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研究文章

牛磺熊去氧胆酸在蓝狐胆汁中对小鼠急性酒精性肝损伤的作用及机制

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DOI：

10.3791/68763

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2025年10月17日

 ,  , 
1School of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine

本文内容

摘要

本研究评估了蓝狐胆汁对小鼠酒精性肝损伤的保肝作用。蓝狐胆汁含有牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）、熊去氧胆酸（UDCA）、胆红素和牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA），可降低肝损伤标志物水平，并通过AGE-RAGE通路、AKT1和PPARG发挥作用，表现出抗炎和抗氧化特性。

摘要

动物胆汁（如熊胆）在传统医学中因其治疗功效已被长期使用。蓝狐胆汁与熊胆类似，在某些传统实践中被认为具有保肝作用。本研究探讨了蓝狐胆汁在小鼠酒精性肝损伤中的成分及其作用。研究从30只蓝狐中采集胆汁，并加工成干燥粉末。采用高效液相色谱法和超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术分析蓝狐胆汁的化学成分。利用网络药理学方法鉴定与酒精性肝损伤相关的潜在生物活性成分、作用靶点及信号通路。采用昆明小鼠建立酒精性肝损伤动物模型，并分别给予低剂量和高剂量的蓝狐胆汁粉末干预。检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和总胆固醇水平。通过苏木精-伊红染色和丙二醛（MDA）测定法评估肝脏组织病理变化。通过分子对接分析预测活性成分与核心靶点之间的结合亲和力。研究发现，蓝狐胆汁中含有牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）、熊去氧胆酸、胆红素和牛磺鹅去氧胆酸。组织病理学分析显示，口服蓝狐胆汁粉末后，主要器官未见明显异常或毒性反应。蓝狐胆汁的核心靶点包括蛋白AKT1、PPARG、IGF1、MMP9和CASP3。在酒精性肝损伤小鼠模型中，蓝狐胆汁治疗可降低血清ALT、AST、胆固醇及MDA水平。网络药理学与分子对接结果提示，蓝狐胆汁的保肝作用可能与晚期糖基化终末产物及其受体（AGE-RAGE）信号通路相关。总体而言，蓝狐胆汁含有与熊胆相似的TUDCA成分，可作用于AKT1和PPARG等蛋白，在酒精性肝损伤的防治中表现出潜在的抗炎与抗氧化作用。

引言

酒精相关性肝病（ALD）涵盖一系列肝脏损伤，其严重程度从无症状的实验室检查异常到伴有肝硬化的晚期肝病不等，最严重的形式可表现为危及生命的终末期肝病，并伴随多器官功能衰竭1。ALD 的患病率包括酒精相关性脂肪性肝病，后者属于相对较轻且可能可逆的 ALD 形式1。酒精性肝炎以炎症为特征，临床表现从无症状的脂肪性肝炎到急性酒精性肝炎不等，后者表现为急性黄疸，可进展为肝衰竭，短期死亡率较高1。酒精及其代谢产物通过多种机制改变脂质代谢并促进脂质积聚（脂肪变性），包括抑制线粒体脂肪酸β-氧化以及刺激脂肪生成2。乙醇上调转铁蛋白受体1的表达，从而增加肝脏对铁的摄取2。酒精和乙醛均可直接损伤肝细胞，导致氧化应激增加、S-腺苷甲硫氨酸再生受抑、损伤相关分子模式（DAMPs）释放、门脉循环中暴露于细菌内毒素以及蛋白质加合物的形成2。由于涉及多种致病通路，ALD 的治疗仍具挑战性3。目前正在研究的未来治疗策略包括经验性使用益生菌、生长因子、抗氧化剂、靶向炎症相关因子的单克隆抗体以及技术增强的行为干预措施。然而，仍需探索更多全面的治疗策略。

