多模态空间代谢组学与中红外显微镜引导质谱成像

摘要

我们提出了一种多模态空间代谢组学工作流程，该工作流程将质谱成像 （MSI） 和中红外 （MIR） 成像集成在同一组织切片上，用于空间分辨的代谢和生化分析。

摘要

空间代谢组学是一个快速发展的领域，用于绘制组织、器官甚至单细胞内代谢物的分布图。这种方法提供了上下文代谢信息，这对于理解生物系统的生化异质性至关重要。中红外 （MIR） 成像和质谱成像 （MSI） 已成为空间代谢组学的强大方法，每种方法都具有独特且互补的优势。在这项研究中，我们提出了一种在同一组织切片上执行MIR成像和基质辅助激光解吸电离MSI（MALDI-MSI）的工作流程，包括实验程序，成像共同配准，数据集成和生物信息学分析。MIR 成像被用作上游模式，允许对组织进行无损生化分析。随后，在从 MIR 成像获得的空间信息的指导下，将基质沉积在组织中进行 MALDI-MSI。图像在共同配准后被集成，从而能够使用先进的生物信息学工具（如修拉）进行多模态空间代谢组学分析。MIR 成像和 MSI 的集成代表了空间代谢组学的变革性进步，为探索健康和疾病中代谢过程的空间和化学复杂性提供了前所未有的机会。这种多模式方法在推动生物标志物发现、疾病诊断和治疗开发方面的创新方面具有巨大潜力。

引言

空间代谢组学涉及通过将质谱成像 （MSI） 或其他空间分辨技术与代谢分析相结合，在其天然组织环境中绘制代谢物图谱，从而深入了解亚组织、细胞或亚细胞分辨率下的代谢 1,2,3,4,5,6,7,8 .在这些成像方式中，中红外（MIR）显微镜因其基于分子振动对比度4,7,9,10,11,12进行化学映射生物分子的能力而受到越来越多的关注。无损、无标记、....

方案

该方案是根据复旦大学实验动物资源中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案（DSF-2024-004）进行的。

注意：本研究提供了在同一组织切片上执行 MIR 成像和 MALDI-MSI 的工作流程。这种综合方法包括实验程序、图像共同配准、数据融合和下游生物信息学分析（图1C）。MIR 成像被用作上游模式，能够对组织进行无损、无标记的生化图谱。在MIR成像的空间信息的指导下，随后应用矩阵进行MALDI-MSI采集。在精确的共配准之后，数据集被集成以进行多变量协同分析（图 4），通过先进的计算工具实现全面的空间代谢组学。

1. 样品制备

1. 组织样品制备
   1. 小鼠组织收集
      1. 在特定的无病原体（SPF）条件下饲养C57BL / 6J小鼠（20周龄，40g），维持在12小时的明/暗循环中，并随意获得食物和水，以确保实验前的最佳健康。
      2. 通过腹腔注射50mg / kg体重剂量的戊巴比妥钠来麻醉小鼠，以确保深度麻醉。在进行灌注之前，监测动物并确认没有脚和角膜反射。
      3. 在150mmHg的受控压力下通....

结果

为了验证上述多模态空间代谢组学策略，我们在癌症小鼠模型中实施了它。肿瘤细胞经过基因改造，表达绿色荧光蛋白（GFP），通过荧光成像实现肿瘤区域的精确定位。图2A显示了光谱覆盖范围为950-1800 ^cm-1的无标记QCL-MIR成像结果，称为“指纹区域”。代表性的MIR条带在图2A中标记，例如P = O拉伸（1240cm-1，核酸和磷酸脂），酰胺II（1550cm-1，蛋白质），酰胺I（1650cm-1，蛋白质）和酯C = O拉伸（1740cm-1，甘油脂）。

GFP荧光信号作为评估肿瘤区域空间对应关系的内部参考（图2B）。酰胺I和酰胺II条带的光谱积分图（图2C）显示GFP标记的肿瘤区域的吸光度降低，表明与相邻正常组织相比，癌细胞中的蛋白.......

讨论

在这里，我们提出了一种多模态空间代谢组学策略，该策略集成了 MSI 和 MIR 成像，以实现对同一标本的高通量、分子特异性代谢分析。MIR 成像可实现基于分子振动的无标记、无损化学图谱，提供详细的结构和官能团信息。相比之下，MSI 为代谢物鉴定和定量提供了高灵敏度和特异性，使其成为代谢组学研究的基石。通过整合这两种模式，它可以利用 MIR 成像的化学特异性和 MSI 分子精度的互补优势，更全面地了解代谢异质性。

所提出的多模态平台的一个关键优势是它能够执行空间分辨感兴趣区域（ROI）识别以进行目标MSI采集。高通量MIR成像是一种快速、无标记、非侵入性的方式，可指导ROI选择²¹。与相邻组织切片的传统组织学染色不同，后者引入空间错位并增加准备步骤^22，MIR成像可在同一组织切片上定位ROI，从而简化工作流程并减少变异性²³。将这种方法与无监督机器学习相结合可以实现自主 RO.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4%多聚甲醛，组织固定液	三工生物	E672002
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	126615
C57BL/6JNifdc 小鼠	Charles River	219
CaF2 载玻片	Crystran	CAFP25-1
低温恒温器切片机	Dakewe Biotech	CT520
Cytospec	Peter Lasch	版本 2.10.01	用于 MIR 数据分析的软件，包括基线校正、归一化、图像生成和高光谱分析。
DPBS缓冲液	Fisher Scientific	14-190-250
胎牛血清	Gibco	10270106
冷冻干燥机	LABCONCO	FreeZone
明胶	Sigma-Aldrich	G1890	A 型，来自猪皮
HBSS 缓冲液	Sangon Biotech	A003210
高糖DMEM	ThermoFisher Scientific	10564011
Matlab	MathWorks	Matlab R2024a	软件，用于 MIR 数据分析，包括基线校正、归一化、图像生成和高光谱分析。
基质辅助激光解吸电离质谱成像 （MALDI-MSI） 系统	Bruker Daltonics GmbH	timsTOF fleX MALDI-2
甲醇	国药化学试剂	10014108
mMass	虫学研究所，	5.5.0 版	MSI 数据分析软件。将原始MSI数据导入SCILS Lab进行预处理。以 mMass 为单位进行峰拾取，相对强度> 0.01%。
N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐（NEDC）基质	Sigma Aldrich	222488
青霉素链霉素	ThermoFisher Scientific	15140122
子级联激光器 中红外（QCL-MIR）显微镜	布鲁克光学有限公司	H LUMOS II ILIM
红磷	Sigma-Aldrich	8.0727
SCiLS 实验室	布鲁克道尔托尼斯	SCiLS 实验室 2024b	用于 MSI 数据分析的软件。将原始MSI数据导入SCILS Lab进行预处理。以 mMass 为单位进行峰拾取，相对强度> 0.01%。
喷雾器	HTX Technologies	TM
胰蛋白酶，0.25% EDTA	ThermoFisher Scientific	C25200072