基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术

Summary

循环肿瘤细胞 （CTC） 对于癌症进展和转移的研究至关重要。本文提出了一种用于 CTC 富集和单 CTC 测序的高通量集成方案，可提高捕获效率和 CTC 纯度，同时降低污染和测序成本，从而推进精准肿瘤学研究和临床应用。

Abstract

循环肿瘤细胞 （CTC） 是追踪癌症转移、进展和复发的有前途的生物标志物。以 CTC 检测为中心的液体活检技术因其非侵入性和提供肿瘤动态实时监测的能力而显示出巨大的潜力。然而，传统的批量 CTC 分析无法捕捉 CTC 群体之间的内在异质性，从而掩盖了对肿瘤生物学的重要见解。单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 能够对 CTC 异质性进行高分辨率表征，为肿瘤进展的精准肿瘤学和机制研究提供了新的机会。尽管有这些优点，但现有的单 CTC 测序方法往往效率低下，包括回收率低、劳动密集型工作流程以及与多个手动处理步骤相关的污染风险。为了解决这些限制，我们提出了一种集成的微流控方案，将 CTC 富集、纯化和单细胞测序整合到一个统一的工作流程中。该方法在人字形结构芯片内采用动态控制的磁捕获，其中涡旋混合和累积免疫磁珠结合可实现稳健、高通量的 CTC 分离，同时将细胞损伤降至最低。随后使用白细胞抗体包被的微流控芯片进行纯化，有效去除非靶细胞，通过负选择进一步提高CTC纯度。最后，基于差分流阻原理设计的高精度单细胞测序芯片有助于高效的单细胞捕获和与独特条形码微珠配对。这种新颖的平台克服了基于泊松分布的方法的局限性，提高了 CTC 利用率，同时最大限度地减少了微珠消耗和测序成本。我们的集成方案显着提高了 CTC 捕获效率、纯度和单细胞测序通量，使其非常适合临床应用和大规模癌症研究。通过对 CTC 异质性进行更精确和可扩展的分析，该方法有可能完善早期癌症诊断、治疗监测和转移机制研究，最终推动精准肿瘤学领域的发展。

Introduction

肿瘤转移是一个复杂的多阶段过程，从播散开始，然后经历原发肿瘤内肿瘤细胞的休眠和定植。这些细胞逐渐通过基底膜侵入更深的组织，随后血管内渗入血管或淋巴管。一旦进入循环，这些细胞就会成为循环肿瘤细胞 （CTC），可以传播到远处的器官¹。CTC 的出现是转移级联反应的关键步骤，因为它们是远处转移的种子¹。近年来，基于CTC的液体活检技术因其非侵入性和便利性以及实时动态监测能力等优点而受到广泛关注。该技术有助于对肿瘤生物学进行精确、实时和全面的评估，在监测治疗效果、预测复发和指导治疗方面具有独特的优势 ^2,3,4。此外，研究表明，即使在低肿瘤负荷阶段，例如早期癌症、早期转移或复发，CTC 也存在于外周血中 ^5,6。因此，CTC液体活检克服了传统组织活检的局限性，传统组织活检仅限于影像学可检测的实体瘤⁷。它为癌症早期诊断、复发和转移监测、治疗指导以及阐明肿瘤发生、进展和转移机制提供了新的视角和技术支持。例如，外周血中 CTC 的数量已被证明可以作为癌症患者无进展生存期和总生存期的独立预测指标，CTC 计数越高表明预后越差⁸。CTC数量的动态变化也^{与治疗后的}疾病进展和肿瘤负荷密切相关^9,10。

最近的研究强调基于微流体的技术是分离 CTC 的变革性工具。这些技术大致可分为基于物理的方法和基于生物的方法，每种方法都具有独特的优势，同时面临特定的挑战。基于物理的方法依靠尺寸和变形性的差异来分离 CTC，从而实现高通量的无标记分选。然而，由于CTC固有的异质性，这种非特异性分离策略可能会损害捕获效率和纯度。例如，Lu等人报道了一种微流控芯片，该芯片将焦点分离和减速设计与陷阱阵列集成在一起，在CTC富集和纯化方面优于大多数传统的基于物理的技术¹¹。尽管如此，该芯片仅实现了 3-4 对数的白细胞 （WBC） 消耗，这对于临床应用来说仍然不足。另一方面，基于免疫亲和力的 CTC 分离策略通常提供更高的靶细胞回收率和纯度。然而，捕获分子和CTC之间的结合相互作用通常限制了此类方法的通量^12,13。因此，平衡高富集效率和通量的分离方法对于有效处理具有稀有 CTC 群体的临床样本至关重要。

此外，CTC之间的巨大异质性对下游分析10,14,15构成了重大挑战，因为传统的批量CTC分析经常掩盖单个细胞的区别。单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 有助于对 CTC 基因表达异质性进行全面的分子水平表征，从而深入了解 CTC 的分类、状态和功能。该技术为精准肿瘤学提供了新方法，并促进了对肿瘤发生、进展和转移机制的研究¹⁶。例如，Fan等人从肝细胞癌患者的不同血管位点构建了单CTC转录组图谱，揭示了CTC之间的空间异质性，并确定了免疫逃逸的关键介质¹⁷。同时，Miyamoto等人鉴定了前列腺癌患者CTCs中的雄激素受体基因突变和剪接变异，从而阐明了耐药的机制¹⁸。

