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微滴数字聚合酶链式反应用于非小细胞肺癌突变的精准检测

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DOI：

10.3791/68770

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2025年7月29日

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1The 2nd Department of Thoracic Surgery, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University

本文内容

摘要

本文介绍一种利用微滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）高灵敏度和高特异性检测EGFR T790M突变的实验方案，该方法还可扩展用于快速鉴定其他肿瘤突变，如G719S、L858R、L861Q和S768I。

摘要

在全球范围内，肺癌仍然是导致癌症相关死亡的首要原因，其发病率仅次于肾癌。非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有报道的肺癌病例的80-85%。EGFR基因中的T790M突变是已知导致表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）获得性耐药的主要因素之一。在病情进展的患者中，约有50-60%可观察到该突变的存在。因此，建立一种快速且高灵敏度的检测方法以识别EGFR基因中的T790M突变，对于非小细胞肺癌的及时诊断至关重要。本研究采用数字滴定PCR（ddPCR）技术检测T790M突变，其检测下限为10拷贝/µL，灵敏度是qPCR（1 × 102 拷贝/µL）的10倍。在15份模拟样本中，ddPCR能够检测到EGFR基因中的T790M突变，而这些突变在使用qPCR分析时表现为水平降低。目前正研究通过快速检测方法识别EGFR基因内T790M突变的可行性。

引言

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，也是总体上第二常见的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（NSCLC）占所有报告肺癌病例的绝大多数，约为80%至85%1,2,3,4。对于携带EGFR突变的晚期非小细胞肺癌患者，标准治疗方案是使用第一代、第二代或第三代表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）5,6,7。然而，大多数接受第一代或第二代EGFR-TKIs治疗的患者最终会产生获得性耐药。这种耐药性通常归因于EGFR基因中T790M突变的存在，在疾病进展的患者中，该突变的发生率约为50%至60%8,9,10,11,12。

传统上，组织样本中肿瘤DNA的遗传异常是通过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）或下一代测序（next-generation sequencing, NGS）等技术来鉴定的13,14。然而，由于肿瘤难以接近、患者健康状况不佳或肿瘤细胞含量不足，组织活检可能具有挑战性15,16,17。作为一种替代方法，液体活检（尤其是血浆来源的液体活检）通过检测循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）来识别驱动突变，具有更小的侵入性。肿瘤细胞会将DNA释放到血液、胸腔积液、唾液或粪便中，为遗传分析提供了宝贵的来源18,19。ctDNA的遗传特征通常与肿瘤本身的遗传组成相似，能够全面反映肿瘤异质性，这对于准确诊断和个体化癌症治疗至关重要20,21。

在外周血中检测EGFR突变的多种技术中，包括测序、实时聚合酶链式反应（RT-PCR）、数字PCR、变性高效液相色谱法（DHPLC）、扩增阻滞突变系统（ARMS）以及突变富集PCR（ME-PCR），微滴式数字PCR（ddPCR）已成为检测循环肿瘤DNA（ctDNA）突变的一种高度有效的工具22,23。其卓越的灵敏度、精确性以及高准确性检测低丰度突变的能力使其脱颖而出。与传统PCR不同，ddPCR将样本分割成数千个微滴，从而无需标准曲线即可实现靶标DNA序列的绝对定量。这使其特别适用于检测EGFR中的T790M等罕见突变。尽管ddPCR具有诸多优势，但其在临床中的广泛应用仍受限于样本制备、系统优化以及与qPCR等成熟技术的性能比较等方面的挑战。目前在优化用于ctDNA突变检测的ddPCR实验方案方面仍存在关键空白，尤其是在临床应用所必需的灵敏度、特异性和可重复性方面。

本研究假设，与传统的qPCR方法相比，数字滴落式PCR（ddPCR）在检测循环肿瘤DNA（ctDNA）中的EGFR T790M突变方面具有更高的灵敏度和可靠性。我们重点优化了核酸提取流程以提高效率，随后对ddPCR的突变检测条件进行了优化。此外，我们利用模拟样本，从灵敏度、特异性和重复性方面对ddPCR与qPCR的性能进行了比较。通过系统评估ddPCR的应用潜力，旨在确立其作为液体活检中检测EGFR突变的一种可行且更优的qPCR替代方法。

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方案

本研究未涉及人类受试者、人类组织或活体动物实验，因此无需正式的伦理审批。所有操作均遵循机构和国家的指导原则进行。T790M突变质粒为商业合成。用于模拟临床样本的猪血来自经认证的供应商，符合动物福利法规，且不涉及活体动物操作。所有其他试剂，包括磁珠、引物、探针和PCR酶，均为商业来源，并按照制造商的说明使用。

核酸提取
使用磁珠提取试剂盒和全自动核酸提取仪进行核酸提取。标准操作步骤包括：向预装深孔板的第1或第7列中加入200 µL样本和20 µL蛋白酶K；然后向第2或第8列中加入试剂盒提供的15 µL磁珠。将磁套管放置于指定位置后，在仪器上启动提取程序。提取完成后，将第6或第12列中的液体转移至新的无核酸酶的1.5 mL离心管中，并于-20 °C保存。

