方法文章

利用脑部开放流式微透析技术在胶质母细胞瘤动物模型中纵向采集间质液

DOI：

10.3791/68748

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2025年12月23日

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1Department of Neurological Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

体内，许多中枢神经系统疾病（如胶质母细胞瘤，GBM）所涉及的细胞间通讯极难进行测量和表征。本文介绍了脑部开放流动微透析（cOFM）的操作流程，该方法可用于在GBM的纵向动物模型中采集间质液成分。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

中枢神经系统（CNS）疾病通过复杂的动态细胞间通讯网络表现出来。胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤，是这种复杂性的典型代表，其病程进展迅速，预后极差，生存期通常以月计而非以年计。GBM 的生物学行为由肿瘤细胞与基质细胞之间复杂的信号分子交换所驱动，从而促进疾病的侵袭性进展。本文介绍了一种在 GBM 小鼠模型中应用的详细的大脑开放流动微透析（cOFM）操作流程，可实现对肿瘤微环境中间质液（ISF）动态变化的实时、纵向监测。本方法包括植入耐用的导管套管头固定装置，通过该导管直接进行颅内胶质瘤移植，以及采集高质量的 cOFM 样本用于代谢组学和蛋白质组学的液相色谱-质谱（LC-MS）分析。尤为重要的是，cOFM 克服了传统微透析在分子尺寸上的局限性。除 GBM 外，cOFM 技术还有望通过在其相应的动物模型中提供病因学及治疗响应性生物标志物，为一系列中枢神经系统疾病（包括神经退行性疾病、癫痫及神经精神疾病）带来突破性的研究见解。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于脑脊液（ISF）介导的复杂且多模式的细胞间信号传导，研究中枢神经系统（CNS）疾病极具挑战性1,2,3,4。这种复杂性在胶质母细胞瘤（GBM）等脑肿瘤中尤为显著，其中细胞间信号在肿瘤细胞和基质细胞之间传递5,6,7,8,9。在许多情况下，多种生物分子（包括代谢物和蛋白质类信使）的异常交换促进了中枢神经系统疾病的发病机制。这一研究难题在GBM中尤为突出，因为ISF的分子组成具有时间动态性，并随着疾病进展以及干预性治疗的实施而不断演变10,11。

传统的胶质母细胞瘤临床前研究方法包括 体外 研究和单终点动物模型。这些方法由于无法同时捕捉肿瘤微环境的特征以及时间上的纵向动态变化，限制了其更广泛的临床应用。20世纪80年代初期取得的进展通过脑内微透析（cMD）技术的发展克服了这些情境局限性。12,13,14,15自45年前问世以来，cMD已确立为活体脑组织间液（ISF）纵向采样的标准方法16通过高浓度脑间质液溶质在半透膜中的自由扩散和对流作用，进入持续流动的低溶质浓度灌注液（通常为人工脑脊液，aCSF），从而实现这一过程。17这些半透膜由 多种生物相容性聚合物，其常见的分子量截留范围从20 kDa到3 MDa18该微创手术能够实现纵向观察 原位 采集多种多样的分析物，范围从小分子（如代谢物或神经递质）到大分子蛋白质（如抗体）。然而，cMD膜的结构孔隙性及其组成聚合物的吸附特性可能会显著影响具有特定生物化学或尺寸特征的分析物的相对回收率，例如脂质或抗体。19,20.

为克服cMD膜的这一局限性，自2010年代初起开始出现技术进展，其中脑部开放流动微透析（cOFM）技术得以发展21。cOFM与cMD遵循相似的基本原理，但通过采用一种具有低吸附性、宏观开口约为100 µm的塑料网格探针，取代了半透膜，从而消除了由半透膜带来的生化限制20。大量研究报告表明，与cMD相比，cOFM在收集可检测的脑间质液成分方面具有更优的实用性，这些成分包括肽类激素、纳米抗体/抗体、小分子脂溶性治疗药物以及聚乙二醇化脂质体19,22,23,24,25。先前有关cOFM导引探针植入后生理组织反应的研究显示，血脑屏障的完整性在植入后15天内得以恢复，且在植入后30天内未形成胶质瘢痕26。由于以宏观开口替代了微透析膜，研究人员还证明了cOFM导引探针具有创新应用潜力，可用于将异种移植的胶质瘤细胞注入免疫缺陷大鼠脑内，从而实现无创的肿瘤移植与生长，并直接围绕cOFM采样区域形成肿瘤组织27。

