一种用于研究异种移植中急性细胞和抗体介导排斥反应的标准化小鼠模型及三人工作流程

摘要

本研究建立了两种标准化的小鼠异种移植模型，可特异性地模拟急性细胞性排斥反应和急性抗体介导的排斥反应。这些模型为研究移植物免疫排斥机制、评估免疫抑制策略以及推进异种移植的临床前研究提供了可靠的平台。

摘要

尽管异种移植领域已取得近期进展，但急性排斥反应仍是其临床应用的主要障碍。急性细胞排斥反应（ACR）和急性抗体介导的排斥反应（AMR）是导致异种移植物受体早期移植物失功的主要免疫应答。虽然非人灵长类动物和基因修饰猪等大动物模型已提供了有价值的见解，但其应用受到高成本、伦理限制以及显著实验变异性的制约。小动物模型为研究免疫排斥的机制提供了实用且可重复的替代方案。本研究建立了两种标准化的小鼠异种移植模型，专门用于模拟ACR和AMR。为确保可重复性并最小化操作者相关的变异性，采用了结构化的三人手术流程，并结合流水线式工作模式，从而高效、高质量地稳定生成模型。所建立的模型不仅重现了临床异种移植物排斥反应的关键免疫病理特征，还为研究免疫机制及评估靶向性免疫抑制策略提供了可靠的平台。这些模型将有助于加速异种移植疗法的临床前研发进程。

引言

异种移植已成为解决移植供体器官短缺问题最有前景的策略之一。近年来，基因编辑技术、免疫调控策略和生物医学工程的快速发展推动了该领域的显著进展¹。在过去三年中，全球多个研究团队已开展涉及人类异种移植的临床试验，包括马里兰大学进行的两例基因修饰猪心脏移植、麻省总医院开展的猪肾脏移植试验，以及纽约大学开展的胸腺肾移植试验^2,3,4,5。尽管取得了这些前所未有的进展，免疫排斥仍是限制异种移植临床应用的主要挑战。即使采用高度优化的基因修饰供体器官并联合使用免疫抑制方案，排斥反应仍是一个重大障碍。目前研究表明，急性排斥反应是异种移植中的关键难题，主要分为急性细胞性排斥反应（ACR）和急性抗体介导的排斥反应（AMR）。ACR主要由T细胞介导，其特征是大量T细胞浸润移植物，导致组织损伤和功能障碍。其潜在机制涉及异种抗原呈递、T细胞活化以及炎症性细胞因子的释放^6,7。相比之下，AMR由预先存在或新生成的供体特异性抗体驱动。这些抗体结合移植物内的内皮细胞，触发补体激活和强烈的免疫反应，最终导致微血管损伤、血栓形成和移植物失功^8,9,10。因此，深入理解这些排斥机制，并开发更精确的免疫调控策略，对于推动异种移植从临床前研究迈向长期临床应用至关重要。

为应对异种移植中急性排斥反应的挑战，必须回归基础研究和临床前研究，以阐明其潜在的免疫学机制。由于在解剖学和生理学上与人类高度相似，大型动物模型，尤其是非人灵长类动物（NHPs）和基因修饰猪，已被广泛应用于异种移植研究。这些模型为理解免疫排斥机制和免疫调节策略提供了关键见解。然而，其应用受到高昂成本、伦理考量以及术后长期护理复杂性的显著限制。此外，个体NHP之间免疫反应的显著差异影响了实验结果的可重复性^11,12,13。尽管大型动物模型在临床转化中仍不可或缺，但其在实验可行性和一致性方面的局限性凸显了迫切需要开发更具成本效益、可扩展且机制上更相关的啮齿类动物模型。

鉴于这些挑战，小型动物模型由于成本低、实验周期短且易于大规模应用，在异种移植研究中日益重要。这些模型不仅为研究免疫排斥机制提供了重要平台，而且成为连接基础研究与临床应用的关键桥梁。 体外 研究和大型动物实验，促进对免疫调节策略的更精确探索。本研究建立了两种标准化的小鼠异种移植模型，分别特异性模拟急性细胞性排斥反应（ACR）和急性抗体介导的排斥反应（AMR）。为确保可重复性和一致性，采用了标准化的三人手术方案，并实施了简化的流水线式建模流程。该标准化工作流程最大限度地减少了操作者依赖性变异，从而获得高度均一的心脏移植模型。这些优化为机制研究及新型免疫抑制策略的评估提供了可靠的平台。本方案特别适用于开展异种移植免疫机制研究及免疫抑制策略评估的小动物实验研究人员，具有成本低、可重复性高和流程标准化等优势，为后续的大型动物实验和临床前研究提供了可靠的实验基础。

