多模态空间代谢组学与中红外显微镜引导质谱成像

摘要

我们提出了一种多模态空间代谢组学工作流程，该工作流程将质谱成像 （MSI） 和中红外 （MIR） 成像集成在同一组织切片上，用于空间分辨的代谢和生化分析。

摘要

空间代谢组学是一个快速发展的领域，用于绘制组织、器官甚至单细胞内代谢物的分布图。这种方法提供了上下文代谢信息，这对于理解生物系统的生化异质性至关重要。中红外 （MIR） 成像和质谱成像 （MSI） 已成为空间代谢组学的强大方法，每种方法都具有独特且互补的优势。在这项研究中，我们提出了一种在同一组织切片上执行MIR成像和基质辅助激光解吸电离MSI（MALDI-MSI）的工作流程，包括实验程序，成像共同配准，数据集成和生物信息学分析。MIR 成像被用作上游模式，允许对组织进行无损生化分析。随后，在从 MIR 成像获得的空间信息的指导下，将基质沉积在组织中进行 MALDI-MSI。图像在共同配准后被集成，从而能够使用先进的生物信息学工具（如修拉）进行多模态空间代谢组学分析。MIR 成像和 MSI 的集成代表了空间代谢组学的变革性进步，为探索健康和疾病中代谢过程的空间和化学复杂性提供了前所未有的机会。这种多模式方法在推动生物标志物发现、疾病诊断和治疗开发方面的创新方面具有巨大潜力。

引言

空间代谢组学涉及通过将质谱成像 （MSI） 或其他空间分辨技术与代谢分析相结合，在其天然组织环境中绘制代谢物图谱，从而深入了解亚组织、细胞或亚细胞分辨率下的代谢 1,2,3,4,5,6,7,8 .在这些成像方式中，中红外（MIR）显微镜因其基于分子振动对比度4,7,9,10,11,12进行化学映射生物分子的能力而受到越来越多的关注。无损、无标记、高速和经济高效的特性4,7,9,10,11,12使MIR成像特别适合与MSI集成，形成一种有前途的综合空间分析多模态方法。

基质辅助激光解吸电离MSI（MALDI-MSI）是空间代谢组学中使用最广泛的技术之一（图1A）¹³。它能够以高灵敏度检测多种代谢物，包括脂质、氨基酸、糖、核苷酸和次生代谢物¹。基质选择（例如，2,5-二羟基苯甲酸[DHB]、9-氨基吖啶[9AA]或N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐[NEDC]）和电离技术（例如，后电离方法）的进步进一步扩大了检测覆盖范围，特别是对于低丰度和电离性差的物种¹⁴。现代 MALDI-MSI 系统支持的成像速度通常为每秒 5 至 50 像素，具体取决于空间分辨率和所使用的质量分析仪类型（例如，飞行时间 [TOF]、Orbitrap 或傅里叶变换离子回旋共振 [FT-IRC]）。值得注意的是，高速 MALDI-TOF 仪器的速率已超过每秒 100 像素，可在几个小时内实现大面积成像¹⁵。MALDI-MSI的空间分辨率通常在5至50μm之间，足以分辨细胞甚至亚细胞结构^16,17。然而，更高的空间分辨率通常以更长的采集时间、降低的信噪比和数据处理过程中更高的计算需求为代价。

与MSI不同，MIR成像是一种宽视场光学方法⁴，使其具有固有的无损和高通量。高功率量子级联激光器（QCL）的最新进展支持了一种称为离散频率红外（DFIR）成像的新框架，该框架可显着提高成像速度直至视频速率（图1B）^12,18。此外，QCL源使非制冷微测辐射热计探测器可用于MIR成像，从而能够使用更大的焦平面阵列（FPA）探测器¹²。因此，只需几秒钟即可以细胞分辨率 （~5 μm） 获取 1 cm² 区域的单频 MIR 图像。MIR 成像可以在无标记和标记模式下运行。在之前的研究^4,19,20中，已经引入了小型红外主动振动探头来监测各种代谢活动的原位动力学。这些探针通过独特的 MIR 光谱波段报告全球化学转化，从而能够实时跟踪代谢途径⁴。因此，MIR 成像以高空间分辨率和快速采集速度提供静态生化分析和动态代谢监测。