在将cOFM用于中枢神经系统病理学研究时，仍需充分认识其方法学上的局限性。由于该技术依赖于脑脊液中的分析物通过被动扩散和对流进入流动的灌注液，其局限性主要涉及分析物浓度和样品体积18。与内源性水平相比，采集到的cOFM灌注液中的脑脊液成分会被稀释，因此许多研究通常比较不同实验条件下分析物的相对比例28。典型的流速范围为0.1 µL/min至1.0 µL/min，相当于每小时仅6 µL至60 µL。考虑到管路死腔的清除时间，还应充分评估总采样持续时间。这一点在对麻醉动物进行cOFM采样时尤为重要，必须审慎考虑动物福利问题。有关这些及其他相关因素的更详细说明，可参见cOFM研发团队此前发表的方法学报告29。

在本文中，我们提供了一种用于神经系统疾病研究的纵向cOFM取样更新方案，重点聚焦于胶质母细胞瘤（GBM）。该方案包括cOFM导向套管植入、通过cOFM导向套管进行肿瘤细胞注射及成瘤，以及在清醒、自由活动动物中实施的两种cOFM取样配置。我们展示了代表性数据，证明了cOFM所测得的脑间质液（ISF）中代谢组学和蛋白质组学成分在治疗干预下的变化、不同取样配置对分析物浓度的影响，以及基于cOFM导向的肿瘤细胞植入方法的有效性。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案中的所有动物实验程序均已获得西北大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（方案编号：IS00021383），并遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南。本方案适用于8至10周龄及以上、雌雄皆可的C57BL/6J小鼠。本方案中使用的小鼠胶质瘤细胞系CT2A由波士顿大学Seyfried实验室提供，并在无菌组织培养条件下进行培养和制备。

1. 手术规划与准备

  1. 动物信息：进行cOFM实验时，应使用至少8至10周龄的小鼠，以确保其生长和发育完全。在仍在发育的颅骨和/或大脑中，固定位置的颅骨植入物可能会移位或影响正常生长。
  2. 手术坐标的选取：使用动物脑图谱确定目标区域相对于前囟的正交坐标。例如，胶质瘤细胞植入通常选择在纹状体进行，以最大程度地模拟原发性胶质母细胞瘤（GBM）的微环境，并提高后续肿瘤发育的效率。本方案中使用的cOFM引导植入坐标为：内侧-外侧（ML）= 2.5 mm，前-后（AP）= 0 mm，背-腹（DV）= 3.5 mm。
    注意：立体定位坐标可能因小鼠品系和年龄不同而有所差异。请使用针对特定物种和品系的脑图谱坐标，以确保cOFM引导装置的准确放置。
  3. cOFM组件配置的适当选择：订购适用于特定总长度（范围从2 mm至22 mm）、开放表面长度为1 mm至2 mm的cOFM适当配置组件。
    ​注意：动物在进行理毛行为时可能会使植入不当的cOFM引导头帽发生移位。为尽量减少此过程中头帽所受的机械杠杆作用，建议使用的引导装置长度不超过目标DV坐标距离2至3 mm。
  4. 根据实验目标规划手术和采样时间点：根据所研究的疾病类型及模型特征，仔细规划cOFM相关操作的时间和顺序，以最优方式探究相关生物学问题。
    1. 若研究健康脑组织与肿瘤微环境之间脑间质液（ISF）成分的差异，应在同一动物体内分别于肿瘤植入前和植入后进行cOFM采样操作。
    2. 若研究临床干预措施对中枢神经系统（CNS）病理的影响，应在接受对照或实验性治疗的平行动物组中，分别于干预前和干预后进行cOFM采样操作。

