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方法文章

通过逐步中胚层诱导和三维自组织从胚胎干细胞生成人类心脏类器官

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DOI：

10.3791/68738

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2025年10月7日

 , 
1Basic Medicine Research Innovation Center for Cardiometabolic Diseases, Ministry of Education, Southwest Medical University, 2Nucleic Acid Medicine, Key Laboratory of Luzhou, Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Southwest Medical University, 4Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education, Southwest Medical University, 5Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

本文内容

摘要

本方案详细描述了从人类胚胎干细胞（hESCs）生成功能性人类心脏类器官的逐步方法。该方法包括细胞解冻、分化和成熟步骤，为心脏发育和疾病建模提供了可靠的平台。

摘要

由人胚胎干细胞（hESC）衍生的心脏类器官是多细胞三维（3D）结构，可重现早期人类心脏发育和功能的关键特征。这些自组织的类器官表现出自发性收缩、心肌细胞标志物的表达以及类似天然心肌组织的组织结构。本文介绍了一种从H9 hESC细胞系通过逐步谱系分化生成心脏类器官的稳健且可重复的实验方案。中胚层诱导通过使用激活素A（Activin A，50 ng/mL）、骨形态发生蛋白4（BMP4，10 ng/mL）、成纤维细胞生长因子2（FGF2，30 ng/mL）、laduviglusib（CHIR99021，3 µM）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂（LY294002，5 µM）处理细胞球36–40小时来启动。随后，通过连续四天每日暴露于BMP4（10 ng/mL）、FGF2（10 ng/mL）、Wnt信号通路抑制剂（XAV-939，5 µM）和视黄酸（0.5 µM）来引导心脏谱系特化。自第5.5天起，使用BMP4（10 ng/mL）、FGF2（10 ng/mL）和胰岛素（10 µg/mL）进一步促进心肌细胞的分化与成熟。通过延时成像和免疫荧光分析进行功能验证，确认生成了表达心肌肌钙蛋白T（cTnT）的可收缩心肌细胞。此外，三维免疫染色显示α-SMA和CDH5的存在，表明平滑肌样细胞和内皮样细胞群体的出现。这些心脏类器官持续表现出节律性收缩；然而，尚未进行直接的电生理学验证以确认电-机械耦合。已知的局限性包括类器官无法传代以及在长期培养过程中可能出现中心坏死。总之，该模型为研究人类心脏发生、药物反应及先天性心脏病提供了一个可扩展且具有生理相关性的平台。

引言

心血管疾病仍然是全球发病率和死亡率的首要原因，凸显了迫切需要建立能够模拟人类心脏发育和功能的可靠体外模型1,2。尽管传统的心肌细胞二维（2D）单层培养具有重要价值，但其无法重现天然人类心脏的空间复杂性、多细胞相互作用以及电机械整合特性3,4。由多能干细胞衍生的三维心脏类器官作为一种强有力的平台应运而生，克服了这些局限性，能够在体外形成具有自我组织能力的多细胞结构，模拟早期心脏形态发生和功能成熟过程in vitro5。

人胚胎干细胞（如H9细胞系）具有分化为所有体细胞类型的内在能力，包括心肌细胞、内皮细胞和心脏成纤维细胞6在受控的培养条件下，可引导hESCs依次经历中胚层诱导、心脏中胚层特化及心肌细胞分化等阶段。5,7该逐步过程可利用特定的信号分子和抑制剂进行调控，包括Activin A、BMP4、FGF2、PI3K抑制剂、CHIR99021、Wnt抑制剂和视黄酸。5,8. 通过高度模拟 体内 胚胎心脏发育信号环境中的这些信号促进高效且可重复的心脏发生 体外5,7.

与许多需要嵌入基质胶（Matrigel）等细胞外基质（ECM）组分的类器官系统不同，心脏类器官可在低黏附条件下自我组装，无需基质支持5,9。将正在分化的hESCs在悬浮状态下聚集，可在分化第一周内形成球形三维结构，并出现自发性搏动10。这些类器官包含具有功能相关性的心脏细胞群体，并表现出典型特征，如肌节结构排列、钙瞬变以及节律性收缩11,12，为早期人类心肌组织提供了生理相关性良好的模型。

利用人胚胎干细胞（hESC）衍生心脏类器官的能力，为发育生物学、疾病建模、药物筛选和心脏毒性测试提供了令人振奋的机遇13,14。此外，结合基因组编辑技术与患者特异性的诱导多能干细胞（iPSCs），可实现对遗传性心脏疾病进行个体化疾病建模及治疗探索。