在本手稿中，我们介绍了一个全面的工作流程来执行MIR引导的MALDI-MSI空间代谢组学，证明了从同一标本中获取两种模式的可行性（图2， 图3）。通过将 MIR 成像与 MSI 相结合，我们建立了一种多模态方法，利用每种技术的互补优势。MIR 成像以细胞分辨率对整个载玻片进行快速、无标记的生化定位，为后续 MSI 采集中选择感兴趣区域 （ROI） 提供了宝贵的指南。该策略可实现更有针对性和更高效的 MSI 工作流程，减少采集时间和成本，同时增强空间代谢组学数据的可解释性和生物学相关性。反过来，MSI 提供了 MIR 高光谱图像的高度详细的分子注释，从而能够更深入地了解组织生物化学。总体而言，这种综合方法在推进生物标志物发现、疾病诊断和治疗开发方面具有巨大潜力。

方案

该方案是根据复旦大学实验动物资源中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案（DSF-2024-004）进行的。

注意：本研究提供了在同一组织切片上执行 MIR 成像和 MALDI-MSI 的工作流程。这种综合方法包括实验程序、图像共同配准、数据融合和下游生物信息学分析（图1C）。MIR 成像被用作上游模式，能够对组织进行无损、无标记的生化图谱。在MIR成像的空间信息的指导下，随后应用矩阵进行MALDI-MSI采集。在精确的共配准之后，数据集被集成以进行多变量协同分析（图 4），通过先进的计算工具实现全面的空间代谢组学。

1. 样品制备

1. 组织样品制备
   1. 小鼠组织收集
      1. 在特定的无病原体（SPF）条件下饲养C57BL / 6J小鼠（20周龄，40g），维持在12小时的明/暗循环中，并随意获得食物和水，以确保实验前的最佳健康。
      2. 通过腹腔注射50mg / kg体重剂量的戊巴比妥钠来麻醉小鼠，以确保深度麻醉。在进行灌注之前，监测动物并确认没有脚和角膜反射。
      3. 在150mmHg的受控压力下通过左心室灌注约20-30mL含有肝素（5 IU / mL）的冷PBS6分钟，以冲洗血液并在取出前使器官放血。
      4. 立即用液氮淬灭所有收集的组织，并将其储存在-80°C下以供进一步分析。
         注意：快速冷冻对于防止冰晶形成至关重要，冰晶会扭曲组织形态。
   2. 组织包埋和冷冻切片
      1. 将切片机设置为 -20 °C，并用乙醇 （EtOH） 对腔室和刀片进行净化，以消除残留的包埋介质。让 CaF₂ 载玻片、载玻片邮寄器、标本支架和组织样品在低温恒温器内平衡。
      2. 将组织修剪至约 5 毫米× 5 毫米× 3 毫米。将其包埋在 -20 °C 的标准冷冻模具中的 10% 明胶中，确保切片的正确方向。将嵌入的样品快速冷冻在干冰上，并储存在-80°C直至冷冻切片。
      3. 从模具中取出组织，修剪多余的材料以优化切片，并使用超纯水将其固定在标本支架上，以确保稳定的粘附。
      4. 切割 10 μm 厚的切片并将切片固定在预涂的 CaF₂ 底物上，并将其储存在 -80 °C 下。
      5. 在进行中红外成像之前，将安装的组织切片放入真空冷冻干燥机中。将腔室压力设置为 0.1 mPa，温度设置为 -100 °C。 将样品干燥 30 分钟。
2. 细胞样品制备
   1. 将 1.25 × 10⁵ HeLa 细胞接种到放置在标准培养板中的 13 mm 直径圆形 CaF₂ 底物上。使用补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素链霉素的高葡萄糖杜尔贝科改良鹰培养基 （DMEM）。在标准培养条件（37°C，5%CO₂）下孵育细胞24小时。
   2. 24小时后，小心地取出培养基，并通过在室温（RT）下将细胞在溶解在PBS缓冲液中的4%多聚甲醛（PFA）中孵育20分钟来固定细胞。
   3. 用HBSS缓冲液冲洗固定细胞三次，然后用ddH₂O再洗涤三次。
   4. 在进行 MIR 成像之前，在室温下将 CaF₂ 底物完全风干。