2. cOFM 导向装置放置手术

  1. 组装用于cOFM导管定位手术的外科器械（材料表），并根据需要通过高压灭菌器进行灭菌。
  2. 手术工作区准备：
    1. 消毒生物安全柜：在经过适当消毒的生物安全柜内进行手术操作。启动生物安全柜的气流系统，使用机构批准的消毒剂和擦拭方法清洁内部表面，并在柜底铺上无菌铺巾。
    2. 准备立体定位仪器：用消毒剂清洁立体定位仪，并将其放置于生物安全柜内。同样地，清洁并消毒安装在立体定位仪上的钻机和导管夹持器，并将其放入生物安全柜中。
    3. 手术台加热垫：在立体定位手术台上使用加热垫，为麻醉状态下的动物提供辅助加热。清洁并消毒加热垫表面，将其放置在立体定位仪上动物将要安置的位置。将加热垫调至低温，并在其上方覆盖1-2层无菌铺巾。
    4. 准备其他外科器械和设备：将额外的灭菌器械无菌地摆放在生物安全柜内。
    5. 恢复笼设置：将一个干净的恢复笼放置在调至最低温度的加热垫上。每只动物术后需单独置于一个恢复笼中直至完全苏醒，因此所需恢复笼的总数取决于手术操作数量和恢复时间。
  3. 术前动物准备（见图1A总结）：
    1. 麻醉：使用机构批准的麻醉药物及剂量，达到适当的麻醉深度，通过足底夹捏反射以及呼吸深度/频率来确认麻醉充分。例如，腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪混合液（100 mg/kg - 10 mg/kg，溶于生理盐水）足以使C57BL/6J小鼠达到合适的麻醉深度。
    2. 镇痛：使用机构批准的镇痛药物以辅助围手术期和术后疼痛管理。例如，皮下注射美洛昔康（20 mg/kg，溶于生理盐水）和缓释型布托啡诺（Buprenorphine SR，1 mg/kg）适用于围手术期镇痛管理。
    3. 脱毛（剃毛或脱毛膏）：使用电动剃刀和/或脱毛膏去除颅骨顶部预定手术区域的毛发。若使用脱毛膏，应避免停留时间过长，以防皮肤刺激。
    4. 眼科软膏：使用无菌棉签轻轻将眼科软膏涂抹于双眼，以防止手术期间角膜干燥。
    5. 将动物固定于立体定位仪：将动物正确安置于立体定位仪中，将门齿插入咬合块，将耳杆轻柔但牢固地插入耳道，并将鼻夹固定在动物鼻骨上方（图1B）。若位置正确，动物颅骨应被牢固固定且无任何移动。
    6. 无菌手术区域准备：用酒精（乙醇或异丙醇）和聚维酮碘交替擦拭手术区域周围皮肤三次，以无菌方式对该区域进行消毒，为切口做准备。
  4. 切口与颅骨表面准备：
    ​注意：以下所有步骤应尽可能以无菌方式进行。为此，主刀外科医生在进行切口前应在标准实验手套外佩戴无菌外科手套。
    1. 切口位置与长度：使用无菌手术刀沿颅骨表面做一条矢状正中切口，起始于两眼之间，向后延伸8-10 mm（图1C）。
    2. 皮肤牵开：使用无菌镊子、棉签和/或手术刀片将皮肤从正中切口向两侧牵开。确保前囟（Bregma）和后囟（Lambda）均清晰可见，必要时延长切口。
    3. 骨膜切开：使用无菌手术刀切开骨膜，并用镊子将组织向侧方牵开。
    4. 过氧化氢擦拭：使用无菌棉签蘸取稀释的1%-3%过氧化氢清洁颅骨表面（图1D）。此步骤也有助于通过矢状缝、冠状缝和人字缝识别前囟和后囟。
    5. 自酸蚀牙科粘合剂：使用0.3 mL至1.0 mL胰岛素注射器，均匀地将20-40 µL自酸蚀牙科粘合剂涂布于颅骨表面（图1D）。使用牙科固化灯辅助酸蚀过程。固化后，使用无菌棉签和生理盐水擦去多余粘合剂。
      ​警告：自酸蚀牙科粘合剂（如Bond Force）属于潜在危险物质：易燃危险（GHS02: H225）、健康危害（GHS07和GHS08: H315, H319, H317, H361fd, H336）以及环境危害（GHS09: H412）。请遵循当地和机构关于危险废物处理的指南。