越来越多的证据表明，由于动物胆汁具有抗炎和抗氧化特性，其在治疗酒精相关性肝病（ALD）方面可能具有潜在疗效4,5。动物胆汁是传统中医药（TCM）的重要组成部分6。在中医药中，动物胆汁被用于增强肝胆功能，并缓解疼痛、发热、咳嗽和炎症，已被应用于包括肝硬化在内的肝病治疗6。动物胆汁具有抗炎和抗氧化特性6，而炎症和氧化应激在ALD的发病机制中起着核心作用7。此外，已有报道称胆汁酸补充可改善肝脂肪变性8。目前，熊胆是最广泛使用的胆汁来源药物，其主要活性成分为熊去氧胆酸（UDCA）和牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）6,9。值得注意的是，TUDCA并不存在于其他动物（如羊、牛、鸡和蛇）的胆汁中6。TUDCA已在治疗急性肝损伤方面显示出潜在疗效10。目前，TUDCA主要通过熊胆引流（存在动物福利争议）、化学合成（成本较高）或通过鸡胆粉生物转化制备类熊胆产品（仍无法完全等同于天然熊胆）获得11,12。蓝狐（Alopex lagopus），又称北极狐，主要被人工饲养以获取其毛皮。中国是全球三大毛皮服装出口国之一，而屠宰后的蓝狐内脏通常被丢弃13。这为将蓝狐胆囊转化为潜在的医用资源提供了机会。蓝狐与熊同属食肉目动物，在消化生理、代谢和饮食方面具有相似性，提示其胆汁成分及作用可能也具有相似性。然而，这一可能性尚未被研究探索。

因此，本研究旨在探讨蓝狐胆汁在酒精性肝病（ALD）模型中的药理作用及其潜在机制。研究结果可能为开发熊胆替代品提供新的研究方向，为利用蓝狐胆囊作为药用资源建立科学依据，将工业废弃物转化为高价值产品，并为未来的治疗开发提供参考。

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方案

本研究方案经黑龙江中医药大学动物实验伦理委员会审查并批准（批准号：2023021101）。所有动物实验均遵循ARRIVE指南（动物研究：体内实验报告指南）以及国家和机构有关实验动物护理与使用的相关指南。由于本研究涉及动物实验，不适用知情同意要求。所有动物繁育和取皮操作均严格遵守《中国野生动物驯养繁殖技术管理规定》。本研究已获得中国黑龙江中医药大学动物实验伦理委员会的批准（批准号：2023021101）。

蓝狐胆汁样品制备
蓝狐胆汁资源见材料表。共采集30只蓝狐（Vulpes lagopus）样本，采用电击法实施安乐死，随后取皮并收集胆囊。蓝狐胆囊呈椭圆形，上部较窄，下部膨大。其外表呈深棕色，可见皱褶，囊膜较薄。使用1 mL无菌一次性注射器立即抽取胆汁，胆汁呈深黑色或深绿色。随后将胆囊于37 °C干燥48 h，获得干燥的蓝狐胆汁粉末（图1）。所得胆汁粉末呈黄褐色，具有光泽且质地脆。每枚胆囊平均获得干燥胆汁粉末约0.82 ± 0.30 g。样品制备时，取250 mg干燥胆汁粉末（来自上述蓝狐或熊，见材料表），溶于1 mL色谱级70%甲醇中。溶液经超声处理（40 kHz，300 W），通过0.22 µm滤膜过滤，定容至50 mL（即浓度为5 mg/mL），再稀释至工作浓度0.5 mg/mL，用于后续分析。整体实验流程见补充图1。

本研究中，基于既往的毒性评估和药理学研究，动物实验所用蓝狐胆汁粉的剂量范围为 5–10 g/kg，在此浓度下未观察到明显不良反应14,15。胆汁粉制备过程中，胆囊在 37 °C 下干燥 48 小时；然而，干燥时间可能因当地湿度和样品体积而异，因此应检测水分含量以确保完全脱水。溶解时，使用色谱级甲醇配制 5 mg/mL 的浓度，适用于 HPLC 和 UPLC-Q-TOF-MS 分析；若溶解不完全或存在颗粒残留，可能影响分析准确性，需进一步超声处理或过滤。一个已知的局限性是，由于蓝狐个体间的季节、饮食及生理差异，胆汁成分存在变异性，这可能影响如牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）和熊去氧胆酸（UDCA）等活性成分的相对含量16。因此，建议在药理学应用前通过色谱图谱进行批次验证，以确保成分谱的一致性。