本文介绍了一种由人胚胎干细胞生成心脏类器官的详细分步实验方案，重点阐述了分化过程中的关键阶段、培养条件以及验证技术。该平台为重现人类心脏发育过程提供了可靠且可扩展的系统，并为未来的转化研究奠定了基础。

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方案

所有涉及人胚胎干细胞（H9）的实验操作均按照机构指南进行，并经西南医科大学生物医学伦理委员会批准，批准编号为20241023-031。以下详述的所有组织培养操作均应在II级生物安全柜中进行。始终确保培养基和试剂在使用前已自然平衡至室温，不得使用水浴加热培养基。

1. HESC（H9）的解冻与常规培养

  1. 培养板的玻连蛋白包被
    1. 将玻连蛋白储备液置于冰上解冻，并用冷的E8培养基稀释至工作浓度10 µg/mL。
    2. 向6孔板的每孔中加入1 mL稀释后的玻连蛋白溶液。在使用前，将该板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育1–4小时。
    3. 接种细胞前，吸除多余的玻连蛋白，不要冲洗。
      注意：在细胞培养箱中孵育可改善包被的均匀性并增强细胞贴附，这对敏感的hESC尤其重要。切勿让包被液干燥。本方案仅在hESC解冻和扩增阶段使用玻连蛋白包被的培养板，以提供一种明确的、表面结合的细胞外基质（ECM）替代物。心脏类器官随后将在低黏附悬浮条件下通过自聚集形成，无需额外添加ECM。
  2. 解冻冻存的HESC（H9）
    1. 提前至少30–60分钟，将所有所需培养基和试剂（如E8培养基、含ROCK抑制剂的E8培养基、PBS）在室温下自然平衡至室温。
    2. 佩戴适当的个人防护装备，从液氮储存中取出一支H9人胚胎干细胞冻存管。立即将冻存管浸入37 °C水浴中，轻轻摇动并密切观察。
    3. 当仅剩少量冰晶时（约90%已解冻，约1–2分钟），立即将冻存管转移至生物安全柜中。用75%乙醇对外表面进行消毒后再打开。
    4. 将冻存管内容物逐滴缓慢加入含有5 mL室温E8培养基（添加10 µM Y-27632，ROCK抑制剂）的15 mL锥形离心管中。使用宽口移液吸头轻轻吹打混匀。
    5. 在室温下以200 × g离心5分钟。小心吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于2 mL E8 + Y-27632培养基中。
    6. 将细胞以所需接种密度（通常为每孔150,000–200,000个细胞）接种至预先准备好的玻连蛋白包被的6孔板中。轻轻晃动培养板使细胞分布均匀，然后转移至37 °C、5% CO2培养箱中。
      注意：在解冻后最初24小时内使用ROCK抑制剂（Y-27632）对于防止失巢凋亡并支持细胞存活至关重要。
  3. 常规维护与传代
    1. 每日更换培养基，每孔加入2 mL新鲜E8培养基。
    2. 每天在相差显微镜下观察；当细胞达到约70–80%融合度时进行传代，通常每3–4天一次。
      1. 传代操作：吸除培养基，用1 mL DPBS轻轻冲洗。
      2. 加入0.5 mL干细胞解离试剂，在室温下孵育3–5分钟。轻敲培养板以使细胞集落脱落。
      3. 收集细胞悬液，并以1:3–1:4的传代比例接种至新制备的玻连蛋白包被孔中，使用含10 µM Y-27632的E8培养基。24小时后，更换为不含ROCK抑制剂的E8培养基。
        注意：为获得最佳复苏效果及后续分化效率，HESC应以2–10个细胞组成的小细胞团形式进行传代。
        建议使用宽口吸头以最小化剪切应力。可使用5 mL移液吸头或10 mL血清移液管进行混匀操作。