  5. 定位并钻孔：
    1. 将已灭菌的0.7 mm钻头插入微型钻机，并使用合适的夹具将其安装至立体定位仪上。
    2. 在矢状缝与冠状缝交点处定位前囟（Bregma），并使用立体定位微操纵器将钻头移至该位置。
    3. 将钻头重新定位至cOFM导管坐标（ML = 2.5, AP = 0.0），启动钻机至15,000 rpm，通过调节DV方向微操纵器旋钮小心钻出骨孔（图1E）。钻孔过程中应频繁观察颅骨厚度，防止损伤下方脑组织。钻孔时使用生理盐水冲洗骨屑，并降低钻头与颅骨之间的热量。
    4. 对每个锚定螺钉坐标重复钻孔操作（图1E）。推荐的锚定螺钉位置为ML = 2.5, AP = -2.5，以及ML = -2.5, AP = -2.5。
    5. 完成骨孔钻取后，将微型钻机及钻头夹具从立体定位仪上拆下。
    6. 使用30 G针头在cOFM导管骨孔下方轻柔穿刺硬脑膜。
  6. 使用一对无菌镊子和合适尺寸的无菌螺丝刀安装锚定螺钉（图1F）。根据螺钉螺距，当螺钉旋入深度为一至两个螺纹长度时即可提供足够固定。注意不要将锚定螺钉旋入过深，以免损伤皮层。
  7. 将cOFM导管与cOFM假芯组件安装至导管夹持器，并将夹持器固定于立体定位仪上。将cOFM导管尖端置于骨孔上方（ML = 2.5 mm, AP = 0.0 mm），DV高度与前囟齐平，然后以1 mm/min的速度缓慢将cOFM导管经骨孔下降至预先确定的深度（图1F）。例如，若后续计划进行肿瘤细胞植入，则cOFM导管植入深度为DV = -3.5 mm。
  8. 在颅骨表面涂抹粘固剂，确保其均匀薄层覆盖cOFM导管和锚定螺钉下方及周围区域。每涂一层粘固剂后，使用牙科固化灯使其固化，再进行下一层涂抹（图1G）。持续涂抹粘固剂，直至各组件之间的颅骨表面、锚定螺钉完全被覆盖，且cOFM导管下方至沟槽周围区域也被覆盖。注意避免将粘固剂涂在或靠近锁紧楔处。
    警告：粘固剂（如Tetric EvoFlow）属于潜在危险物质：健康危害（GHS07: H317, H319, H335, H360）。请遵循当地和机构关于危险废物处理的指南。
  9. 将导管夹持器从cOFM导管上拆下，并通过微操纵器的DV调节旋钮缓慢提升导管夹持器。随后将微操纵器从立体定位仪上移除。
  10. 通过先松开并取出耳杆、再松开并撤回鼻夹，最后将动物门齿从咬合块中抬起的方式，将动物从立体定位仪上取下。
  11. 使用可吸收缝线（如聚乙醇酸（PGA）或聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Vicryl））缝合皮肤，确保覆盖在牙科粘固剂上方，同时保持cOFM导管本体暴露在外（图1H）。
  12. 在原切口周围的皮肤区域涂抹三重抗生素软膏。
  13. 动物恢复与支持：
    1. 将动物转移至独立的恢复笼（每笼一只），并使用低温设置的加热垫提供辅助加热。
    2. 可选：给予动物麻醉逆转剂以加快恢复。例如，皮下注射阿替美唑（1 mg/kg，溶于生理盐水）可将麻醉恢复时间从约1小时缩短至约20分钟。
    3. 持续观察并提供支持，直至动物充分恢复意识并能维持胸卧位。在动物完全从手术和麻醉中恢复之前，不得无人看管。
    4. 一旦动物完全恢复，即可将其放回与其他动物共用的饲养笼中。
    5. 术后一天，通过给予机构批准的镇痛药（如美洛昔康，参见步骤2.3.2）提供额外镇痛支持。
  14. 在cOFM导管植入手术后给予14天的恢复期，以确保血脑屏障完全愈合，方可进行任何后续操作。