然而，单CTC转录组测序的发展进展缓慢。现有方法存在自动化和集成方面的缺陷，导致CTC回收效率低、程序复杂、实验成功率低¹⁹。例如，当前的方案需要一个涉及 CTC 富集、纯化、单细胞分离和核酸扩增的顺序过程。这些步骤在单独的离心管中执行，需要多个移液和转移步骤。劳动密集型程序不仅降低了效率，还增加了 CTC 丢失和污染的风险²⁰。传统方法，例如基于毛细管的细胞拾取，进一步限制了单细胞分离期间的通量和分析效率²¹。此外，传统方法还受到泊松分布的限制，泊松分布是描述细胞随机封装的统计现象。这导致空液滴比例较高或每个液滴有多个细胞，从而限制了捕获效率。为了应对这些挑战，研究人员开发了用于单细胞 CTC 转录组分析的集成微流控芯片。这些平台将多个步骤整合到一个单芯片工作流程中，从而降低污染风险并提高分析效率。例如，Euisik Yoon等人开发了Hydro-Seq方法，该方法采用基于流体动力学的尺寸选择将CTC分离到微室中，并有效地将单个CTC与唯一条形码的微珠配对²²。这种方法能够对多个 CTC 进行高通量、并行的单细胞分析。然而，这种方法依赖于基于大小的 CTC 分离，这通常会导致 CTC 纯度低和通量有限 （10 μL/min），使其不适合处理大体积临床样品。因此，迫切需要开发一种集成、高通量、低体积、耐污染的单细胞CTC分析系统。

在这里，我们描述了一种用于 CTC 富集和单细胞测序的高通量和高效方案，包括三个主要组件：CTC 分选、纯化和单细胞测序芯片（图 1）。CTC分选微流控芯片是基于动态调节磁捕获力的原理设计的（图2A）。它通过人字形结构内的涡旋混合以及免疫磁珠的累积捕获实现高通量 CTC 富集。随后通过磁场的精确调制实现 CTC 的无损释放。然后使用纯化芯片，其中使用白细胞抗体包被的微通道进行负选择，产生高度纯化的CTC（图2B）。最后，采用了基于差流电阻的高效单细胞作平台，成功克服了泊松分布的局限性，实现了高效的单细胞/编码微球配对和捕获（图3A）。它显着提高了 CTC 的利用率，同时降低了微珠消耗和测序成本。

图 1：基于微流控的 CTC 分选和单细胞测序技术示意图。 该工作流程说明了肿瘤细胞从肿瘤病灶中分离、进入血液并形成 CTC 的过程。含有 CTC 的外周血或白细胞样本通过 CTC 捕获、纯化和 scRNA-seq 芯片进行顺序处理，最终实现 CTC 的转录组测序和生物信息学分析。 请点击此处查看此图的大图。

