本方案详细描述了从人类胚胎干细胞（hESCs）生成功能性人类心脏类器官的逐步方法。该方法包括细胞解冻、分化和成熟步骤，为心脏发育和疾病建模提供了可靠的平台。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本方案详细描述了从人类胚胎干细胞（hESCs）生成功能性人类心脏类器官的逐步方法。该方法包括细胞解冻、分化和成熟步骤，为心脏发育和疾病建模提供了可靠的平台。
由人胚胎干细胞（hESC）衍生的心脏类器官是多细胞三维（3D）结构，可重现早期人类心脏发育和功能的关键特征。这些自组织的类器官表现出自发性收缩、心肌细胞标志物的表达以及类似天然心肌组织的组织结构。本文介绍了一种从H9 hESC细胞系通过逐步谱系分化生成心脏类器官的稳健且可重复的实验方案。中胚层诱导通过使用激活素A（Activin A，50 ng/mL）、骨形态发生蛋白4（BMP4，10 ng/mL）、成纤维细胞生长因子2（FGF2，30 ng/mL）、laduviglusib（CHIR99021，3 µM）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂（LY294002，5 µM）处理细胞球36–40小时来启动。随后，通过连续四天每日暴露于BMP4（10 ng/mL）、FGF2（10 ng/mL）、Wnt信号通路抑制剂（XAV-939，5 µM）和视黄酸（0.5 µM）来引导心脏谱系特化。自第5.5天起，使用BMP4（10 ng/mL）、FGF2（10 ng/mL）和胰岛素（10 µg/mL）进一步促进心肌细胞的分化与成熟。通过延时成像和免疫荧光分析进行功能验证，确认生成了表达心肌肌钙蛋白T（cTnT）的可收缩心肌细胞。此外，三维免疫染色显示α-SMA和CDH5的存在，表明平滑肌样细胞和内皮样细胞群体的出现。这些心脏类器官持续表现出节律性收缩；然而，尚未进行直接的电生理学验证以确认电-机械耦合。已知的局限性包括类器官无法传代以及在长期培养过程中可能出现中心坏死。总之，该模型为研究人类心脏发生、药物反应及先天性心脏病提供了一个可扩展且具有生理相关性的平台。
心血管疾病仍然是全球发病率和死亡率的首要原因，凸显了迫切需要建立能够模拟人类心脏发育和功能的可靠体外模型1,2。尽管传统的心肌细胞二维（2D）单层培养具有重要价值，但其无法重现天然人类心脏的空间复杂性、多细胞相互作用以及电机械整合特性3,4。由多能干细胞衍生的三维心脏类器官作为一种强有力的平台应运而生，克服了这些局限性，能够在体外形成具有自我组织能力的多细胞结构，模拟早期心脏形态发生和功能成熟过程in vitro5。
人胚胎干细胞（如H9细胞系）具有分化为所有体细胞类型的内在能力，包括心肌细胞、内皮细胞和心脏成纤维细胞6在受控的培养条件下，可引导hESCs依次经历中胚层诱导、心脏中胚层特化及心肌细胞分化等阶段。5,7该逐步过程可利用特定的信号分子和抑制剂进行调控，包括Activin A、BMP4、FGF2、PI3K抑制剂、CHIR99021、Wnt抑制剂和视黄酸。5....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
所有涉及人胚胎干细胞（H9）的实验操作均按照机构指南进行，并经西南医科大学生物医学伦理委员会批准，批准编号为20241023-031。以下详述的所有组织培养操作均应在II级生物安全柜中进行。始终确保培养基和试剂在使用前已自然平衡至室温，不得使用水浴加热培养基。
1. HESC（H9）的解冻与常规培养
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
将H9人胚胎干细胞成功分化为心脏类器官的关键，始于多能干细胞的有效复苏与稳定维持。解冻后，当人胚胎干细胞接种于添加ROCK抑制剂的E8培养基中、并培养于包被了玻连蛋白的培养板上时，细胞表现出较高的存活率和良好的贴壁能力。24-48小时内，可观察到边界清晰、核质比高的致密细胞集落，表明细胞已恢复典型的未分化形态（图1A）。解冻后，人胚胎干细胞迅速进入增殖阶段，表现出显著的集落扩展能力，并重新建立多能性特征（图1A）。
从H9人胚胎干细胞（hESCs）生成心脏类器官的整体工作流程如图1B所示，详细描述了从干细胞维持到三维类器官形成与成熟的各个阶段。人胚胎干细胞成功分化为心脏类器官的过程表现为一系列明确的形态学和功能转变。在超低吸附培养板中聚集后的最初24小时内，会形成致密且均一的球状体。这些球状体呈现光滑、圆形的形态，具有较高的光学密度，表明细胞活力高且聚集均匀（图1.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
利用H9人胚胎干细胞成功生成心脏类器官依赖于对关键信号通路进行精确的时间和空间调控，以模拟早期心脏发育过程。该方案在化学成分明确的体系中重现了中胚层诱导、心脏谱系特化以及自组织形成三维收缩结构的关键阶段。该方法为人类心脏发育、先天性心脏病建模以及心脏毒性筛选提供了可靠且可重复的实验平台。