网络药理学分析
使用高效液相色谱法分析了蓝狐胆汁的化学成分（见 材料表）以及超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS）。高效液相色谱（HPLC）采用SB-C18色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 µm），流动相由0.03 M磷酸二氢钠（用磷酸调节pH至4.4）作为A相，甲醇作为B相（见 材料表）作为相B（表1检测波长设定为210 nm，流动相流速为1.0 mL/min，柱温为40 °C，进样体积为10 µL。UPLC-Q-TOF/MS分析采用UPLCTM HSS T3色谱柱（见 材料清单). 流动相由乙腈（A）-0.1% 甲酸水溶液（B；参见 材料表)。梯度洗脱程序如下：0–25.0 min，98%–2% A；25.0–28.0 min，2%–2% A，流速为4 mL/min。柱温维持在35 °C。质谱分析采用电喷雾离子化源（ESI），参数设置如下：脱溶剂气流速650 L/h，脱溶剂气温度350 °C，锥孔气流速50 L/h，离子源温度120 °C，毛细管电压2.8 kV（正离子模式）和2.0 kV（负离子模式），锥孔电压25 V，碰撞能量6 eV。每0.2 s采集一次谱图，扫描间隔为0.02 s。亮氨酸脑啡肽（见 材料表；[M+H]+=556.2771）用作参考校准溶液，浓度为40 fmol/µL，流速为15 µL/min17.

化学成分分析与靶点预测
采用高效液相色谱法（HPLC）和超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF/MS）鉴定蓝狐胆汁中的活性成分，并以牛磺胆酸和牛磺熊去氧胆酸钠（见材料表）作为内标18。所鉴定化合物的结构式从 PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获取。为探索潜在的生物活性靶点，将蓝狐胆汁的活性成分在 PharmMapper 数据库（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）中进行查询，以识别相关的基因靶点。

以酒精性肝损伤和酒精诱导的肝损伤为关键词，从 GeneCards（https://www.genecards.org/）和 OMIM（https://omim.org/）数据库中获取与疾病相关的基因。在 GeneCards 数据库中，根据相关性评分对靶点进行筛选，阈值设定为 ≥ 20。这一常用的经验证截断值可在敏感性和特异性之间取得平衡，保留大多数潜在相关基因（高召回率），同时过滤掉关联较弱或噪声较高的基因（高精确度）。相比之下，在 OMIM 数据库中未进行额外筛选，因其收录的靶点具有较强的遗传学证据，可补充 GeneCards 的计算相关性评分。将获得的靶点数据合并并去除重复，以确定与酒精性肝病（ALD）相关的靶点。使用 Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）对活性成分靶点与疾病靶点进行比较并可视化。取交集部分作为蓝狐胆汁抗 ALD 的潜在作用靶点，并导入 STRING 数据库（http://version10.string-db.org/）。在 STRING 数据库中，采用默认参数（中等置信度评分 ≥ 0.4）构建相互作用网络，并隐藏游离节点以提高可视化清晰度。通过隐藏游离节点生成蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图，并利用 Cytoscape 软件（版本 3.9.1）进行可视化。进行拓扑学分析以计算各节点的度值，并使用功能注释、可视化与集成发现数据库（DAVID，https://david.ncifcrf.gov/）识别度值最高的六个靶点，显著性阈值设为 p < 0.05。采用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行通路富集分析。

分子对接
采用分子对接方法评估蓝狐胆汁中核心靶点蛋白与生物活性成分之间的相互作用。核心靶点蛋白的三维结构从结构生物信息学研究协作实验室（RCSB）蛋白质数据库（https://www.rcsb.org/）获取，胆汁成分的结构则来自PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）。对接模拟使用Molecular Operating Environment（MOE）软件（版本2022.02）进行。对于AKT1，下载其晶体结构（PDB编号：4EKL），在MOE中进行预处理，包括去除水分子和原始配体、在生理pH值（7.0）条件下添加氢原子并进行质子化，以及能量最小化。配体结构（TUDCA、UDCA、TCDCA、TCA和胆红素）从PubChem获取，并在对接前进行能量最小化。在对接过程中，生成多个配体构象，并将每种构象以不同的空间取向放入受体的结合口袋中。采用诱导契合（Induced Fit）协议进行对接，初始放置使用London dG方法，打分函数采用Affinity dG。每种配体生成30个构象，最终结合构象通过力场优化进行精修。其余所有参数均采用MOE默认设置，未作进一步调整。使用软件内置的打分函数评估每种配体构象与受体之间的亲和力。对接结果通过结合自由能进行评价，选择最大聚类中能量最负的构象作为代表性结合模式。选择亲和力最强且构象最优的结合模式进行可视化展示。亲和力值低于−4.25 kcal/mol表明配体与靶点之间存在结合，低于−5.0 kcal/mol表明具有中等结合能力，低于−7.0 kcal/mol则表明具有强结合亲和力19。

