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利用脑部开放流式微透析技术在胶质母细胞瘤动物模型中纵向采集间质液

DOI：

10.3791/68748

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2025年12月23日

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1Department of Neurological Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

本文内容

摘要

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体内，许多中枢神经系统疾病（如胶质母细胞瘤，GBM）所涉及的细胞间通讯极难进行测量和表征。本文介绍了脑部开放流动微透析（cOFM）的操作流程，该方法可用于在GBM的纵向动物模型中采集间质液成分。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

中枢神经系统（CNS）疾病通过复杂的动态细胞间通讯网络表现出来。胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤，是这种复杂性的典型代表，其病程进展迅速，预后极差，生存期通常以月计而非以年计。GBM 的生物学行为由肿瘤细胞与基质细胞之间复杂的信号分子交换所驱动，从而促进疾病的侵袭性进展。本文介绍了一种在 GBM 小鼠模型中应用的详细的大脑开放流动微透析（cOFM）操作流程，可实现对肿瘤微环境中间质液（ISF）动态变化的实时、纵向监测。本方法包括植入耐用的导管套管头固定装置，通过该导管直接进行颅内胶质瘤移植，以及采集高质量的 cOFM 样本用于代谢组学和蛋白质组学的液相色谱-质谱（LC-MS）分析。尤为重要的是，cOFM 克服了传统微透析在分子尺寸上的局限性。除 GBM 外，cOFM 技术还有望通过在其相应的动物模型中提供病因学及治疗响应性生物标志物，为一系列中枢神经系统疾病（包括神经退行性疾病、癫痫及神经精神疾病）带来突破性的研究见解。

引言

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由于脑脊液（ISF）介导的复杂且多模式的细胞间信号传导，研究中枢神经系统（CNS）疾病极具挑战性1,2,3,4。这种复杂性在胶质母细胞瘤（GBM）等脑肿瘤中尤为显著，其中细胞间信号在肿瘤细胞和基质细胞之间传递5,6,7,8,9。在许多情况下，多种生物分子（包括代谢物和蛋白质类信使）的异常交换促进了中枢神经系统疾病的发病机制。这一研究难题在GBM中尤为突出，因为ISF的分子组成具有时间动态性，并随着疾病进展以及干预性治疗的实施而不断演变10,11。

传统的胶质母细胞瘤临床前研究方法包括 体外 研究和单终点动物模型。这些方法由于无法同时捕捉肿瘤微环境的特征以及时间上的纵向....

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方案

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本方案中的所有动物实验程序均已获得西北大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（方案编号：IS00021383），并遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南。本方案适用于8至10周龄及以上、雌雄皆可的C57BL/6J小鼠。本方案中使用的小鼠胶质瘤细胞系CT2A由波士顿大学Seyfried实验室提供，并在无菌组织培养条件下进行培养和制备。

1. 手术规划与准备

  1. 动物信息：进行cOFM实验时，应使用至少8至10周龄的小鼠，以确保其生长和发育完全。在仍在发育的颅骨和/或大脑中，固定位置的颅骨植入物可能会移位或影响正常生长。
  2. 手术坐标的选取：使用动物脑图谱确定目标区域相对于前囟的正交坐标。例如，胶质瘤细胞植入通常选择在纹状体进行，以最大程度地模拟原发性胶质母细胞瘤（GBM）的微环境，并提高后续肿瘤发育的效率。本方案中使用的cOFM引导植入坐标为：内侧-外侧（ML）= 2.5 mm，前-后（AP）= 0 mm，背-腹（DV）= 3.5 mm。
    注意：立体定位坐标可能因小鼠品系和年龄不同而有所差异。请使用针对特定物种和品系的脑图谱坐标，以确保cOFM引导装置的准确放置。
  3. cOFM组件配置的适当选择：订购适用于特定总长度（范围从2 mm至22 mm）、开放表面长度为1 mm至2 mm的cOFM适当配置组件。
    ​注意：动物在进行理毛行为时可能会使植入不当的cOFM引导头帽发生移位。为尽....

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结果

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根据基础病理学特征和实验动物模型的具体性质，可在实验的中间阶段或最终阶段进行多种评估性测量，以确定实验是否成功。针对胶质母细胞瘤（GBM）生物学的研究，生物发光成像（BLI）可作为中间评估指标，用于评估cOFM导引介导的肿瘤细胞移植效果（图4A）。然而，由于植入的头部固定装置的物理特性可能在不同动物间比较肿瘤大小时削弱检测到的发光强度，因此该方法仅适用于简单的二分法评估，即判断肿瘤是否存在。

如前所述，脑部开放流动微透析（cOFM）能够广泛采集不同大小的脑间质液（ISF）可溶性分子，范围涵盖从小分子代谢物到大分子蛋白质。实验比较可在同一动物体内（例如：处理前 versus 处理后）或不同动物之间（处理组 versus 未处理组）进行。液相色谱联用质谱法（LC-MS）可用于分析cOFM采集的ISF中的代谢组和蛋白质组成分。对cOFM样本进行的蛋白质组主成分分析显示，经TMZ或DMSO处理的动物重复样本呈现出清晰分离的聚类分组（图4B）。在分析cOFM来源的LC-MS.......