Protocol

1. 方法一：基于微流控的CTC分离

1. 人字形芯片 （HB-chip） 制造
   1. 主模具准备
      1. 准备一个干净的硅片，在135°C下烘烤过夜以去除水分。冷却至室温后，使用氧等离子体清洁剂以150 W处理晶圆1分钟以激活表面。
      2. 使用 SU-8 光刻胶对芯片的第一层进行图案化，形成支撑柱阵列（28 列× 7 行，沿流动方向编号从 #1 到 #28）。将旋涂机设置为以 500 rpm 顺序运行 10 秒，2350 rpm 55 秒，500 rpm 10 秒。确保该层的高度为 50 μm。
      3. 将第一层在 65 °C 下软烘烤 1 分钟，然后在 95 °C 下烘烤 20 分钟以蒸发溶剂。冷却至室温。
      4. 使用具有相应支撑柱设计的光掩模曝光第一层。将暴露剂量设置为 130 mJ/cm²。
      5. 在 65 °C 下进行曝光后烘烤 1 分钟，然后在 95 °C 下烘烤 6 分钟。
      6. 冷却后，将SU-8显影剂点胶到晶圆表面，去除未交联的光刻胶，得到底层。让它水坑 30 秒，然后用去离子水冲洗。
      7. 使用与步骤 1.1.1.2 中相同的旋转参数，在第一层的顶部旋转涂层第二个 SU-8 层。对第二层进行图案化，形成人字形结构，与通道壁成45°角，凹槽宽度为100μm，节距为200μm，每个周期有六个脊。确保该层的高度也为 50 μm。
         注意： 补充图 1 中提供了说明微观结构特征（包括支撑柱阵列和人字形凹槽）的所有相关尺寸的示意图。
      8. 将第一层在 65 °C 下软烘烤 1 分钟，然后在 95 °C 下烘烤 20 分钟以蒸发溶剂。冷却至室温。
      9. 使用带有人字形设计的光掩模曝光第二层。将暴露剂量设置为 130 mJ/cm²。
      10. 在 65 °C 下进行曝光后烘烤 1 分钟，然后在 95 °C 下烘烤 6 分钟。
      11. 冷却后，使用SU-8显影剂去除未交联区域，揭示完整的两层微观结构。
   2. PDMS复制品制备
      1. 通过将预聚物和交联剂以 10：1 的重量比混合来配制 PDMS 混合物。为单个芯片准备 10-15 mL 混合物。
      2. 将混合物倒入主模中，并通过脱气消除滞留的空气。通过将模具放入95°C的烤箱中30分钟来固化PDMS。
      3. 从模具中取出固化的 PDMS 复制品。使用直径为 1 mm 的 PDMS 打孔器创建一个入口和一个出口。
   3. HB 芯片组件
      1. 将氧等离子清洗器设置为 150 W 的功率，持续 3 分钟。通过在干净的载玻片上处理PDMS复制品和预粘合的PDMS层来激活表面。
         注意：由于PDMS聚合物链中存在丰富的Si-O键，等离子体活化使PDMS与玻璃、硅等基材之间形成共价键，从而促进芯片密封。
      2. 对齐处理过的 PDMS 结构并将它们牢固地粘合在一起。确认支撑柱阵列和人字形特征与玻璃基板完全集成，以最终确定 HB 芯片。
2. 免疫磁珠（IMB）的制备
   1. 将 25 μL 洗涤和重悬的链霉亲和素修饰磁珠 （SA-MB） （1 μm）（每 mL ≈4 × 10⁸ 个磁珠）与 1 μg 生物素化 EpCAM（上皮细胞粘附分子）抗体在室温下以 20 rpm 旋转 40 分钟以制备 IMB。
   2. 在磁架上磁分离后，除去上清液并将珠子重悬于 25 μL 分离缓冲液（1% BSA、2 mM EDTA、D-PBS）中。
3. 隔离芯片作
   1. 在 1-2 秒内移液 20 μL 磁珠悬浮液，确保不引入气泡。
   2. 立即将芯片垂直放在磁铁上，让珠子沉降 5 分钟而不会受到干扰。
   3. 收集血样（外周血或实验性白细胞样本）并立即将 4 mL 吸入注射器中，确保去除气泡。用液体密封芯片的入口和出口，以消除气泡。将样品入口和出口管插入芯片中。
      注意：处理生物样品时，请确保采取基本的个人防护措施。
   4. 通过注射泵以 1.5 mL/h 的流速进样。
   5. 样品上样后，以 0.2 mL/h 的流速将 60 μL D-PBS 注入 HB 芯片中，以洗掉未结合的细胞。
   6. 取下磁铁并手动注入 1.5 mL BSA（D-PBS 中的 5% w/v）以洗涤芯片并从 HB 芯片中释放捕获的肿瘤细胞。

2. 方法二：基于微流控的CTC纯化

1. HB芯片修改
   1. 在乙醇中制备（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷（MPTS）溶液，体积分数（v / v）为10%。立即将 20 μL MPTS 溶液引入 HB 芯片中，并在室温下孵育 1 小时。
   2. 用无水乙醇冲洗一次，并在100°C下干燥1小时。
   3. 制备浓度为 0.5 mg/mL 的 N-γ-马来酰咪丁酰基氧琥珀酰亚胺酯 （GMBS） 乙醇溶液。将芯片冷却至37°C，引入GMBS溶液，并在室温下孵育30分钟。
      注意：使用 MPTS 和 GMBS 时，请始终戴上手套、实验室外套和口罩。这些试剂具有毒性和粘膜刺激性，应在通风良好的地方小心处理。
   4. 用ddH₂O冲洗两次，然后用D-PBS冲洗两次。
   5. 立即加入 15 μg/mL 链霉亲和素 （SA），在室温下孵育 1 小时或在 4 °C 下孵育过夜。
   6. 用D-PBS冲洗两次。
   7. 制备 CD45 抗体缓冲液：0.2% （w/v） BSA 和 20 μg/mL 生物素化 CD45 抗体，用 D-PBS 稀释至体积。
   8. 将 20 μL CD45 抗体缓冲液注射到 HB 芯片中，以阴性选择白细胞。在室温下孵育1小时，然后用D-PBS冲洗。
   9. 加入含有 3% （w/v） BSA 和 0.05% （w/v） Tween-20 的封闭溶液，在室温下孵育 1 小时。在加载样品之前用 D-PBS 冲洗。
2. 样品加载
   1. 使用注射器吸出样品，确保去除气泡。用液体密封芯片的入口和出口，以消除气泡。将样品入口和出口管插入芯片中。
   2. 通过注射泵进样，并将流速设置为0.6mL / h。
   3. 从出口收集纯化的肿瘤细胞进行计数和单细胞测序。