2. 将HESC（H9）分化为心肌细胞谱系

  1. 中胚层分化诱导（第0-1.5天）
    注意：避免将刚解冻的HESCs（H9）直接分化为心脏类器官。在启动分化前，细胞必须先传代并维持至少一次传代，以确保最佳的细胞活力和健康的分化过程。解冻后立即进行分化可能因细胞健康状态受损而导致结果不佳。
    1. 预诱导接种：当hPSCs达到约70%融合度时，使用适当的解离试剂将细胞轻柔地解离成小细胞团。将细胞团重悬于2 mL E8培养基中，并添加10 µM ROCK抑制剂（Y-27632）。
    2. 聚集：将200 µL细胞悬液（通常含12,000–15,000个细胞）接种至96孔超低吸附培养板的每个孔中，随后在室温下以200 × g 离心3分钟，以促进细胞在每孔底部聚集形成细胞球。
    3. 孵育：将培养板置于37 °C、5% CO2 的培养箱中培养24小时，使细胞形成致密且均一的胚胎体（EBs）。
    4. 通过混合50% IMDM、50% F12营养混合物、15 µg/mL胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）、450 µM单硫代甘油和5 mg/mL牛血清白蛋白V型，配制基础培养基（BC-M）。
    5. 在BC-M中添加Activin A（50 ng/mL）、BMP4（10 ng/mL）、CHIR99021（3 µM）、FGF2（30 ng/mL）和LY294002（5 µM），配制中胚层诱导培养基（MD-M）。
    6. 中胚层诱导：聚集24小时后，使用MD-M对EBs进行36小时的诱导。
      注意：为确保心脏类器官诱导的效率和一致性，我们严格限制H9 hESCs在解冻后仅使用不超过三次传代。该策略对于维持高分化效率和整体实验可靠性至关重要。
      换液过程中需轻柔操作，以保持细胞聚集体的完整性。避免破坏EBs的球形形态。
  2. 心脏中胚层分化诱导（第1.5–5.5天）
    注意：Wnt信号通路抑制剂（XAV-939）对于抑制后部中胚层信号、促进心脏谱系特化至关重要。视黄酸在前后轴模式形成中具有剂量依赖性作用；过量RA可能导致前肠特化。
    1. 在BC-M（组分详见步骤2.1）中添加BMP4（10 ng/mL）、FGF2（10 ng/mL）、视黄酸（0.5 µM）和XAV-939（5 µM），配制心脏中胚层分化培养基（CMD-M）。
    2. 中胚层诱导36–40小时后，小心吸除MD-M，更换为CMD-M，持续培养4天，每天更换培养基。
      ​注意：换液过程中应轻柔处理聚集体，避免机械损伤或应激性凋亡。
      ​在此期间，球状体逐渐变得更加致密和有序。至第5天，可在明场显微镜下观察到心脏谱系分化的早期迹象。
  3. 心脏类器官特化（第5.5–7.5天）
    1. 在BC-M（组分详见步骤2.1）中添加BMP4（10 ng/mL）、FGF2（10 ng/mL）和胰岛素（10 mg/mL），配制心脏类器官特化培养基（COS-M）。
    2. 在第5.5天，轻柔吸除CMD-M，更换为COS-M，培养2天，每天更换培养基。
      注意：此阶段BMP4和FGF2协同促进心脏前体细胞扩增，并抑制非心脏谱系命运。胰岛素支持分化中心肌细胞的代谢活性和结构发育。
  4. 心脏类器官成熟
    注意：转移过程中避免对球状体进行完全解离或吹打。心肌细胞对剪切应力高度敏感。
    1. 在BC-M（组分详见步骤2.1）中添加胰岛素（10 mg/mL），配制心脏类器官成熟培养基（COM-M）。
    2. 从第7.5天开始，转换至COM-M。每日更换培养基，以维持营养水平并清除代谢废物，同时尽量减少细胞应激。
    3. 从第8天至第12天，观察心脏类器官的自发性搏动，通常在光学显微镜下即可明显观察到。
    4. 至第12天及以上，确认收缩节律规律且持续。
      注意：可通过延时显微成像和图像分析工具对搏动频率和形态进行量化。
      从第12天起可进行电生理分析（如钙成像或MEA），以评估功能成熟度。

3. 冷冻保存的准备工作

  1. 使用宽口移液器小心地将心脏类器官从培养板中转移，以避免机械损伤。将其放入15 mL锥形管中，通过重力自然沉降3-5分钟，无需离心。
  2. 配制冷冻保存培养基（Cryo-CM），成分如下（终浓度）：80% CM-M、10% FBS、10% DMSO。
  3. 将心脏类器官轻轻重悬于每支冻存管中500 µL Cryo-CM中。
  4. 将冻存管放入基于异丙醇的冷冻容器中，在-80 °C保存12-24小时，以确保以约1 °C/min的速率缓慢降温。
  5. 过夜冷冻后，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。
    注意：我们将心脏类器官以每支冻存管约20-30个成熟类器官的密度悬浮于1 mL冷冻保存培养基中进行冷冻保存。

4. 心脏类器官的回收与解冻

  1. 为回收类器官，需将冻存管在水浴中快速解冻，将心脏类器官转移至CM-M培养基中，轻轻离心以去除DMSO，并将类器官重悬于新鲜的CM-M中。
    注意：解冻后搏动通常在24–48小时内恢复，具体时间取决于类器官的成熟度及操作质量。