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讨论

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本方案中描述的脑部开放式微透析（cOFM）操作有望通过纵向采集病变组织间质液（ISF）内源性成分，从而革新中枢神经系统疾病的研究。然而，该方法的研究成功依赖于若干关键步骤的正确实施。其中，cOFM引导套管的准确且稳固植入尤为关键。不当的手术操作或固定策略可能导致整个颅骨固定装置脱落，进而使动物退出后续研究。整个颅骨固定装置的移位通常源于锚定螺钉安装不充分或粘固剂使用不当。钻头直径应介于锚定螺钉内径与外径之间，以确保螺钉在骨孔中适配良好，并达到足够的螺钉深度以牢固固定。粘固剂或自酸蚀牙科粘合剂使用不当，或使用过期试剂，也可能导致颅骨固定装置与颅骨之间的粘附力不足。在涂抹粘固剂前更彻底地清除多余的自酸蚀牙科粘合剂，并在应用粘固剂前将颅骨表面充分干燥，亦可增强颅骨固定装置与颅骨之间的结合强度。

不牢固的头戴式组件也可能对慢性脑开放灌流微透析（cOFM）取样过程产生负面影响。对术后植入的cOFM导向套管外部组件进行操作，可能导致套管尖端在脑内发生轻微的角度偏移，从而对邻近尖端的微小血管造成虽轻微但显著的损伤。这可能导致血脑屏障（BBB）完整性受损，并使脑组织间液（ISF）可能被血液成分污染.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作由美国国家神经疾病与卒中研究所资助，资助编号为1R01NS096376、1R01NS112856以及P50CA221747 SPORE脑癌转化研究项目（A.U.A.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.7 mm 钻头Fine Science Tools19008-07钻孔
1 至 5 mL 注射器BD#309646回收灌注液样本采集
18 G 针头BD#305195回收灌注液样本采集
30G 针头BD Ultra-Fine328438刺破硬脑膜
4-0 Vicryl 缝合线Dynarex9130手术切口缝合
酒精棉片FisherBrand22-363-750手术部位皮肤消毒
固定螺钉BASiMD-1310cOFM 头部固定装置安装
人工脑脊液 (aCSF)BASi (Joanneum)MD-2400脑间质液取样
cOFM 假插件BASi (Joanneum)cOFM-D-#cOFM 头部固定装置安装
cOFM 导向套管BASi (Joanneum)cOFM-GD-#-#cOFM 头部固定装置安装
cOFM 导向套管固定器BASi (Joanneum)OFM-STM-1cOFM 头部固定装置安装
cOFM 灌注插件BASi (Joanneum)cOFM-I-#细胞注射
cOFM 锁紧楔块BASi (Joanneum)cOFM-LOCKcOFM 头部固定装置安装
cOFM 取样插件BASi (Joanneum)cOFM-S-X脑间质液取样
棉签FisherBrane22363160液体吸收、涂抹过氧化氢
CT2A 小鼠胶质瘤细胞系Seyfried Lab - Boston UniversityNA移植肿瘤细胞
牙科粘固剂IvoClar595953UScOFM 头部固定装置安装
牙科光固化灯Henry Schein5700253cOFM 头部固定装置安装
脱毛膏Veet3116875手术部位脱毛
电动剃须刀Wahl Clipper Corp. 8841手术部位脱毛
精细尖头镊子Fine Science Tools5SF切口、固定螺钉放置
带法兰管接头BASi (Joanneum)MD-1510细胞注射
分段收集小瓶BASi (Joanneum)MF-5281分段样本储存
气密玻璃注射器 (25 μL)Hamilton80465细胞注射
过氧化氢 (1-3%)WalgreensNDC: 0363-0268-32颅骨表面清洁
胰岛素注射器 (0.3 至 1.0 mL)，配 31G 针头BD Ultra-Fine328438麻醉药和镇痛药给药
微量离心管Basix02-682-002回收灌注液样本采集
微型钻机及立体定位固定装置Harvard Apparatus75-1874钻孔
小鼠外套LomirMJ 02动物与旋转笼系统的连接
OFM 低吸附管路BASi (Joanneum)OFM-PP2-100-LB脑间质液取样
OFM-Pump - 微灌注泵BASi (Joanneum)MPP102-PC脑间质液取样
眼科软膏Dechra211-38围手术期眼部润滑
钝化金属取样针BASi (Joanneum)MW-2310分段样本储存
灌注液袋BASi (Joanneum)OFM-BAG脑间质液取样
生理盐水溶液ICU Medical 0990-7983-03颅骨表面清洁、辅助钻孔
聚维酮碘棉签PDI HealthcareSKU B40600手术部位皮肤消毒
探针固定器Stoelting51633
冷藏式分段收集器BASi (Joanneum)MD-1201分段样本储存
旋转笼系统BASi (Joanneum)AMD-R Raturn清醒状态下 cOFM 取样的自动化饲养系统
手术刀片及刀柄Fisher Scientific 22079693切口
螺丝刀cOFM 头部固定装置安装
自酸蚀牙科粘接剂 Tokuyama为粘固剂使用前对颅骨表面进行预处理
用于收集小瓶的硅胶推盖BASi (Joanneum)MF-5283分段样本储存
立体定位仪Stoelting51725

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shetty, A. K., Zanirati, G. The interstitial system of the brain in health and disease. Aging Dis. 11 (1), 200-211 (2020).
  2. Taoka, T., et al. Interstitial fluidopathy of the central nervous system: An umbrella term for disorde....

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