3. 通过cOFM引导进行颅内肿瘤细胞植入

  1. 细胞培养与准备：
    1. 根据特定细胞类型的实验方案进行细胞培养与扩增。例如，同源小鼠胶质瘤细胞（如 CT2A）可在含有 DMEM 培养基、10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素补充剂的 10 cm 培养皿或 T-75 培养瓶中培养。
    2. 根据特定细胞类型的实验方案准备用于移植的培养细胞。
      1. 例如，对于同源 CT2A 胶质瘤细胞，移除生长培养基，用 PBS 短暂洗涤，并在 37 °C 条件下用含 0.53 mM EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶孵育 5 分钟。
      2. 加入等体积含 1% FBS 的 DMEM 中和胰蛋白酶，将细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟以收集细胞沉淀。
      3. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL PBS（或生理盐水）中。使用手动或自动细胞计数仪测定每毫升细胞总数。再次在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液，并用适量 PBS（或生理盐水）重悬，使细胞浓度达到每 µL 含 50,000 个细胞。将细胞悬液置于冰上，待后续移植使用（步骤 3.5.2）。
  2. 准备颅内肿瘤细胞移植手术所需的手术器械（材料表），并根据需要通过高压灭菌器进行灭菌。
  3. 手术工作区 准备
    1. 对生物安全柜进行消毒：参见步骤 2.2.1。
    2. 准备立体定位仪器：使用消毒剂清洁立体定位仪框架，并将其放入生物安全柜中。同样地，清洁并消毒安装在立体定位仪上的注射器固定架，并将其连接至立体定位仪框架。
    3. 对剩余的准备步骤执行步骤 2.2.3–2.2.5。
  4. 术前动物准备：
    1. 执行步骤 2.3.1、2.3.2、2.3.4 和 2.3.5 进行动物准备。
  5. 肿瘤细胞移植：
    1. 注射器与灌注插件组装（详见 图 2）
      1. 将带法兰的管路连接器浸泡于 70% 乙醇中至少 5 分钟。
      2. 将已灭菌的 10 µL 或 25 µL 气密玻璃注射器的尖端插入带法兰管路连接器的一端。
      3. 将 cOFM 灌注插件的入口端插入管路连接器的另一端。
      4. 将注射器-灌注插件组件固定至立体定位仪上的注射器固定架中。
    2. 向注射器-灌注插件组件中加入适量体积的细胞悬液。例如，加入 3 µL 浓度为每 µL 50,000 个细胞的细胞悬液，每只动物总注射量为 150,000 个细胞。
    3. 用灌注插件替换假插件：
      1. 使用镊子从 cOFM 导引套管和假插件组件中取出锁紧楔块，然后轻轻将 cOFM 假插件从导引套管中取出。
      2. 使用显微操作仪上的左右（ML）和前后（AP）调节旋钮，将注射器-灌注插件组件移动至 cOFM 导引套管上方。使用上下（DV）调节旋钮小心地将灌注插件插入 cOFM 导引套管中，并用镊子牢固地重新插入锁紧楔块以固定位置。
    4. 以 1 µL/min 的速率从注射器中注入 3 µL 细胞悬液。仔细观察 cOFM 导引套管和灌注插件周围区域，确保无细胞悬液外漏。注射完成后，额外等待 1 分钟，使颅内压力达到平衡。
    5. 用假插件替换灌注插件。
      1. 使用镊子从 cOFM 导引套管和灌注插件组件中取出锁紧楔块，然后调节显微操作仪的 DV 调节旋钮，小心地将 cOFM 灌注插件从导引套管中提起。
      2. 将 cOFM 假插件重新插入导引套管中，并用镊子重新插入锁紧楔块以固定其位置。
  6. 松开并取下耳杆，松开并收回鼻夹，然后将动物门齿从咬合固定块中抬起，使动物脱离立体定位仪框架。
  7. 动物恢复与支持：
    1. 将动物转移至独立的恢复笼（每笼一只动物），并使用设置为低档的加热垫提供辅助热源。
    2. 可选：给予动物麻醉逆转剂（如阿替美唑）以加快恢复速度，参见步骤 2.13.2。
    3. 持续观察并提供支持，直至动物充分恢复意识并能维持胸卧位。在动物完全从手术和麻醉中恢复之前，不得让其无人看护。
    4. 一旦动物完全恢复，即可将其放回群体饲养笼中与其他动物共同饲养。
    5. 术后次日，给予机构批准的镇痛药物（如美洛昔康）以提供额外镇痛支持（参见步骤 2.3.2）。
      ​注意：若使用表达荧光素酶的细胞系，可在细胞移植后 1–2 周进行生物发光成像（BLI），以验证肿瘤移植是否成功。尽管动物毛发或头部固定装置等物理特征可能影响检测到的发光信号，但仍可用于粗略判断肿瘤是否存在。或者，若 cOFM 导引套管植入时使用的锚定螺钉为非铁磁性且兼容 MRI，则可进行 MRI 检查。

4. 脑组织间液的cOFM取样

注意：由于cOFM依赖于分析物的被动扩散，其样本中的分析物浓度相较于内源性ISF环境有所稀释。因此，已有多种方法被提出用于校准样本测量值，以更准确地反映原位（in situ）浓度18。本节描述了两种不同的采样模式。步骤4.1介绍了制造商推荐的配置模式（下文称为“分段式”），该模式具有更高的时间敏感性，但会牺牲分析物浓度。步骤4.2详细说明了我们开发的一种替代配置模式（下文称为“循环式”），该模式可获得更高的分析物浓度，但时间分辨率有所降低。