2. 多模态图像采集

1. 量子级联激光器（QCL）MIR图像采集
   1. 使用配备非 N₂ 液冷微测辐射热计 520 × 480 焦平面阵列 （FPA） 探测器和空间相干性降低技术的 QCL-MIR 显微镜进行 QCL MIR 成像显微镜。
   2. 选择 950 ^cm-1 至 1800 ^cm-1 的光谱范围。
   3. 使用具有 0.6 数值孔径 （NA） 的 4× 物镜，标称像素尺寸为 4.25 μm。
   4. 以 4 ^cm-1 光谱分辨率在干净的 CaF₂ 基板上收集背景光谱。
   5. 根据组织形态选择采集区域，并以 4 ^cm-1 的光谱分辨率收集光谱数据。在此光谱分辨率下，图像采集速度约为 0.3 mm²/s。
      注意： 所有测量均使用 CaF₂ 幻灯片在透射模式下执行，并具有手动对焦调节功能。
2. 质谱图像采集
   1. 矩阵应用
      1. 将MIR后组织切片用于MALDI-MSI，使用Tippex笔在组织周围应用基准标记，并使用平板扫描仪捕获MSI前光学图像以进行图像配准。
      2. 在甲醇/乙腈/去离子水中制备7mg/mL的NEDC基质（V/V/V=75：25：5），然后通过0.2μm膜过滤以去除颗粒。
      3. 将标记的组织载玻片装入自动基质喷雾器中。使用预定义的参数将 NEDC 基质分配到样品上。
   2. MALDI-MSI 测量
      1. 将 0.2 μL 红磷悬浮液沉积到 CaF₂ 载玻片上，作为外部质量校准标准品。
      2. 将基质涂层载玻片固定在载玻片适配器中，确保与支架的最佳电气接触。将板装入 MALDI-MSI 系统。
      3. 使用基准标记将载玻片的光学图像与MALDI载物台的XY电机坐标对齐。定义组织分析的 ROI，并包括“纯基质”区域作为阴性对照。
      4. 将仪器配置为负离子模式，像素尺寸为 20 × 20 μm²，覆盖 50-1000 的 m/z 范围。在开始数据采集之前，使用红磷点进行质量校准。使用商业数据分析平台执行数据采集。