ALD的小鼠模型
本研究购入30只无特定病原体（SPF）级昆明小鼠（18–22 g，6–8周龄，雄性15只，雌性15只）。动物饲养于温度25 ± 2 °C、相对湿度60% ± 10%的可控环境中， 随意摄取 可自由获取食物和水。实验前，小鼠适应环境1周。

ALD 模型的建立方法如下。通过量取70.21 mL无水乙醇至容量瓶中，并用超纯水定容至100 mL，配制70% v/v乙醇溶液。使用磁力搅拌器搅拌1分钟，静置5分钟，直至未观察到相分离。灌胃剂量为2 mL/kg体重，连续7天每天给药一次。在第7天早晨，末次灌胃4小时后，采集血液样本和肝组织用于进一步分析。通过评估典型的肝损伤指标确认模型建立成功。检测血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆固醇（T-CHO）和丙二醛（MDA）的水平。此外，采用苏木精-伊红（H&E）染色对肝组织进行组织病理学检查，以评估肝细胞形态、胞质空泡化、坏死及炎性细胞浸润情况。小鼠随机分为五组（每组n=6）：空白对照组给予2 mL/kg蒸馏水；模型组给予2 mL/kg 70%乙醇，不进行其他处理；阳性对照组给予护肝片0.4 g/kg（见材料表）；高剂量蓝狐胆粉组给予10 g/kg蓝狐胆粉；低剂量蓝狐胆粉组给予5 g/kg蓝狐胆粉。除空白对照组外，其余各组均每天口服70%乙醇（2 mL/kg），连续7天，以诱导酒精性肝损伤。在第7天乙醇给药后4小时，给予相应治疗（护肝片或蓝狐胆粉），随后进行各项实验。空白对照组在整个实验期间均给予蒸馏水。

血清转氨酶（ALT 和 AST）及总胆固醇（T-CHO）检测试剂盒
血液样本在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 15 分钟以获取血清。样本在分析前储存于 -20 °C。根据制造商说明书，使用商用试剂盒检测 ALT、AST 和 T-CHO 水平（见材料表）。

体重监测
在连续7天乙醇给药后，于第7天给予治疗，并在早晨给药后4小时进行实验。观察期间每天记录2次体重。在给药后的第1、2、3、5、7、10和14天，使用电子分析天平测量非禁食状态下的体重。

组织样本处理
给药后第14天，记录动物体重及剩余食物摄入量。随后于下午开始禁食，但可自由饮水。次日（禁食12–16小时后），在颈椎脱臼法处死前测量禁食状态下的体重。进行大体病理学检查，以评估主要器官的形态学变化，包括但不限于心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾上腺、脑、胃、肠道、睾丸、前列腺、卵巢和子宫。从空白对照组（CN）和低剂量蓝狐胆汁组（LH）中随机采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃和肠道的组织样本，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后进行苏木精-伊红（H&E）染色，用于组织病理学评估。在显微镜下观察并拍摄组织切片。

苏木精和伊红（H&E）染色
肝组织标本用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）固定，石蜡包埋并切片。切片依次在二甲苯I和II中脱蜡，在递减浓度的乙醇（100%、95%、85%和75%）中水化，用水洗涤，分化，再次洗涤，并用蓝化液蓝化。漂洗后，切片在85%和95%乙醇中各脱水5分钟，用伊红染色5分钟，再在无水乙醇I、II和III中各脱水5分钟。最后，切片在二甲苯I和II中各透明5分钟，中性树胶封片。使用光学显微镜（100倍）采集图像。

肝组织中丙二醛（MDA）的测定
将肝组织样本加入9倍体积的生理盐水中，使用组织研磨器进行匀浆。匀浆液于4 °C条件下以700 × g 离心10分钟。按照试剂盒说明书，采用商用试剂盒（见材料表）对上清液进行MDA检测。

统计学分析
数据以均值 ± 标准差（SD）表示。组间比较采用方差分析（ANOVA），随后进行最小显著差异（LSD）事后检验。双侧 p 值<0.05 被认为具有统计学显著性。

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结果

蓝狐胆汁中活性成分的鉴定
蓝狐和熊均为食肉动物，具有相似的消化生理和代谢特征20。因此，它们的胆汁成分可能具有相似性。采用上述色谱条件，各化合物均得到良好分离（图2）。本实验中，利用牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）标准品21的保留时间对蓝狐胆汁中的TUDCA进行鉴定（图2）。在保留时间约为10分钟、12分钟和21分钟处出现的色谱峰被鉴定为TUDCA，其保留时间一致（表2），支持蓝狐胆汁中存在TUDCA。蓝狐胆汁与熊胆汁共有10个保留时间一致（相对标准偏差（RSD）<2%）且组分比例相似的色谱峰。