3、方法三：基于微孔的单细胞条形码和测序技术

1. 试剂和材料的制备
   1. 芯片预处理
      1. 向芯片入口中加入 200 μL 1x D-PBS 和 0.5% F-68 溶液。
      2. 握住芯片进行水浴超声处理。当整个微孔区域都可以看到气泡时，继续超声处理 30 秒以去除双孔中的气泡。
   2. 条形码微珠制备
      1. 彻底混合带条形码的磁珠的储备溶液，并将 200 μL 转移到离心管中。应用磁分离直至溶液澄清，然后弃去上清液。
      2. 用 500 μL TE-TW（10 mM Tris-HCl pH = 8.0,1 mM EDTA，0.01% 吐温-20）洗涤条形码珠子两次。
      3. 将条形码珠洗涤并重悬于 200 μL 20x TE（10 mM Tris-HCl pH = 7.5,1 mM EDTA）和 50 mM DTT 溶液中，然后置于冰上。
   3. 单细胞悬浮液的制备
      1. 将纯化的肿瘤细胞转移到1.5mL离心管中，并在室温下以400× g 离心3分钟。洗涤沉淀并将其重悬于 1 mL 1x D-PBS 中。
      2. 进行细胞计数并相应地制备单细胞悬液。样品上样体积应为 200 μL，总共 80,000 个细胞（400 个细胞/μL）。
   4. 制备细胞裂解缓冲液，其中包括 1x 柠檬酸盐钠 （SSC）、0.5 M LiCl、0.6% Triton X-100、10 mM EDTA、5 mM DTT 和 1 U/μL RNase 抑制剂。
2. 微流控芯片作
   1. 细胞捕获
      1. 将 200 μL 肿瘤细胞悬液注入芯片（60000 个双孔）中，然后在脱色摇床上以 10 rpm 摇动 5 分钟，让细胞通过重力沉降到捕获孔中。
      2. 轻轻地上下移液芯片中的细胞悬液两次。然后，将芯片以 10 rpm 的速度放在脱色摇床上 5 分钟，以重悬未捕获的细胞并让它们再次沉降。
      3. 通过入口加入 200 μL 1x D-PBS 和 0.5% F-68 溶液，并从出口吸出溶液。重复两次，总共洗涤芯片三次。
   2. 条形码磁珠捕获
      1. 重悬带条形码的珠子悬浮液，然后立即通过入口将 200 μL 悬浮液注入芯片中。以 10 rpm 摇动 20 秒。
      2. 轻轻移液珠悬浮液两次，然后以 10 rpm 摇动 20 秒。重复此步骤一次。
      3. 从出口中取出带条形码的珠子悬浮液，加入 200 μL 20x TE （pH = 7.5） 和 50 mM DTT 溶液，然后从出口中取出液体。重复此步骤两次，总共洗涤三次。
   3. 细胞裂解和 mRNA 捕获
      1. 通过入口缓慢地将 200 μL 细胞裂解缓冲液添加到芯片中。紧接着，缓慢加入200μL矿物油以密封双孔。
         注意：必须立即进行密封以防止污染。
      2. 取出从排屑口流入废液箱的溶液。将芯片水平放置，在室温下静置 5 分钟。
   4. 条形码珠回收
      1. 裂解后，通过入口缓慢加入200μL 6x SSC，除去废液，并从芯片出口吸出剩余的溶液。
      2. 缓慢加入 200 μL 6x SSC 以填充芯片。将磁铁靠近芯片表面，慢慢地将其从入口移动到出口，以从捕获孔中收集条形码磁珠。然后，将溶液和条形码珠子从芯片中快速吸出到预装有 6x SSC 的离心管中。
      3. 用 200 μL 6x SSC 洗涤 3 次，然后用 1x RT 缓冲液洗涤一次（参见 材料表）。
3. 逆转录 （RT）、核酸外切酶 I 处理和 PCR
   1. RT
      1. 将条形码珠重悬于 100 μL 逆转录反应混合物中，其中含有 1× RT 缓冲液、1 mM GTP、1 mM dNTP、5% PEG 8000、2.5 μM 模板开关寡核苷酸（参见 材料表）、1 U/μL RNase 抑制剂和 10 U/μL 逆转录酶。将溶液在42°C下孵育120分钟。
   2. 核酸外切酶治疗
      1. 逆转录后，用 200 μL 1x TE-SDS（10 mM Tris-HCl pH = 8.0,1 mM EDTA，0.5% SDS）洗涤珠子一次，用 200 μL 1x TE-TW 洗涤一次，用 200 μL 10 mM Tris-HCl （pH = 8.0） 洗涤一次。
      2. 将珠子重悬于 100 μL 核酸外切酶混合物中，其中含有 1x 核酸外切酶 I 缓冲液和 1 U/μL 核酸外切酶 I，并在 37°C 下孵育 45 分钟。
   3. 第二链合成
      1. 用 200 μL 1x TE-SDS 洗涤珠子一次。将珠子重悬于 200 μL 0.1 M NaOH 中，并在室温下以 30 rpm 旋转孵育 5 分钟，以使 mRNA-cDNA 杂交产物变性。然后用 200 μL 1x TE-TW 洗涤珠子一次，用 200 μL 10 mM Tris-HCl （pH = 8.0） 洗涤一次。
      2. 将磁珠重悬于 100 μL 反应混合物中，其中含有 1x RT 缓冲液、1 mM dNTP、5% PEG 8000、0.5 μM 第二链合成引物（参见 材料表）和 0.125 U/μL Klenow 片段。将溶液在37°C下孵育60分钟。
   4. cDNA扩增
      1. 用 200 μL 1x TE-SDS 洗涤珠子一次，用 200 μL 1x TE-TW 洗涤一次，用 200 μL 10 mM Tris-HCl （pH = 8.0） 洗涤一次。
      2. 将珠子重悬于 150 μL PCR 混合物中，包括 1x PCR 反应混合物和 0.8 μM ISPCR 寡核苷酸（参见 材料表）。PCR程序设置如下：95°C3分钟;98°C20 s、65°C30 s、72°C3 min四个循环;98°C20 s、67 °C 20 s、72 °C 3 min 8个循环;72°C，5分钟。
      3. 根据制造商的说明，用 0.6x 固相可逆固定化 （SPRI） 磁珠纯化 PCR 产物两次以进行 DNA 纯化，并在 20.5 μL H₂O 中洗脱。使用基于荧光的 DNA 定量测定法测量纯化 PCR 产物的浓度。
      4. 使用含有 1x PCR 反应混合物和 0.8 μM ISPCR 寡核苷酸的 PCR 混合物对纯化的 PCR 产物进行第二次扩增（参见 材料表）。PCR程序设置如下：98°C3分钟;98°C20 s、67°C20 s、72 °C3 min五次循环;72°C，5分钟。
      5. 根据制造商的说明，用0.6x SPRI磁珠纯化PCR产物两次进行DNA纯化，并在20.5μLH₂O中洗脱。使用基于荧光的DNA定量测定²³测量纯化PCR产物的浓度。
   5. cDNA文库构建
      1. 根据制造商的说明，使用标准DNA文库制备试剂盒（参见 材料表）构建文库。
      2. 使用引物对 N70X / P5 通过 PCR 扩增文库（见 补充表）。将PCR程序设置如下：72°C3分钟;98°C30s;98°C15 s，58 °C30 s，72 °C3 min，循环12次;72°C，5分钟。
      3. 根据制造商的说明，用 0.6x SPRI 磁珠纯化文库进行 DNA 纯化，并在 20 μL H₂O 中洗脱。使用基于荧光的 DNA 定量测定法测量纯化 PCR 产物的浓度。
         注意：通常，最终DNA文库浓度为≥2ng / μL，总量≥50ng被认为是可接受的²⁴。