  1. 分步式 cOFM 取样（总结于图 3A）：
    1. 将带法兰的管路连接件浸泡在 70% 乙醇中至少 5 分钟，以利于其连接到管路和取样插件上。
    2. 向灌注液袋中加入足量 aCSF 灌注液。例如，680 µL 的体积足以支持以 10 µL/min 流速进行 20 分钟的管路冲洗，以及以 1 µL/min 流速进行 8 小时的取样。然而，建议最小体积为 2 mL，以防止灌注液袋塌陷或功能异常。
    3. 使用气密玻璃注射器，用适量 aCSF 预填充推液和拉液管路。例如，通用推拉低吸附管路的内径为 0.25 mm，单根管路长度为 100 cm。这相当于约每 2 cm 对应 1 µL，因此推液管路中约含 55 µL，拉液管路中约含 100 µL。
    4. 如图 3A所示，正确将管路的蠕动段安装至微灌注泵的泵头中。
      ​注：如有需要，请参阅 BASi 操作手册获取更多说明。
    5. 使用鲁尔锁紧接头将灌注液袋连接至管路的推液段（图 3A，组件 i）。
    6. 使用带法兰的管路连接件将取样插件连接至管路。取样插件的入口（较长轴段）应连接至推液管路的输出端，与灌注液袋管路方向相反（图 3A，左上）。取样插件的出口（较短轴段）应连接至拉液管路的输入端，与灌注液袋管路平行（图 3A，右上）。将连接好的取样插件放入含有 750 µL aCSF 的无菌微量离心管中，准备进行系统冲洗。
    7. 使用带法兰的管路连接件将组分收集器针头连接至拉液管路的输出端（与取样插件出口相对的一端）。
    8. 以 10 µL/min 流速进行 20 分钟的管路系统冲洗，以去除管路系统中可能存在的气泡。
    9. 组分收集器设置：
      1. 标记并称量组分收集管，记录每个管的重量，以便后续比较和验证所收集样本体积。将收集管放入组分收集器转盘的相应插槽中。
      2. 打开组分收集器，并将设置配置为所需参数。示例设置包括：样本数量、样本时间（分钟）、延迟时间（小时）、制冷冷却和 _cannula 模式。
        ​注：从未接触原位 ISF 的拉液管死腔液体体积的丢弃量可通过以下因素估算：i）管路长度和体积（对于 OFM-PP2-100-LB 约为每 2 cm/µL），ii）流速，iii）延迟时间（小时）。在设置收集系统时应仔细考虑这些参数，以确保正确收集各组分。
  2. 循环式 cOFM 取样（总结于图 3B）：
    1. 将带法兰的管路连接件浸泡在 70% 乙醇中，以利于其连接到管路和取样插件上。
    2. 使用气密玻璃注射器，用适量 aCSF 预填充拉液管路。
    3. 正确将管路的蠕动段安装至微灌注泵的泵头中。
    4. 使用带法兰的管路连接件将取样插件连接至管路。取样插件的入口（较长轴段）应连接至拉液管路的输出端。取样插件的出口（较短轴段）应连接至拉液管路的输入端。将连接好的取样插件放入含有 750 µL aCSF 的无菌微量离心管中，准备进行系统冲洗。
    5. 以 10 µL/min 流速进行 20 分钟的管路系统冲洗，以去除管路系统中可能存在的气泡。
  3. 旋转笼系统设置：
    ​注：旋转动物笼系统（如 Raturn 系统）可通过防止推液和拉液管路过度缠绕，促进清醒动物的 cOFM 取样。该系统还可通过消除在清醒 cOFM 取样过程中手动解缠管路的需求，辅助实现 cOFM 取样的自动化。
    1. 将清洁的笼底垫料均匀铺在旋转笼底部，并在笼内配备易于获取的食物和水源。
    2. 打开笼体旋转控制器，通过旋转悬挂的束缚线测试其功能。笼体应相对于束缚线施加的旋转方向反向旋转。在动物未连接束缚线前，将旋转控制器设为待机状态。
  4. 将动物连接至 cOFM 系统：
    ​注：将动物连接或脱离 cOFM 系统的操作最宜在动物处于短暂异氟烷麻醉状态下进行。若操作正确，此过程每只动物不超过 5 分钟；但强烈建议使用眼用软膏。
    1. 动物麻醉：将动物放入异氟烷麻醉诱导室。以 2 L/min 的氧气流速和 3% 异氟烷浓度开始麻醉。观察动物直至达到适当麻醉深度（静止不动，呼吸频率约为每秒 1 次）。将动物从诱导室转移至麻醉面罩，维持 2 L/min 氧气流速和 3% 异氟烷浓度。