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结果

将H9人胚胎干细胞成功分化为心脏类器官的关键，始于多能干细胞的有效复苏与稳定维持。解冻后，当人胚胎干细胞接种于添加ROCK抑制剂的E8培养基中、并培养于包被了玻连蛋白的培养板上时，细胞表现出较高的存活率和良好的贴壁能力。24-48小时内，可观察到边界清晰、核质比高的致密细胞集落，表明细胞已恢复典型的未分化形态（图1A）。解冻后，人胚胎干细胞迅速进入增殖阶段，表现出显著的集落扩展能力，并重新建立多能性特征（图1A）。

从H9人胚胎干细胞（hESCs）生成心脏类器官的整体工作流程如图1B所示，详细描述了从干细胞维持到三维类器官形成与成熟的各个阶段。人胚胎干细胞成功分化为心脏类器官的过程表现为一系列明确的形态学和功能转变。在超低吸附培养板中聚集后的最初24小时内，会形成致密且均一的球状体。这些球状体呈现光滑、圆形的形态，具有较高的光学密度，表明细胞活力高且聚集均匀（图1...

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讨论

利用H9人胚胎干细胞成功生成心脏类器官依赖于对关键信号通路进行精确的时间和空间调控，以模拟早期心脏发育过程。该方案在化学成分明确的体系中重现了中胚层诱导、心脏谱系特化以及自组织形成三维收缩结构的关键阶段。该方法为人类心脏发育、先天性心脏病建模以及心脏毒性筛选提供了可靠且可重复的实验平台。

该方案中最关键的步骤之一是在诱导分化前确保H9 hESCs的健康状态和质量5。细胞在冻存复苏后需至少传代一次，并在诱导分化前培养至约70%融合度。15,16使用未经传代的新鲜解冻hESCs通常会导致细胞存活率低且心肌诱导效率低下。此外，在常规培养过程中，应避免过度消化或过度吹打，以维持克隆的完整性；当细胞以2-10个细胞组成的小细胞团形式维持时，可获得最佳效果。应避免使用酶法传代，以保持细胞的多能性及克隆形态。使用干细胞解离试剂可保留细胞间连接并最小化细胞应激，但需避免过度消化或过度吹打，以免形成单细胞悬液。

为确保实验的可重...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

感谢中国浙江大学基础医学院的季俊峰（Junfeng Ji）和罗涛（Tao Luo）慷慨提供人胚胎干细胞（H9）。本工作获得了国家自然科学基金（项目编号：U23A20398，负责人：C.Z.）、四川省科技计划项目（项目编号：2022YFS0578 和 2022YFS0614，负责人：C.Z.）、西南医科大学科研启动基金（项目编号：00040155，负责人：C.Z.）、西南医科大学科研启动基金（项目编号：00170071，负责人：B.W.）、泸州市人民政府与西南医科大学科技战略合作项目（项目编号：2024LZXNYDJ088，负责人：B.W.）、西南医科大学科技战略合作项目（项目编号：2024PZXNYD01，负责人：B.W.）以及西南医科大学基金（项目编号：2024ZKZ014，负责人：B.W.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.02% EDTABeyotimeC0198
6 孔 板CORNING3516
7.5% 牛血清白蛋白ACMECAC11954
96 孔超低吸附板CORNING7007
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgGYeasen34106ES60
Alexa Fluor 555 羊抗兔 IgGInvitrogenA-21428
CHIR-99021 单盐酸盐Yeasen52965ES10
DMSO SolarbioD8370
杜氏磷酸盐缓冲液 (D-PBS)Yeasen60152ES76
FBSGibco10099141C
FGF2 蛋白，人，重组TargetMolTMPY-00749-50 μg 
Ham's F-12 营养混合物life technologies11765054
hPSC-CDM（Essential 8 培养基）Cauliscell400105
人 BMP-4 重组蛋白GibcoPHC9534
IMDM，含 GlutaMAX 补充剂life technologies31980030
胰岛素-转铁蛋白-硒 (ITS-G)Gibco41400045
LY294002Sellecks1105-50mg
单硫代甘油Sigma-AldrichM6145
小鼠抗-αSMAAbmartMN50104
含 DAPI 的 ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36966
兔抗 CDH5AbmartTA6265
兔抗 cTNTInvitrogen701620
重组人 BMP-4 蛋白Yeasen92053ES20
重组人胰岛素 Yeasen40112ES25
重组人/小鼠/大鼠 Activin A 蛋白Yeasen91702ES10
ReLeSRStemcell100-0483
视黄酸Sigma-AldrichR2625
玻连蛋白GibcoA14700
XAV-939SelleckS1180
Y-27632 2HCl（ROCK 抑制剂）SelleckS1049

参考文献

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