Results

CTC 捕获界面的组装和释放可以通过显微镜进行评估。磁场下HB芯片底部磁珠（MB）的均匀分布表明组装成功，而最小或没有残留MB确认成功释放（图2C）。此步骤对于确定捕获的 CTC 的产量和纯度至关重要。为了验证CTC隔离芯片的捕获效率，我们进行了一个尖峰实验。将少量具有高 EpCAM 表达的肿瘤细胞（PC3 或 LNCaP）加标到含有大量 Jurkat 细胞群的 PBS 中，这些细胞表现出低 EpCAM 表达，模拟循环中存在丰富的血细胞。CTC分离芯片有效地从1 mL和10 mL样品中捕获肿瘤细胞，展示了其高通量和高效的CTC分选能力（图2D）。为了评估基于IMB的捕获的特异性，我们使用了用缺乏EpCAM抗体偶联的SA-MB修饰的对照芯片。没有显着的肿瘤细胞捕获证实了IMB介导的CTC分离的特异性（图2D）。

除了捕获效率外，纯度是评估 CTC 分离平台的另一个关键参数。我们比较了使用捕获芯片或单独纯化芯片分离的肿瘤细胞的纯度，以及通过顺序正和阴选择实现的纯度（图2E）。与对照组相比，这两种芯片都显着提高了肿瘤细胞纯度，证明了它们在分离 CTC 方面的有效性。更重要的是，与使用单一方法相比，正选择和阴选择的联合使用进一步提高了肿瘤细胞的纯度和产量。

为了进一步评估 CTC 捕获和分选芯片在临床环境中的性能，我们收集了 6 名健康供体的外周血 （PB） 样本并进行了加标实验。鉴于临床样本中CTC的丰度极低，每10mLPB样品中加标约500-1000个LNCaP细胞。所有收集的 PB 样本中的 WBC 计数都在正常范围内（4-10 ×^{10 6} 个细胞/mL）。结果表明，即使在处理临床样本时，CTC分选系统也能保持肿瘤细胞的高捕获效率和纯度（图2F-G和补充图2）。