3. 图像数据预处理和分析

注意：MATLAB 自定义代码作为 补充文件 1 上传。

1. QCL-MIR数据预处理与分析
   1. 数据预处理
      1. 以适当的格式导出高光谱数据以供进一步分析。
      2. 使用 CytoSpec 和 MATLAB 执行数据预处理，步骤 3.1.1.3-3.1.1.8
      3. 将 MIR 光谱数据导入 CytoSpec v2.00.07 进行预处理。
      4. 使用 CytoSpec 中的内置 质量测试 模块评估光谱质量。选择 标准 2 （样品厚度）以评估样品一致性。将 光谱积分范围 设置为 950-1800 ^cm-1。定义 50 到 1000 个单位之间的吸光度阈值，以排除过薄或过厚区域的光谱。
      5. 在 CytoSpec 中使用基于 PCA 的滤波来降低噪声。保留前 10 种主成分 （PC） 以消除高频噪声，同时保留关键的生化方差。
      6. 以 .mat 格式从 CytoSpec 导出预处理的光谱数据，以便在 MATLAB 中进行进一步分析。
      7. 在 MATLAB 中使用橡皮筋校正算法在 950-1800 ^cm-1 光谱范围内执行基线校正，以消除基线漂移并提高光谱精度。
      8. 在相同的光谱范围内使用最小-最大缩放应用光谱归一化，以标准化所有光谱的强度，并确保整个数据集的可比性。
   2. 数据分析
      1. 在 1,550 ^cm-1 和 1,650 ^cm-1 处鉴定蛋白质相关特征，分别对应于酰胺 II 和酰胺 I 条带。在 1,740 ^cm-1 处识别脂质相关特征，代表酯 C=O 拉伸振动。
      2. 计算酰胺 I 条带 （1650 ^cm-1） 与酯 C=O 拉伸 （1740 ^cm-1） 的强度比，并生成比率图以可视化空间脂质与蛋白质的分布。
      3. 无监督聚类分析：使用欧几里得距离和沃德联锁对高光谱数据进行分层聚类分析（HCA），根据光谱相似度对区域进行分类。生成聚类图以识别生化不同的区域并揭示结构或病理差异。
2. MSI 数据预处理和分析
   1. 将原始 MSI 数据导入商业数据分析平台。
   2. 以相对强度> 0.01% 执行峰拾取。
   3. 通过将基质衍生的峰与从纯基质对照区域获得的光谱进行比较，从实验峰列表中排除基质衍生的峰。去除控制频谱中出现且信噪比 （SNR） 小于 3 的任何峰。
   4. 将数据集归一化为均方根 （RMS），以考虑离子信号强度在像素和样品之间的变化。
   5. 通过根据组织分布过滤特征、与人类代谢组数据库 （HMDB） 中的条目匹配以及与理论 m/z 值一致来完善代谢物鉴定。
   6. 根据实验目标和组织背景选择相关代谢物。
   7. 将所有像素的所选特征的强度导出为 CSV 文件。
   8. 应用降维技术（例如 PCA、t-SNE 或 UMAP）来降低数据复杂性，并使用 Seurat 和 Banksy 等生物信息学工具识别具有相似代谢特征的像素簇，从而促进空间代谢异质性的可视化。

4. 多模态图像共配准与协同分析

1. 选择在1650 ^cm-1 处获取的MIR图像作为空间参考进行共配准。这个特定的波数突出了酰胺 I 蛋白条带，提供强烈的组织对比度。
2. 对 MIR 和 MSI 图像的强度值进行归一化，以增强视觉可比性。应用对比度增强技术，例如在 MATLAB 中使用 histeq 函数进行直方图均衡，以重新分配图像强度并提高对地标选择至关重要的结构特征的可见性。
3. 使用 Image Processing Toolbox 中的 cpselect 函数将 MIR 和 MSI 图像加载到 MATLAB 中。此功能打开一个用于地标选择的交互式界面。
4. 使用 cpselect 功能在 MIR 和 MSI 图像上手动注释 5 到 10 个解剖学相关且分布良好的控制点。这些标志应对应于不同的形态特征，例如组织边界。
   注意：将控制点均匀分布在图像场上，以最大限度地减少局部失真。
5. 从两个图像中导出并记录带注释的控制点的坐标。将它们存储为两个匹配的数组以进行转换计算（例如，movingPoints 和 fixedPoints）。
6. 在仿射模式下使用 MATLAB 函数 fitgeotrans 计算仿射变换矩阵。此转换考虑了缩放、旋转、平移和剪切。
7. 使用 MATLAB 中的 imwarp 函数将计算的变换应用于 MSI 图像。此步骤生成一个空间配准的 MSI 图像，该图像在几何上与 MIR 参考系对齐。
8. 在混合模式下使用 imshowpair 函数目视检查对齐，以叠加 MSI 和 MIR 图像并确认结构特征的正确配准。
9. 使用 MATLAB 中的 imbinarize 函数将注册的 MSI 图像和参考 MIR 图像转换为二进制掩码。
10. 计算骰子相似系数 （DSC） 以量化两个二进制掩码之间的空间重叠。DSC 定义为：DSC = 2 ×（重叠面积）/（两个掩模的总面积）。DSC值接近1.0表示空间重叠和配准精度高。
    注意：如有必要，通过调整控制点的数量或位置并重复转换过程来优化配准。如果局部错位仍然存在，请考虑使用非刚性配准方法。
11. 保存已注册的图像、变换参数和地标坐标，用于下游多模态图像分析，如生化和结构特征的空间相关性。

