会下沉，而主要成分为脂肪组织的样本则会漂浮；然而，在初次优化该操作流程时，建议进行进一步的确认性检测。

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结果

每只小鼠的操作可在15至20分钟内完成。为验证该操作的准确性，对五只年龄、性别和基因型相匹配的8至12周龄同窝小鼠进行了双侧肾周淋巴结切除术。所有小鼠均耐受良好，围手术期存活率为100%。切除的样本立即置于冰上PBS中。所有样本均迅速沉降，表明脂肪含量较低。随后将切除的样本（以及四个独立的内脏脂肪对照样本）通过100 µm细胞筛网研磨，并用PBS洗涤。细胞悬液在4 °C下以450 × g离心5分钟，然后在冰上用100 μL PBS加入以下抗体/浓度染色20分钟：FITC标记的抗小鼠CD45.2（104）小鼠单克隆抗体（1:100；5 μg/mL），以及DAPI（1:100；15 μg/mL）用于检测细胞活性。细胞悬液再次用PBS洗涤，在4 °C下以450 × g离心5分钟，最后重悬于PBS中。

在耶鲁大学流式细胞术中心对活细胞进行了流式细胞术分析。使用本方案成功提取了淋巴结，在5/5个左侧和5/5个右侧样本中均检测到50%的CD45+活细胞，而内脏脂肪组织中的CD45+活细胞比例则低于<2%；图4<...

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讨论

本文描述了一种安全且耐受性良好的小鼠双侧肾淋巴结切除术的存活手术方法。该手术的主要局限性在于肾淋巴结相对较小，因此需要使用手术显微镜。若无手术显微镜，难以确保完整切除。某些遗传型小鼠模型的淋巴结较大，有助于识别并更易于掌握手术技术17。而在其他健康的野生型小鼠中，淋巴结通常较小且难以辨认。在学习该手术操作期间，或对淋巴结难以识别的小鼠，可考虑使用5%伊文思蓝染料以增强可视性（可选步骤1.7.1）。伊文思蓝可在切口前5分钟内注射，并在整个20分钟手术过程中保持可见（图1D-G）。

解剖学变异
左侧肾淋巴结可为一个孤立的椭圆形淋巴结，或呈链状排列的2-3个淋巴结（图2H）。为确保完全清除左肾周围的淋巴结，在切除前应仔细检查此处是否存在多个淋巴结。右侧肾淋巴结通常为一个位置恒定、略大且更接近球形的淋巴结（

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披露

R.A.F. 是葛兰素史克、Plythera 公司和 Ventus 治疗公司（Ventus Therapeutics）的顾问。其余所有作者声明无竞争利益。

致谢

感谢 J. Alderman、B. Cadugan、E. Hughes-Picard 和 J. Horrocks 在行政事务方面的协助，以及 C. Hughes 在小鼠品系管理方面的支持。H.N.B. 是耶鲁大学外科医师科学家培训项目的成员，该项目为本研究提供了部分资金支持。本工作还获得了霍华德·休斯医学研究所（资助对象：R.A.F.）和美国外科医师学会住院医师研究奖（资助对象：H.N.B.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉回路任意或注射用麻醉剂
BD LSRII 流式细胞仪（或同等设备）BD Biosciences配备 FACS Diva 软件
缓释布托啡诺任意用于镇痛
细胞培养基 任意（用于活细胞技术；例如 DMEM 或 RPMI）
DAPIBiolegend422801工作浓度：15 µg/mL
双臂/鹅颈式显微镜 LED 灯任意
乙醇（70% 水溶液）任意用于清洁
FITC 标记的抗小鼠 CD45.2 抗体（104）Biolegend109806工作浓度：5 µg/mL
镊子：弯头精细尖头镊子（×2）RobozRS-5058材质：Dumoxel；型号 #5，45 度弯角；尖端尺寸 0.1 × 0.06 mm
镊子：精细尖头镊子RobozRS-4960材质：Dumostar；型号 #1；尖端尺寸：0.20 × 0.12 mm
镊子：精细尖头镊子RobozRS-4966材质：Dumostar，生物学尖头；型号 #3；尖端尺寸：0.08 × 0.04 mm
利多卡因任意用于镇痛
小鼠JaxC57BL/6 品系野生型小鼠：The Jackson Laboratories #000664
持针器RobozRS-6410Castroviejo 持针器；直型
手术显微镜LeicaMZ9.5Leica Mz9.5 体视头手术显微镜
可选：伊文思蓝染料SigmaE2129-10G用于淋巴示踪
磷酸盐缓冲液（PBS）任意
聚维酮/碘溶液任意用于皮肤准备/消毒
剪刀：超精细尖头剪刀RobozRS-5605McPherson-Vannas 型；3 mm 刃口；弯型
剪刀：中号剪刀RobozRS-5676Noyes 型；13 mm 刃口；直型
外科粘合剂任意例如 3M Vetbond 组织粘合剂
缝线：6-0 蓝色单丝聚丙烯缝线任意
组织固定液任意（用于计划进行组织学分析；例如 10% 中性缓冲福尔马林或 4% 多聚甲醛）
循环温水加热垫任意
小鼠  The Jackson LaboratoriesBalb/c 品系，狼疮易感小鼠（MRL/MpJ-Fas-lpr/J）：#000485

参考文献

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