图2：人字形结构的CTC捕获纯化平台。 （A）CTC分离芯片的工作流程。首先，稳定的磁场和 EpCAM 抗体偶联的 IMB 组装捕获界面。接下来，HB 芯片内的涡旋混合提高了 CTC 和 IMB 之间的传质效率，促进累积捕获。最后，通过去除磁场来实现 CTC 的温和释放。（B）CTC纯化芯片的工作流程。HB 芯片用阴性选择抗体进行修饰，涡旋混合进一步促进白细胞-抗体相互作用，最终产生高度纯化的 CTC。比例尺，100 μm。（C） 显微成像显示捕获芯片的成功组装和释放。（D）条形图比较了分离平台在不同样品体积上的CTC捕获效率，使用非功能化SA-MB作为对照。误差线，平均值 ± SD，n = 3。（E）条形图比较了仅使用单个HB芯片获得的CTC与经过顺序捕获和纯化的CTC的纯度。对照组代表未经处理的 CTC 纯度。误差线，平均值 ± SD，n=3。（F）CTC分离芯片中的细胞鉴定。LNCaP细胞用Hoechst和钙黄绿素AM染色，而血细胞仅用Hoechst染色。比例尺，100μm。（G）使用1mL或10mL外周血的加标实验中的肿瘤细胞纯度和捕获效率。误差线，平均值 ± SD，n = 3。 请点击此处查看此图的大图。

分离的肿瘤细胞随后进行高通量单细胞测序。我们的方案包含一个由 60,000 个嵌套微孔组成的单细胞条形码系统（图 3A-B）。下部的方形微孔用于捕获单个细胞，而上部微孔则设计用于珠子上样。每个下部微孔的长度、宽度和高度分别为 25 μm，适用于大多数细胞类型。上部六角孔的内接圆直径和高度为 50 μm，以容纳通常范围为 30 至 50 μm 的珠子。该系统基于累积捕获提高了细胞捕获效率，同时避免了通过大小排阻微孔的细胞双峰。为了优化细胞上样方案，我们研究了不同细胞输入条件下的细胞捕获效率和微孔占用率（图3C）。结果表明，增加细胞输入量并未降低捕获效率;相反，它显着提高了入住率。对于 60,000 孔捕获芯片，当细胞输入量达到 80,000 时，微孔占用率趋于稳定，并且随着额外的输入量而没有进一步增加。为了尽量减少由于细胞负载过多而导致的双峰的发生，我们选择了 80,000 个细胞作为最佳输入。如图3D所示，单细胞条形码芯片实现了85.6%的细胞和95.7%的条形码磁珠占用率，配对率为81.9%。此外，根据方案进行多次沉淀，通过累积捕获效应显着提高了捕获效率和配对率（图3D）。值得注意的是，观察到的细胞和珠子之间占有率的差异归因于与细胞相比，珠子的密度和质量更大，这使得它们能够在重力作用下更有效地沉降到微孔中。因此，在优化的装载条件下，大约 80% 的配对占用率通常被认为是理想的。

图 3：基于微孔的高通量单细胞条形码和测序技术。 （A）单CTC测序方案的工作流程。（B）显微镜展示了微流控单细胞/条形码珠捕获孔结构。细胞捕获、磁珠捕获和磁珠回收的过程从左到右显示。比例尺 30 μm。（C） 线图说明了不同细胞输入条件下单细胞条形码芯片（60000 个双孔）的细胞捕获效率和微孔占用率。（D）优化细胞输入条件下细胞和条形码磁珠的占用率，以及相应的细胞-磁珠配对比。左图和右图分别显示了使用多次沉降尝试和仅单次沉降的捕获方法。误差线，平均值 ± SD，n = 3。 请点击此处查看此图的大图。

最后，为了验证CTC分选和scRNA-seq的集成方案，我们将PC3、LNCaP和Jurkat细胞以1：3：4000的估计比例混合，并将它们加载到微流控芯片上，用于肿瘤细胞捕获、纯化和单细胞测序。通过高效的肿瘤细胞分离平台，我们获得了高纯度的EpCAM阳性肿瘤细胞（图4B）。同时，基于微流控的scRNA-seq芯片展示了精确的细胞类型分析能力，通过t-分布式随机邻居嵌入（t-SNE）分析可视化结果（图4A）。我们成功地鉴定了三个不同的细胞群，每个细胞群都可以通过独特的标记来区分（图4C）。此外，最终输出中的细胞比例与纯化输入的细胞比例非常匹配，证实单细胞条形码过程无偏见且无污染（图4B）。根据TRBC1，IGLL1，CD1E和CD3D的特异性表达，一个簇被鉴定为Jurkat细胞（图4D）。通路富集分析进一步证实了该分类的稳健性（图4E）。此外，根据差异表达基因（DEG），将两种前列腺癌细胞系明显地分离成单独的簇（图4F-G）。PC3簇的特征是微量血清蛋白（microseminoprotein，MSMP）高表达，也称为PC3分泌的微蛋白。另一方面，LNCaP簇独特地表达与细胞粘附、增殖和多能性相关的标记物，如NEDD4、CTNNA1（α-catenin 1）和RBBP7。