采用UPLC-Q-TOF/MS正离子模式进一步分析蓝狐胆汁，共检测到41个质谱峰（图3）。其中，鉴定了4个峰（表3

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讨论

根据2018年世界卫生组织（WHO）发布的《酒精与健康全球状况报告》，中国的人均酒精消费量从2005年的4.1升上升至2016年的7.2升，增幅达76%。长期饮酒所致的酒精性肝病（ALD）仍是肝病相关发病率和死亡率的主要病因之一22。Bo等研究人员在小鼠中建立了四氯化碳（CCl4）诱导的肝损伤模型，观察到蓝狐胆汁可显著降低AST、ALT、总胆固醇（T-CHO）和丙二醛（MDA）水平23。本研究的药理学实验结果与此一致，表明蓝狐胆汁对小鼠酒精性肝病具有治疗作用。

本研究中，以27.4%浓度、40 mL/kg剂量、每日两次、连续给药14天的条件下对蓝狐胆汁粉进行急性毒性评估，结果显示其具有良好的安全性。未观察到明显死亡率、严重毒性反应或长期器官损伤。仅出现轻微且短暂的症状，如俯卧姿势和稀便，可能与胆汁类物质苦寒的性质有关，但这些效应迅速消退，无持久后果。低剂量组（LH组）体重保持稳定，与对照组（CN组）相比无显著差异。大体解剖及组织病理学检查均未发现主要器官存在异常。鉴...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金青年科学基金（编号：82204562）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.03M 磷酸二氢钠N/AN/AHPLC 流动相 A
0.1% 甲酸水溶液Fisher Scientific, USAN/AUPLC 流动相
0.22 μm 微孔滤膜N/AN/A样品过滤
4% 多聚甲醛N/AN/A组织固定
色谱级乙腈Fisher Scientific, USAN/AUPLC 流动相
ALT、AST、T-CHO 检测试剂盒上海源叶生物科技有限公司，中国N/A血清生化分析
分析天平N/AN/A动物体重测量
熊去氧胆酸中国食品药品检定研究院N/AHPLC/MS 内标物
熊胆粉中国食品药品检定研究院，北京N/A对照品
胆红素未指明N/A胆汁中鉴定的活性成分
蓝狐中国黑龙江绥化狐狸养殖场N/A胆汁来源
蓝狐胆粉实验室自制N/A成分分析样品
C18 HPLC 色谱柱Agilent Technologies, USAZORBAX SB-C18 (4.6×150 mm, 5 μm)HPLC 分离
Cytoscapehttps://cytoscape.org/Version 3.9.1网络可视化与拓扑分析
DAVIDNIHhttps://david.ncifcrf.gov/GO/KEGG 富集分析
GeneCardsWeizmann 研究所https://www.genecards.org/疾病相关基因检索
苏木精-伊红（H&E）N/AN/A组织学染色
HPLC 系统Agilent Technologies, USA1200 Infinity胆汁成分分析
昆明小鼠（SPF 级，18–22g）辽宁长生生物技术股份有限公司SCXK (辽) 2020-0010酒精性肝损伤模型
亮氨酸脑啡肽Sigma, USAN/A质谱校准标准品（40 fmol/μL）
MDA 检测试剂盒上海源叶生物科技有限公司，中国N/A肝脏氧化应激水平测定
色谱级甲醇Fisher Scientific, USAN/A样品制备溶剂
MOEChemical Computing GroupMOE 2022.02分子对接分析
OMIMNIHhttps://omim.org/疾病相关基因检索
光学显微镜N/AN/A组织学观察
PharmMapper华东理工大学http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/活性成分靶点预测
磷酸N/AN/A流动相 pH 调节
PubChemNCBIhttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/化合物结构检索
RCSB 蛋白质数据库https://www.pdbus.org/N/A蛋白质三维结构来源
冷冻离心机N/AN/A血清与组织分离
牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）中国食品药品检定研究院N/AHPLC/MS 内标物
STRINGEMBLhttp://version10.string-db.org/蛋白质-蛋白质相互作用分析
UniProtEMBL-EBIhttps://www.uniprot.org/靶点标准化
UPLC-Q-TOF-MS 系统Waters, USAUPLC HSS T3 (100×2.1 mm, 1.8 μm)成分鉴定
VennyCSIChttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html靶点交集可视化

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