方案

该方案可由单名操作者完成，也可由三人团队协作完成，团队成员分别负责供体心脏的摘取、受体准备以及供体心脏的吻合。整个手术过程在10分钟内完成，可实现快速、高通量且标准化的模型制备。

本研究中的动物实验已获得中国医学科学院阜外医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（批准号：0108-1-70-ZX(X)-41）。所有操作均严格遵守动物福利法规和伦理准则，以确保符合相关标准。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 术前准备

1. 套管制备
   1. 使用聚酰亚胺管材制备移植手术用套管。动脉套管选用内径为0.3–0.5 mm的聚酰亚胺管材，在体视显微镜（10×–20×放大倍数）下将其切割成2 mm长的节段。
   2. 将每一段的夹持部分沿圆周方向半切开，形成类似手柄的延伸结构。静脉套管则选用内径为0.4–0.7 mm的聚酰亚胺管材，切割成3 mm长的节段。同样地，将夹持部分沿圆周方向半切开，形成类似手柄的延伸结构。
      注意：将套管浸泡于75%乙醇中30分钟，随后用生理盐水充分冲洗。
2. 小鼠准备：以10–12日龄的新生Sprague-Dawley（SD）大鼠作为供体，7–8周龄的C57BL/6或Balb/c小鼠作为受体。为确保适当的护理并减少应激，供体新生大鼠应与母鼠一同运输。所有动物均饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中。

2. 供体心脏的获取

1. 固定与麻醉
   1. 按照机构批准的方案，通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合物对新生大鼠进行麻醉，例如氯胺酮剂量为80–100 mg/kg，赛拉嗪剂量为5–10 mg/kg。使用无菌生理盐水作为溶剂，通过皮下注射给予美洛昔康（5 mg/kg）以提供术前镇痛。在开始手术操作前，通过确认反射反应消失来判断麻醉是否充分。
   2. 待大鼠完全麻醉后，将其置于仰卧位，并固定在体视显微镜下。清除胸腹部手术区域的毛发，采用聚维酮碘或氯己定类消毒液与酒精交替擦拭三次的方式进行无菌准备。在供体心脏获取过程中，使用无菌手套、无菌器械和无菌手术单以维持无菌环境。
      注意：在通风良好的区域操作三溴乙醇时需佩戴手套和护目镜；避免皮肤接触和吸入。
2. 肝素化
   1. 使用浸有聚维酮碘的棉球对胸腹部区域进行消毒。用棉签轻轻拨开肠道，暴露下腔静脉。
   2. 使用胰岛素注射器将肝素化生理盐水（0.2–0.5 mL）注入下腔静脉，随后用棉球轻压注射部位以防止出血。
      注意：配制或注射肝素化生理盐水时应佩戴手套和护目镜；注射器应作为锐器废弃物处理。肝素化生理盐水的配制方法为：将一支医用级钠盐肝素（125 mg）溶解于100 mL生理盐水中。
3. 心脏停搏
   1. 切开膈肌，双侧剪开胸壁并牵开，充分暴露心脏。移除胸腺。切断上腔静脉以释放压力，并将1 mL威斯康星大学（UW）溶液经主动脉灌注，以诱导心脏停搏。
   2. 持续灌注直至心脏颜色由红转白。同时，将一块浸有冰冻生理盐水的纱布覆盖于心脏表面，以降低温度并防止脱水。
      注意：将无菌纱布剪成1 cm × 1 cm的小块，并在使用前预先浸泡于冰冻生理盐水中。
4. 供体心脏的获取
   1. 使用8-0丝线结扎上腔静脉和下腔静脉，随后将其切断。在主动脉弓处切断主动脉，并在肺动脉分叉处切断肺动脉。
   2. 最后，使用8-0丝线结扎所有肺静脉，并切除供体心脏。将获取的心脏暂时保存于冰冻生理盐水中以维持活性。