为了优化低浓度目标核酸的提取，进行了优化实验。推荐的提取参数为：裂解温度 70 °C，裂解时间 10 分钟，三种洗涤液各 1 分钟，干燥 2 分钟，以及在 56 °C 下洗脱 3 分钟。对影响最显著的参数进行了系统优化：裂解温度（62 °C、66 °C、70 °C、74 °C 和 78 °C），裂解时间（1、3、5、7 和 9 分钟），以及磁珠粒径（100 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm 和 1000 nm）。这些优化实验使用浓度为 1 × 105 拷贝/µL 的 T790M 突变质粒进行。100 nm 磁珠由提取试剂盒提供，其他粒径的磁珠则来自某生物技术公司。通过分析提取样品的 qPCR 扩增曲线和 Ct 值，评估每种提取条件的效率。采用统计学软件对结果进行统计分析。

标准质粒DNA
EGFR基因的T790M突变体质粒由生物技术公司定制合成。将4微克干质粒粉末重悬于100 µL的1× TE缓冲液中。使用分光光度计测定质粒浓度。拷贝数/微升通过以下公式计算：拷贝数/µL = [(6.02 × 1023) × (DNA浓度 (ng/µL) × 10-9)] / (DNA长度（碱基对）× 660)。合成片段的浓度为1.26 × 109 拷贝/µL。将该原液质粒稀释126倍，得到工作浓度为1 × 108 拷贝/µL的溶液。

引物设计与合成
基于标准引物设计原则，使用 Primer 6 软件设计针对 EGFR T790M 突变的引物和 TaqMan 探针。上游引物：5′-CCTCACCTCCACCGTGC-3′；下游引物24：5′-AGGCAGCCGAAGGGCA-3′；探针：5′-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3′。所有引物和探针均由商业寡核苷酸合成服务公司合成。

数字PCR和TaqMan荧光定量检测体系的建立与优化
将浓度为1 × 108 拷贝/µL的T790M质粒用1× TE缓冲液稀释至1 × 106 拷贝/µL，用于数字PCR和qPCR体系的优化实验。

ddPCR 体系的优化：根据酶生产商的建议对 ddPCR 体系进行优化。初始推荐体系包括：7.5 µL 的 4x PCR 混合液，1.2–3 µL 的上游引物（10 µM），1.2–3 µL 的下游引物（10 µM），0.3–1.8 µL 的探针（10 µM），1–15 µL 的 DNA 模板，以及无核酸酶水补足至终体积 30 µL。推荐的扩增程序为：95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环为 94 °C 变性 30 秒，55–65 °C 退火延伸 60 秒。系统性地优化了退火温度（55–61.8 °C）、引物浓度（1–3 µL）、探针浓度（0.75–1.75 µL）和模板浓度（3–15 µL）。优化结果采用统计学软件进行统计分析。

qPCR 体系的优化：根据酶生产商的建议对 qPCR 体系进行优化。初始推荐体系包括：5 µL Taq 聚合酶，0.45 µL 250 mM MgCl₂，0.5–2.5 µL 正向引物（10 µM），0.5–2.5 µL 反向引物（10 µM），0.5–2.5 µL 探针（10 µM），5 µL DNA 样品，以及无核酸酶水补足至终体积 25 µL。推荐的扩增程序为：95°C 预变性 5 分钟；随后进行 45 个循环，每个循环为 95°C 变性 15 秒，56–64°C 退火延伸 30 秒，并在 56–64°C 收集荧光信号。对退火温度（56–64°C）、引物浓度（1–3 µL）、探针浓度（0.5–2.5 µL）以及模板浓度（1–5 µL）进行了优化。采用统计学软件对实验结果进行统计分析。

ddPCR 与 Taqman 荧光定量 PCR 灵敏度检测
为评估 ddPCR 与 qPCR 的灵敏度，将浓度为 1 × 108 拷贝/µL 的 T790M 质粒用 1× TE 缓冲液进行连续 10 倍梯度稀释，制备出浓度范围从 106 至 101 拷贝/µL 的标准品。对于 ddPCR，根据优化后的 ddPCR 体系，为每个浓度（包括一个阴性对照）配制七份反应溶液。将样品加载至微滴生成芯片，并使用微滴生成仪生成微滴。随后，将这些微滴在 PCR 扩增仪中进行扩增，并通过数字 PCR 检测仪进行分析。同时，根据优化后的 qPCR 体系，使用相同的模板配制七份反应溶液，并在实时荧光定量 PCR 仪上运行，以比较两种方法的灵敏度（n = 3）。

ddPCR 重复性测试
为评估重复性，将标准 T790M 质粒 DNA（1 × 108 拷贝/µL）稀释，制备高浓度（1 × 106 拷贝/µL）、中浓度（1 × 104 拷贝/µL）和低浓度（1 × 102 拷贝/µL）的标准品。根据优化的 ddPCR 体系配制六份反应溶液。将样品加载至微滴生成芯片，并使用微滴生成仪生成微滴。随后，将微滴在PCR仪中进行扩增，并通过数字PCR检测仪器进行分析。实验中包含阴性对照。该实验重复三次。通过比较扩增曲线并计算三次重复实验的变异系数（CV）值来评估重复性。