    2. 动物穿夹克：将动物穿入合适尺寸的夹克中，将前肢完全穿过袖孔，并沿动物背部牢固固定夹克（见图 3C）。
    3. 用取样插件替换假插件：使用镊子从导引套管和假插件组件中取出锁紧楔，小心地将假插件从导引套管中取出。轻柔地将取样插件插入导引套管，然后重新插入锁紧楔。
    4. 将动物从麻醉状态中移出，并放入旋转笼系统中。将笼体束缚线连接至动物夹克，并启动旋转笼系统。
  5. 执行 cOFM 取样：
    1. 将微灌注泵设为 5 µL/min，并进行 2 分钟冲洗，以去除因 cOFM 取样插件安装可能引入的微小气泡。
    2. 将微灌注泵设置更改为所需泵模式流速（例如 1 µL/min）。
    3. 启动泵模式。若进行分步式 cOFM 取样，同时启动组分收集器。
    4. 在 cOFM 取样的初始阶段，密切观察推液和拉液管路，确保无气泡存在，因为气泡会影响设备正常运行和样本收集，并可能危及动物安全。若发现气泡，应立即停止系统组件，将动物与 cOFM 系统分离，并通过 aCSF 冲洗管路去除气泡。
    5. 在整个 cOFM 取样过程中，持续频繁观察 cOFM 管路和动物行为。若动物行为显示突发健康变化，应立即停止系统组件并处理动物健康问题。必要时咨询机构兽医人员。
  6. 将动物从 cOFM 系统中分离：
    1. 关闭旋转笼系统，并将笼体束缚线从动物夹克上分离。
    2. 将动物转移至异氟烷麻醉诱导室，此时取样插件和 cOFM 管路仍连接在动物上。以 2 L/min 氧气流速和 3% 异氟烷浓度开始麻醉。观察动物直至达到适当麻醉深度（静止不动，呼吸频率约为每秒 1 次）。将动物从诱导室转移至麻醉面罩，维持 2 L/min 氧气流速和 3% 异氟烷浓度。
    3. 用假插件替换取样插件：使用镊子从导引套管和取样插件组件中取出锁紧楔，小心地将取样插件从导引套管中取出。轻柔地将假插件重新插入导引套管，然后重新插入锁紧楔。
    4. 脱夹克：解开动物夹克背部的固定件，并轻柔地将夹克从动物身上取下。
    5. 动物恢复与观察：将动物从异氟烷麻醉中移出，放入清洁的恢复笼中，持续观察直至动物完全恢复意识并能维持胸卧位。待动物完全恢复后，将其重新安置至饲养笼中。
  7. 样本收集与储存：
    1. 分步式取样：
      1. 从组分收集器中取出收集管，并置于冰上用于短期运输。
      2. 称量每个收集管，并与取样前重量进行比较，以验证样本体积。
      3. 进行 cOFM 样本的下游分析，或将其置于 -80 °C 冰箱中长期保存。
    2. 循环式取样：
      1. 保持拉液管连接在 cOFM 取样插件出口（较短轴段），从其余装置上分离，并将管路和取样插件放入新的洁净微量离心管中。
      2. 将无菌 18G 针头连接至 1 mL 至 5 mL 无菌注射器，并吸入空气。
      3. 小心地将针头插入拉液管输入端的带法兰管路连接件中。
      4. 确保 cOFM 取样插件保持在微量离心管内，推动注射器活塞，用空气将循环的 cOFM 样本从拉液管中排出。确保整个 cOFM 样本完全从拉液管排出并进入微量离心管中；必要时可拔下注射器并重新吸入空气继续操作。
      5. 将循环式 cOFM 样本置于冰上用于短期运输。
      6. 进行下游分析，或将其置于 -80 °C 冰箱中长期保存。
  8. 若需在同一只动物中重复进行 cOFM 取样，储存 cOFM 耗材：
    ​注：制造商不建议重复使用 cOFM 一次性耗材，如取样插件和进出管路。
    1. 以不超过 10 µL/min 的流速，用约 500 µL 无菌 aCSF 或生理盐水冲洗 cOFM 推拉管路。随后用 1–2 mL 70% 乙醇进行类似冲洗。最后，使用配备 18G 针头和带法兰管路连接件的 5 或 10 mL 注射器，用空气将管路吹干。
    2. 使用配备带法兰管路连接件的气密玻璃注射器，用 50 µL 无菌 aCSF 或生理盐水冲洗 cOFM 取样插件的进、出口管路。随后用 50 µL 70% 乙醇冲洗。将 cOFM 取样插件从管路连接件上拆下，并储存在装有 70% 乙醇的瓶中，直至准备再次使用。