3. 受体准备

注意：所有手术均使用无菌外科手套和灭菌的显微外科器械进行。在不同动物或不同操作之间，器械通过高压灭菌或使用玻璃珠灭菌器快速灭菌后方可再次使用。术者根据无菌技术要求定期更换手套，一旦手套被污染或接触非无菌区域，则立即更换。

1. 麻醉
   1. 采用相同方法麻醉受体小鼠，并将其置于仰卧位以固定。
2. 消毒
   1. 使用脱毛膏去除颈部区域的毛发。然后使用聚维酮碘或氯己定类消毒液与酒精交替进行三次擦洗，完成无菌皮肤准备。在手术区域覆盖无菌手术巾以维持无菌环境，并在手术过程中保持缝合材料和供体心脏的无菌状态。
3. 皮肤切口
   1. 使用眼科剪在颈部中线右侧约1 cm处做一条长约2 cm的纵向切口。进行钝性分离，逐步去除皮下脂肪和肌肉层，并切除下颌下腺。
      注意：切除下颌下腺时，应使用8–0丝线结扎或电凝笔电凝其基底部血管，以防出血。
4. 颈外静脉准备
   1. 暴露颈外静脉后，将电凝笔调至低凝固模式（5–10 W），逐一电凝其分支。在静脉远端附近放置两根8-0丝线，用于结扎。
   2. 使用显微外科剪在两根结扎线之间横断颈外静脉。将颈外静脉穿过静脉套管，推动套管至静脉根部，并用血管夹固定。
   3. 使用显微外科剪去除结扎线，并用肝素化生理盐水冲洗静脉内残留血液。使用显微外科镊将颈外静脉外翻覆盖于套管上，并用8-0丝线固定。
      注意：操作电凝笔时应谨慎，避免造成灼伤。颈外静脉具有多个属支，应仔细分离并封闭，以尽量减少出血。
5. 颈总动脉准备
   1. 在胸锁乳突肌后方进行钝性分离，以定位颈动脉鞘。打开颈动脉鞘，小心地将颈总动脉与颈内静脉和迷走神经分离。
   2. 以与静脉相同的方式结扎并横断动脉。将横断后的动脉远端穿过动脉套管，外翻并固定于套管上。
      ​注意：颈总动脉、颈内静脉和迷走神经均包被于颈动脉鞘内。打开鞘膜时应注意避免损伤迷走神经。颈总动脉直径较颈外静脉小，但弹性更强，因此外翻操作比静脉更具挑战性。

4. 供体心脏吻合

1. 主动脉-颈动脉吻合
   1. 修剪供体心脏后，立即将其置于受体小鼠颈部。使用带松结的8-0丝线在供体主动脉周围打一个环状结。
   2. 将供体主动脉套入受体颈动脉上的动脉套环，并用8-0丝线结扎固定。
      注意：结扎固定主动脉时，缝线应扎在颈动脉结扎线的上方，以防止结扎部位与受体血液直接接触。
2. 肺动脉-颈外静脉吻合
   1. 使用带松结的8-0丝线在供体肺动脉周围打一个环状结。将肺动脉套入受体颈外静脉上的静脉套环，并用8-0丝线结扎固定。
3. 心脏复搏
   1. 松开受体颈动脉和颈外静脉上的血管夹，恢复血流。观察到供体心脏在10秒内恢复有力的收缩，并迅速变为红色。
4. 切口闭合
   1. 当供体心脏恢复稳定节律后，调整其位置，并用4-0单股缝线缝合受体颈部的皮肤切口。使用聚维酮碘对术区进行消毒。