模拟样本检测
为了验证T790M突变ddPCR和qPCR检测系统的可靠性，我们分别将高浓度和低浓度的T790M突变标准质粒随机混合入猪血中，并以未加入标准质粒的猪血作为阴性样本，共随机制备15份模拟样本，从模拟样本中提取核酸后，分别采用ddPCR和qPCR方法进行检测。

统计学分析
所有实验均至少进行三次技术重复。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。统计学分析使用 GraphPad Prism 10 软件进行。组间差异根据情况采用 Student t 检验或单因素方差分析（ANOVA）进行分析。以 p 值小于 0.05 为具有统计学显著性。

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结果

核酸提取的优化
基于ddPCR检测EGFR T790M突变的工作流程示意图总结如下 图1首先，我们确定了最佳裂解温度。如图所示 图 2A，一种切割温度 66 °C 获得了最小的平均 Ct 值，表明切割效率最高。因此， 66 °C 被选用于后续实验。接下来，我们在已确定的最佳温度下优化了裂解时间 66 °C. 图2B 表明7分钟的切割时间相较于其他时长可获得最低的平均Ct值，从而确定7分钟为最佳切割时间。最后，我们评估了不同磁珠颗粒 在优化的裂解条件下测得的大小（66 °C 切割温度和7分钟切割时间）。 图 2C 结果表明，核酸提取试剂盒提供的100 nm磁珠产生的平均Ct值最小，说明与其他测试粒径相比，100 nm磁珠具有更优的核酸提取效率。

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讨论

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，一直是医学研究的重点。在本研究中，我们探讨了肺癌的多个关键方面，旨在为其诊断、治疗和预后提供更深入的见解。肺癌精准诊断与治疗的基石在于准确的基因检测。正如 Zhao 等人25所展示的，传统基因检测严重依赖高质量的组织样本，且成本高、耗时长。研究团队采用无标注的深度学习人工智能方法开发的 DeepGEM 模型，为肺癌基因检测带来了新的方向，能够更准确、及时且经济地预测肿瘤基因突变及其空间分布25。这一成果表明，在肺癌研究中，我们应积极探寻跨学科技术手段，以优化现有的诊疗流程。

在肺癌基因突变检测领域，基于ddPCR技术已取得显著的研究成果。Williamson等26研究表明，ddPCR在检测非小细胞肺癌EGFR突变方面具有高准确性和快速性，例如检测EGFR L858R突变的分析灵敏度可低至0.01%的变异等位基因分数，检测EGFR 19号外显子缺失突变的灵敏度为0.1%。Tang等

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

云南省科学技术厅 & 昆明医科大学应用基础研究联合专项项目，202101AY070001-134

作者贡献
Youming Lei 和 Guoli Lv 对本工作贡献相同，为共同第一作者。Youming Lei 和 Guoli Lv 负责研究的构思与设计。Qingmei Yang 参与了数据收集与分析。Jin Duan 和 Yunfei Shi 负责监督数据分析与结果解释，修订了稿件，并批准了最终版本予以发表。所有作者均已阅读并同意最终稿件内容。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1× TE 缓冲液Sangon BiotechB548144用于 DNA 稀释的 Tris-EDTA 缓冲液
4× Unimix-U 酶混合液TargetingOne BioUNIMIXU-4XddPCR 酶混合液
A300 快速热循环仪LongGeneA300用于 PCR 扩增
生物芯片分析仪SEED BioDigitalPCR-Biochip数字 PCR 检测系统
液滴样本制备仪新羿生物科技数字 PCR 平台 TD-2微液滴制备
磁珠法核酸提取试剂盒莱敏斯科技MXP-1005核酸提取
微液滴生成芯片TargetingOne BiotechMG-Chip-01用于生成 ddPCR 所需的微液滴
NanoDropAllshengNC-500样本提取后核酸浓度测定
NanoDrop ND-500 分光光度计Allsheng InstrumentsND-500用于 DNA 定量的分光光度计
PCR 仪器 A300 快速热循环仪LongGeneA300用于 PCR 扩增的热循环仪
引物和 TaqMan 探针Sangon Biotech定制合成用于 T790M 突变检测的引物和 TaqMan 探针
qPCR 仪器 Gentier mini天隆科技Gentier mini实时荧光定量 PCR 仪器
T790M 突变质粒青科生物T790M标准曲线与检测限测试

参考文献

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