图 4：使用加标实验验证 CTC 分选和单细胞测序。 （A） t-SNE 图显示捕获和纯化细胞的细胞类型分析。（B）条形图描绘了三种细胞类型在三个阶段的比例：初始输入，后纯化和最终测序输出。（C）点图说明了不同细胞簇中独特标记基因的表达。（D）所有细胞中TRBC1、IGLL1、CD1E和CD3D的表达水平。（E）Jurkat聚类差异表达基因（DEGs）的GO和KEGG通路富集分析。（F）NEDD4和MSMP在所有细胞中的表达模式。（G） 火山图显示 PC3 和 LNCaP 簇之间的 DEG。红点代表PC3中上调的基因;蓝点代表 LNCaP 中上调的点。 请点击此处查看此图的大图。

预混液	试剂	最终稀释	缓冲区类型
0.5% F-68	F-68	0.50%	DEPC 处理水
	公共广播公司	1×
TE-TW	盐酸三酯 （pH=8.0）	10 毫米	DEPC 处理水
	乙二胺四乙酸	1 毫米
	吐温-20	0.01%
20× TE（pH=7.5）	Tris-HCl （pH=7.5）	200 毫米	DEPC 处理水
	乙二胺四乙酸	20 毫米
TE-SDS系统	盐酸三酯 （pH=8.0）	10 毫米	DEPC 处理水
	乙二胺四乙酸	1 毫米
	SDS的	0.50%

表1：用于单CTC测序制备的试剂混合物的组成。 所示是 scRNA-seq 所需的部分试剂，可以在芯片作之前制备这些试剂，以确保快速顺利的过程。

补充图 1：HB 芯片的设计。 （A）两层微流控结构示意图。上层：人字形结构的顶层。放大的插图显示了人字形的详细几何形状，人字形相对于通道壁成 45° 角，凹槽宽度为 100 μm，节距为 200 μm。底部：底层由支撑柱阵列（28 列× 7 行）组成，沿流动方向编号为 #1 至 #28。（B）人字形芯片的侧视图。人字形凹槽的宽度为 100 μm。人字形结构和支撑柱的高度均为 50 μm。（C） 人字形芯片的俯视图。每根支撑柱的宽度为 500 μm，长度为 1150 μm，相邻支柱之间的间隙为 550 μm。（D） 制造的 HB 芯片的照片。 请点击此处下载此文件。

补充图2：代表性图像显示了从CTC分离芯片出口收集的废液中存在的荧光染色的肿瘤细胞和血细胞。 LNCaP细胞用Hoechst和钙黄绿素AM染色，而血细胞仅用Hoechst染色。比例尺 100 μm。 请点击此处下载此文件。

补充表：用于逆转录和文库制备的寡核苷酸序列请 点击此处下载此文件。

Discussion

CTC 是癌症诊断、治疗指导以及肿瘤发生、进展和转移研究的宝贵生物标志物²⁵。然而，现有的CTC分离方法未能实现高效率和高通量²⁶。此外，CTC的低释放效率通常会导致低纯度和高细胞损伤，从而限制了它们与下游分析的兼容性²⁷。在这里，我们提出了一种用于高通量CTC分选和单CTC测序的集成方案，包括三个主要程序：CTC捕获，纯化和scRNA-seq。

这个基于微流体的平台提供了灵活性和可扩展性。HB芯片中的并行通道数量，以及条形码芯片中的捕获孔数量，可以根据不同的样品要求进行调整，从而满足高通量需求。在CTC捕获芯片中，可以根据具体的癌症类型对IMB进行优化。例如，在前列腺癌患者的样本中，IMB 可以用 EpCAM 和 PSMA 抗体的混合物进行功能化，以提高捕获效率。此外，仅依靠基于 EpCAM 的捕获可能会导致经历上皮间质转化 （EMT） 的间充质 CTC 丢失。为了解决这个问题，可以掺入额外的针对热休克蛋白 70 （HSP-70） 或细胞表面波形蛋白 （CSV） 的抗体来捕获不同 EMT 阶段的 CTC。

由于用于 CTC 捕获和纯化的 HB 芯片是基于微流体的，因此在实验过程中必须小心处理。在将试剂引入芯片入口之前，必须清除所有气泡，并且可以密封入口和出口以消除滞留的空气。此外，应快速引入试剂（在 1-2 秒内），因为捕获的气泡会阻碍 IMB 和细胞的通过，从而显着降低捕获效率和纯度。此外，如前所述，IMB 的均匀分布对于成功捕获 CTC 至关重要。加载 IMB 后，芯片必须垂直放置在磁铁上并固定到位至少五分钟，以防止磁场变化破坏 IMB 分布。值得注意的是，方案中指定的细胞上样流速应根据不同的样品类型进行优化。例如，白细胞样本表现出升高的白细胞浓度和粘度水平。如果流速过快，可能会阻碍CTC和IMB之间的有效相互作用，从而阻止磁捕获累积，从而降低CTC纯度。为了评估我们的 CTC 分离和纯化平台在处理临床血液样本方面的性能，我们从几位健康供体中收集了 PB，并将少量 LNCaP 细胞（每毫升约 50-100 个细胞）加标到样品中。值得注意的是，尽管该平台对PB样品中的肿瘤细胞表现出高捕获效率和纯度，但其性能略低于在基于PBS的细胞样品中观察到的性能（图2D， 图2E和 图2G）。我们推测，这种差异是由于与PBS相比，血液的粘度更高，红细胞和血小板的存在丰富。因此，在处理临床血液样本时，可以考虑红细胞裂解或PBMC提取等预处理步骤来提高性能。