该方案中最关键的步骤之一是在诱导分化前确保H9 hESCs的健康状态和质量5。细胞在冻存复苏后需至少传代一次，并在诱导分化前培养至约70%融合度。15,16使用未经传代的新鲜解冻hESCs通常会导致细胞存活率低且心肌诱导效率低下。此外，在常规培养过程中，应避免过度消化或过度吹打，以维持克隆的完整性；当细胞以2-10个细胞组成的小细胞团形式维持时，可获得最佳效果。应避免使用酶法传代，以保持细胞的多能性及克隆形态。使用干细胞解离试剂可保留细胞间连接并最小化细胞应激，但需避免过度消化或过度吹打，以免形成单细胞悬液。
为确保实验的可重.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明无任何利益冲突。
感谢中国浙江大学基础医学院的季俊峰（Junfeng Ji）和罗涛（Tao Luo）慷慨提供人胚胎干细胞（H9）。本工作获得了国家自然科学基金（项目编号：U23A20398，负责人：C.Z.）、四川省科技计划项目（项目编号：2022YFS0578 和 2022YFS0614，负责人：C.Z.）、西南医科大学科研启动基金（项目编号：00040155，负责人：C.Z.）、西南医科大学科研启动基金（项目编号：00170071，负责人：B.W.）、泸州市人民政府与西南医科大学科技战略合作项目（项目编号：2024LZXNYDJ088，负责人：B.W.）、西南医科大学科技战略合作项目（项目编号：2024PZXNYD01，负责人：B.W.）以及西南医科大学基金（项目编号：2024ZKZ014，负责人：B.W.）的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.02% EDTA | Beyotime | C0198 | |
| 6 孔 板 | CORNING | 3516 | |
| 7.5% 牛血清白蛋白 | ACMEC | AC11954 | |
| 96 孔超低吸附板 | CORNING | 7007 | |
| Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG | Yeasen | 34106ES60 | |
| Alexa Fluor 555 羊抗兔 IgG | Invitrogen | A-21428 | |
| CHIR-99021 单盐酸盐 | Yeasen | 52965ES10 | |
| DMSO | Solarbio | D8370 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 (D-PBS) | Yeasen | 60152ES76 | |
| FBS | Gibco | 10099141C | |
| FGF2 蛋白，人，重组 | TargetMol | TMPY-00749-50 μg | |
| Ham's F-12 营养混合物 | life technologies | 11765054 | |
| hPSC-CDM（Essential 8 培养基） | Cauliscell | 400105 | |
| 人 BMP-4 重组蛋白 | Gibco | PHC9534 | |
| IMDM，含 GlutaMAX 补充剂 | life technologies | 31980030 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 (ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
| LY294002 | Selleck | s1105-50mg | |
| 单硫代甘油 | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 小鼠抗-αSMA | Abmart | MN50104 | |
| 含 DAPI 的 ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36966 | |
| 兔抗 CDH5 | Abmart | TA6265 | |
| 兔抗 cTNT | Invitrogen | 701620 | |
| 重组人 BMP-4 蛋白 | Yeasen | 92053ES20 | |
| 重组人胰岛素 | Yeasen | 40112ES25 | |
| 重组人/小鼠/大鼠 Activin A 蛋白 | Yeasen | 91702ES10 | |
| ReLeSR | Stemcell | 100-0483 | |
| 视黄酸 | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| 玻连蛋白 | Gibco | A14700 | |
| XAV-939 | Selleck | S1180 | |
| Y-27632 2HCl（ROCK 抑制剂） | Selleck | S1049 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。