5. 术后护理

1. 术后镇痛
   1. 根据机构批准的方案，通过皮下注射将美洛昔康以 5 mg/kg 的剂量溶于无菌生理盐水中，用于维持术后镇痛。
2. 恢复
   1. 将小鼠置于维持在 37–38 °C 的温暖软垫上，以保持体温，并持续监测直至其恢复意识。完全清醒后，将小鼠单独饲养于笼中，确保其能够充分获取食物和饮水。
3. 监测
   1. 通过肉眼观察和触诊每日监测移植心脏的搏动情况及移植物整体存活状态。
      ​注意：所有操作均需穿戴适当的个人防护装备，并遵守机构的生物安全和动物护理规定。实验过程中产生的所有化学残留物、灌注液及动物组织应按照机构规定收集并妥善处理。含三溴乙醇或肝素的溶液应作为危险化学废物处理，而动物组织及血液来源材料应作为生物废物处理，并通过高压灭菌或交由认证机构进行处置。

结果

图1 展示了用于构建小鼠异种移植模型的标准化三人协作工作流程。在此系统中，三名操作者并行工作，各自重复执行指定的任务：受体准备、供体心脏获取或供体心脏吻合。这种分工使得每10分钟即可完成一个完整的移植模型。虽然单名操作者完成一个模型约需30分钟，但三人协作流程可在相同时间内完成三个模型。尽管效率看似相当，但协作流程通过减少个体手术技术带来的差异，显著提高了操作的一致性。相比之下，当三名外科医生各自独立完成全部手术步骤时，操作者间的差异会显著影响模型的质量和可重复性。这种流程化、任务专一的方法增强了手术的稳定性，支持小鼠异种移植模型的大规模、标准化生产。

表1展示了三人组与单人组工作流程在外科手术效率和成功率方面的比较结果。尽管各个步骤的持续时间没有显著差异，但三人组工作流程能够同时进行供体心脏的获取和受体准备，从而显著缩短了整体手术时间和麻醉时间。三人组的平均成功率为93.3%，而单人组为86.7%，表明该工作流程在提高模型性能和操作稳定性方面具有明显优势。

讨论

小鼠异种移植是一种高度侵入性的操作，要求操作者具备高超的技术熟练度和操作一致性。在模型建立过程中，操作者对实验结果具有显著影响^14,15。在单人操作流程中，由于操作步骤复杂且耗时较长，每个模型的手术时间约为30分钟，导致效率低下。此外，操作者在解剖分离、血管处理和吻合技术方面的个体差异可能导致移植成功率和移植物存活率的波动，从而影响数据的可重复性和可靠性。即使由三名操作者各自独立完成全部手术流程，个人技术与经验的差异仍可能引入不可避免的实验误差。为解决这一问题，采用了三人协作的操作流程，每位操作者仅专注于特定步骤：供体心脏获取、受体准备或供体心脏吻合。这种分工将整个手术时间缩短至约10分钟，显著提高了操作效率。同时，由于每位操作者反复执行相同的步骤，操作的准确性和一致性得以提升，最大限度地减少了操作者依赖性变异，确保了模型的标准化与可重复性。

在整个实验过程中，影响模型成功的关键步骤包括套管的制备以及血管外翻至套管上。套管的大小、光滑度和完整性直接决定了吻合的难易程...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗CD3抗体	Abcam	ab16669
抗CD68抗体	Bioss	bs-1432R
DAPI	Thermofisher	P36971
脱毛膏	Veet	-
电灼笔	Yuyan Instrument	-
荧光二抗	Thermofisher	A-11008
HE染色试剂盒	Beyotime	C0105S
制冰机	Shjingmi	IMS-20
胰岛素注射器	KDL	U-40
利多卡因凝胶	Tide Pharm
美洛昔康	Sigma-Aldrich	444800
显微外科镊子	ZHENHAO	FS217
显微外科持针器	BIOFIVEN	HH01231
显微外科剪刀	ZHENHAO	FS237
生理盐水	科伦药业	-
聚酰亚胺管	广州万利鑫金属制品有限公司	-	内径：0.3-0.5 mm
聚酰亚胺管	广州万利鑫金属制品有限公司	-	内径：0.4-0.7 mm
聚维酮碘溶液	INOHV	-
肝素钠	千红制药	-
体视显微镜	Murzider	MSD204
外科缝合线	金环医疗	8-0 和 4-0 丝线
手术加热垫	Hani Pet	-
三溴乙醇	Jitianbio	JT0781
威斯康星大学溶液	Belzer	-
血管夹	RWD Life	R31005-10