与 HB 芯片类似，基于微流控的单细胞条形码芯片需要小心处理以防止气泡形成。鉴于所涉及的试剂多种多样，可以在开始芯片作之前预先制备一些试剂（表1）。加载细胞和珠子时，必须仔细控制进样速度以确保均匀分布，因为细胞密度较低，而条形码珠子密度较大。通常，细胞悬液应在3~5秒内缓慢加入，然后在1~2秒内快速加入珠子悬浮液。加载细胞和珠子后，进行两轮抽吸和分配，然后将芯片放在振动器上以完成累积捕获过程。这一步对于提高入住率和配对率至关重要。在细胞裂解过程中，使用油封方法隔离微孔表面，防止孔之间的交叉污染。值得注意的是，矿物油应在裂解后立即添加，不得拖延。裂解后，通过将磁铁从入口缓慢移动到出口来进行条形码珠子回收，以确保高珠子回收率。如有必要，可以多次重复此步骤。最后，在离心管中回收的磁珠进行放疗、第二链合成、PCR扩增和文库构建，然后进行二代测序（NGS）。

这种集成微流控平台在临床应用方面具有巨大的潜力。通过提高 CTC 分离的效率和通量，它增加了低肿瘤负荷阶段的 CTC 检测，从而能够建立将 CTC 计数与肿瘤分期联系起来的分类模型。这一进步为癌症诊断、治疗监测、预后评估和复发预测提供了一种新方法。此外，CTC 的单细胞转录组学分析可以识别关键分子特征，包括基本基因途径、相互作用网络和生物标志物基因。该分析深入了解了驱动早期癌症转移的关键因素，并揭示了转移性病变形成的分子机制，为复发或转移性癌症患者提供了潜在的治疗靶点。此外，该平台具有高度可扩展性。它可以适应特定的分析要求，并扩展以支持多组学分析，包括转录组学和基因组学。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
（3-巰基丙基）三甲氧基硅烷	西格玛·奥尔德里奇	175617-100G	MPTS解法
20多次;SSC缓冲区	桑贡生物技术	B548109-0200
5×RT缓冲区	桑贡生物技术	B610020-0500
生物素化CD45单克隆抗体	电子生物科学	13-0459-82	储存在2度;C到8°附注;
生物素化EpCAM单克隆抗体	电子生物科学	13-9326-82	储存在2度;C到8°附注;
牛血清白蛋白（BSA）	桑贡生物技术	A600332-0100	储存在2度;C到8°附注;
解码器卡带芯片	动态生物系统	2203106	储存在2度;C到8°附注;
解码器墨盒试剂套件	动态生物系统	2203206	储存在2度;C到8°附注;
DEPC处理水	桑贡生物技术	B501005-0500
D-PBS	桑贡生物技术	E607009-0500	含量：氯化钠136.89毫米;KCl 2.67 mM;Na2HPO4 8.10 mM;KH2PO4 1.47 mM。pH=7.2-7.4
数字地面电视	热力科学	R0861	储存在2度;C到8°附注;
Dynabeads MyOne SA T1	Invitrogen	65602	SA-MBs，1和mu;m
EDTA	桑贡生物技术	B540625-0500	0.5 M，pH=8.0
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	罗 氏	KK2601	2×PCR反应混合物
氯化锂沉降 Soln。	Invitrogen	AM9480	0.2 & micro;M的滤波
N-&γ;-马雷咪大丁酰-羟琥珀酰胺酯	热力科学	22309	GMBS解决方案
普鲁罗尼克F-68	桑贡生物技术	A600749-0025
量子比特1×dsDNA HS 检测套件	热力科学	Q33231
SDS解决方案	桑贡生物技术	B648118-0100	10% SDS
链替亲和素	西格玛·奥尔德里奇	189730	储存在2度;C到8°附注;
SU-8光刻胶	微化学	苏-8 3050
SYLGARD 184硅胶弹性体套件	道康宁	4019862
三酸盐酸盐（pH 7.5）	利阿金	NR0072	1 mol/L，pH=7.5，游离RNase
三酸盐酸（pH 8.0）	利阿金	NR0073	1 mol/L，pH=8.0，游离Rnase
特里顿 X-100	桑贡生物技术	A600198-0500
Trueprep DNA 库准备套件 V2 for Illumina	瓦兹姆	TD502	DNA文库制备套件
Tween-20	桑贡生物技术	A600560-0500
VAHTS DNA 清洁颗粒	瓦兹姆	N411	固相可逆固定（SPRI）磁珠用于DNA纯化