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结果

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根据基础病理学特征和实验动物模型的具体性质，可在实验的中间阶段或最终阶段进行多种评估性测量，以确定实验是否成功。针对胶质母细胞瘤（GBM）生物学的研究，生物发光成像（BLI）可作为中间评估指标，用于评估cOFM导引介导的肿瘤细胞移植效果（图4A）。然而，由于植入的头部固定装置的物理特性可能在不同动物间比较肿瘤大小时削弱检测到的发光强度，因此该方法仅适用于简单的二分法评估，即判断肿瘤是否存在。

如前所述，脑部开放流动微透析（cOFM）能够广泛采集不同大小的脑间质液（ISF）可溶性分子，范围涵盖从小分子代谢物到大分子蛋白质。实验比较可在同一动物体内（例如：处理前 versus 处理后）或不同动物之间（处理组 versus 未处理组）进行。液相色谱联用质谱法（LC-MS）可用于分析cOFM采集的ISF中的代谢组和蛋白质组成分。对cOFM样本进行的蛋白质组主成分分析显示，经TMZ或DMSO处理的动物重复样本呈现出清晰分离的聚类分组（图4B）。在分析cOFM来源的LC-MS...

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讨论

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本方案中描述的脑部开放式微透析（cOFM）操作有望通过纵向采集病变组织间质液（ISF）内源性成分，从而革新中枢神经系统疾病的研究。然而，该方法的研究成功依赖于若干关键步骤的正确实施。其中，cOFM引导套管的准确且稳固植入尤为关键。不当的手术操作或固定策略可能导致整个颅骨固定装置脱落，进而使动物退出后续研究。整个颅骨固定装置的移位通常源于锚定螺钉安装不充分或粘固剂使用不当。钻头直径应介于锚定螺钉内径与外径之间，以确保螺钉在骨孔中适配良好，并达到足够的螺钉深度以牢固固定。粘固剂或自酸蚀牙科粘合剂使用不当，或使用过期试剂，也可能导致颅骨固定装置与颅骨之间的粘附力不足。在涂抹粘固剂前更彻底地清除多余的自酸蚀牙科粘合剂，并在应用粘固剂前将颅骨表面充分干燥，亦可增强颅骨固定装置与颅骨之间的结合强度。

不牢固的头戴式组件也可能对慢性脑开放灌流微透析（cOFM）取样过程产生负面影响。对术后植入的cOFM导向套管外部组件进行操作，可能导致套管尖端在脑内发生轻微的角度偏移，从而对邻近尖端的微小血管造成虽轻微但显著的损伤。这可能导致血脑屏障（BBB）完整性受损，并使脑组织间液（ISF）可能被血液成分污染...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由美国国家神经疾病与卒中研究所资助，资助编号为1R01NS096376、1R01NS112856以及P50CA221747 SPORE脑癌转化研究项目（A.U.A.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.7 mm 钻头Fine Science Tools19008-07钻孔
1 至 5 mL 注射器BD#309646回收灌注液样本采集
18 G 针头BD#305195回收灌注液样本采集
30G 针头BD Ultra-Fine328438刺破硬脑膜
4-0 Vicryl 缝合线Dynarex9130手术切口缝合
酒精棉片FisherBrand22-363-750手术部位皮肤消毒
固定螺钉BASiMD-1310cOFM 头部固定装置安装
人工脑脊液 (aCSF)BASi (Joanneum)MD-2400脑间质液取样
cOFM 假插件BASi (Joanneum)cOFM-D-#cOFM 头部固定装置安装
cOFM 导向套管BASi (Joanneum)cOFM-GD-#-#cOFM 头部固定装置安装
cOFM 导向套管固定器BASi (Joanneum)OFM-STM-1cOFM 头部固定装置安装
cOFM 灌注插件BASi (Joanneum)cOFM-I-#细胞注射
cOFM 锁紧楔块BASi (Joanneum)cOFM-LOCKcOFM 头部固定装置安装
cOFM 取样插件BASi (Joanneum)cOFM-S-X脑间质液取样
棉签FisherBrane22363160液体吸收、涂抹过氧化氢
CT2A 小鼠胶质瘤细胞系Seyfried Lab - Boston UniversityNA移植肿瘤细胞
牙科粘固剂IvoClar595953UScOFM 头部固定装置安装
牙科光固化灯Henry Schein5700253cOFM 头部固定装置安装
脱毛膏Veet3116875手术部位脱毛
电动剃须刀Wahl Clipper Corp. 8841手术部位脱毛
精细尖头镊子Fine Science Tools5SF切口、固定螺钉放置
带法兰管接头BASi (Joanneum)MD-1510细胞注射
分段收集小瓶BASi (Joanneum)MF-5281分段样本储存
气密玻璃注射器 (25 μL)Hamilton80465细胞注射
过氧化氢 (1-3%)WalgreensNDC: 0363-0268-32颅骨表面清洁
胰岛素注射器 (0.3 至 1.0 mL)，配 31G 针头BD Ultra-Fine328438麻醉药和镇痛药给药
微量离心管Basix02-682-002回收灌注液样本采集
微型钻机及立体定位固定装置Harvard Apparatus75-1874钻孔
小鼠外套LomirMJ 02动物与旋转笼系统的连接
OFM 低吸附管路BASi (Joanneum)OFM-PP2-100-LB脑间质液取样
OFM-Pump - 微灌注泵BASi (Joanneum)MPP102-PC脑间质液取样
眼科软膏Dechra211-38围手术期眼部润滑
钝化金属取样针BASi (Joanneum)MW-2310分段样本储存
灌注液袋BASi (Joanneum)OFM-BAG脑间质液取样
生理盐水溶液ICU Medical 0990-7983-03颅骨表面清洁、辅助钻孔
聚维酮碘棉签PDI HealthcareSKU B40600手术部位皮肤消毒
探针固定器Stoelting51633
冷藏式分段收集器BASi (Joanneum)MD-1201分段样本储存
旋转笼系统BASi (Joanneum)AMD-R Raturn清醒状态下 cOFM 取样的自动化饲养系统
手术刀片及刀柄Fisher Scientific 22079693切口
螺丝刀cOFM 头部固定装置安装
自酸蚀牙科粘接剂 Tokuyama为粘固剂使用前对颅骨表面进行预处理
用于收集小瓶的硅胶推盖BASi (Joanneum)MF-5283分段样本储存
立体定位仪Stoelting51725

参考文献

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