结果

为了验证上述多模态空间代谢组学策略，我们在癌症小鼠模型中实施了它。肿瘤细胞经过基因改造，表达绿色荧光蛋白（GFP），通过荧光成像实现肿瘤区域的精确定位。图2A显示了光谱覆盖范围为950-1800 ^cm-1的无标记QCL-MIR成像结果，称为“指纹区域”。代表性的MIR条带在图2A中标记，例如P = O拉伸（1240cm-1，核酸和磷酸脂），酰胺II（1550cm-1，蛋白质），酰胺I（1650cm-1，蛋白质）和酯C = O拉伸（1740cm-1，甘油脂）。

GFP荧光信号作为评估肿瘤区域空间对应关系的内部参考（图2B）。酰胺I和酰胺II条带的光谱积分图（图2C）显示GFP标记的肿瘤区域的吸光度降低，表明与相邻正常组织相比，癌细胞中的蛋白...

讨论

在这里，我们提出了一种多模态空间代谢组学策略，该策略集成了 MSI 和 MIR 成像，以实现对同一标本的高通量、分子特异性代谢分析。MIR 成像可实现基于分子振动的无标记、无损化学图谱，提供详细的结构和官能团信息。相比之下，MSI 为代谢物鉴定和定量提供了高灵敏度和特异性，使其成为代谢组学研究的基石。通过整合这两种模式，它可以利用 MIR 成像的化学特异性和 MSI 分子精度的互补优势，更全面地了解代谢异质性。

所提出的多模态平台的一个关键优势是它能够执行空间分辨感兴趣区域（ROI）识别以进行目标MSI采集。高通量MIR成像是一种快速、无标记、非侵入性的方式，可指导ROI选择²¹。与相邻组织切片的传统组织学染色不同，后者引入空间错位并增加准备步骤^22，MIR成像可在同一组织切片上定位ROI，从而简化工作流程并减少变异性²³。将这种方法与无监督机器学习相结合可以实现自主 RO...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4%多聚甲醛，组织固定液	三工生物	E672002
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	126615
C57BL/6JNifdc 小鼠	Charles River	219
CaF2 载玻片	Crystran	CAFP25-1
低温恒温器切片机	Dakewe Biotech	CT520
Cytospec	Peter Lasch	版本 2.10.01	用于 MIR 数据分析的软件，包括基线校正、归一化、图像生成和高光谱分析。
DPBS缓冲液	Fisher Scientific	14-190-250
胎牛血清	Gibco	10270106
冷冻干燥机	LABCONCO	FreeZone
明胶	Sigma-Aldrich	G1890	A 型，来自猪皮
HBSS 缓冲液	Sangon Biotech	A003210
高糖DMEM	ThermoFisher Scientific	10564011
Matlab	MathWorks	Matlab R2024a	软件，用于 MIR 数据分析，包括基线校正、归一化、图像生成和高光谱分析。
基质辅助激光解吸电离质谱成像 （MALDI-MSI） 系统	Bruker Daltonics GmbH	timsTOF fleX MALDI-2
甲醇	国药化学试剂	10014108
mMass	虫学研究所，	5.5.0 版	MSI 数据分析软件。将原始MSI数据导入SCILS Lab进行预处理。以 mMass 为单位进行峰拾取，相对强度> 0.01%。
N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐（NEDC）基质	Sigma Aldrich	222488
青霉素链霉素	ThermoFisher Scientific	15140122
子级联激光器 中红外（QCL-MIR）显微镜	布鲁克光学有限公司	H LUMOS II ILIM
红磷	Sigma-Aldrich	8.0727
SCiLS 实验室	布鲁克道尔托尼斯	SCiLS 实验室 2024b	用于 MSI 数据分析的软件。将原始MSI数据导入SCILS Lab进行预处理。以 mMass 为单位进行峰拾取，相对强度> 0.01%。
喷雾器	HTX Technologies	TM
胰蛋白酶，0.25% EDTA	ThermoFisher Scientific	C25200072