本文介绍一种利用微滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）高灵敏度和高特异性检测EGFR T790M突变的实验方案，该方法还可扩展用于快速鉴定其他肿瘤突变，如G719S、L858R、L861Q和S768I。
本文内容
摘要
摘要
在全球范围内，肺癌仍然是导致癌症相关死亡的首要原因，其发病率仅次于肾癌。非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有报道的肺癌病例的80-85%。EGFR基因中的T790M突变是已知导致表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）获得性耐药的主要因素之一。在病情进展的患者中，约有50-60%可观察到该突变的存在。因此，建立一种快速且高灵敏度的检测方法以识别EGFR基因中的T790M突变，对于非小细胞肺癌的及时诊断至关重要。本研究采用数字滴定PCR（ddPCR）技术检测T790M突变，其检测下限为10拷贝/µL，灵敏度是qPCR（1 × 102 拷贝/µL）的10倍。在15份模拟样本中，ddPCR能够检测到EGFR基因中的T790M突变，而这些突变在使用qPCR分析时表现为水平降低。目前正研究通过快速检测方法识别EGFR基因内T790M突变的可行性。
引言
肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，也是总体上第二常见的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（NSCLC）占所有报告肺癌病例的绝大多数，约为80%至85%1,2,3,4。对于携带EGFR突变的晚期非小细胞肺癌患者，标准治疗方案是使用第一代、第二代或第三代表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）5,6,7。然而，大多数接受第一代或第二代EGFR-TKIs治疗的患者最终会产生获得性耐药。这种耐药性通常归因于EGFR基因中T790M突变的存在，在疾病进展的患者中，该突变的发生率约为50%至60%8,9,10,11,12。
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方案
本研究未涉及人类受试者、人类组织或活体动物实验，因此无需正式的伦理审批。所有操作均遵循机构和国家的指导原则进行。T790M突变质粒为商业合成。用于模拟临床样本的猪血来自经认证的供应商，符合动物福利法规，且不涉及活体动物操作。所有其他试剂，包括磁珠、引物、探针和PCR酶，均为商业来源，并按照制造商的说明使用。
核酸提取
使用磁珠提取试剂盒和全自动核酸提取仪进行核酸提取。标准操作步骤包括：向预装深孔板的第1或第7列中加入200 µL样本和20 µL蛋白酶K；然后向第2或第8列中加入试剂盒提供的15 µL磁珠。将磁套管放置于指定位置后，在仪器上启动提取程序。提取完成后，将第6或第12列中的液体转移至新的无核酸酶的1.5 mL离心管中，并于-20 °C保存。
为了优化低浓度目标核酸的提取，进行了优化实验。推荐的提取参数为：裂解温度 70 °C，裂解时间 10 分钟，三种洗涤液各 1 分钟，干燥 2 分钟，以及在 56 °C 下洗脱 3 分钟。对影响最显著的参数进行了系统优化：裂解温度（62 °C、66 °C、70 °C、74 °C 和 78 °C），裂解时间（1、3、5、7 和 9 分钟），以及磁珠粒径（100 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm 和 1000 nm）。这些优化实验使用浓度为 1 × 105 拷贝/µL 的 T790M ....
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结果
核酸提取的优化
基于数字PCR检测EGFR T790M突变的工作流程如图1所示。首先，我们确定了最佳裂解温度。如图2A所示，66 °C的裂解温度得到的平均Ct值最小，表明该温度下裂解效率最高。因此，后续实验选择66 °C作为裂解温度。接下来，我们在已确定的最佳温度（66 °C）下优化裂解时间。图2B显示，与其他时间相比，7分钟的裂解时间产生的平均Ct值最低，因此确定7分钟为最佳裂解时间。最后，在优化的裂解条件（66 °C裂解温度和7分钟裂解时间）下，我们评估了不同粒径的磁珠。如图2C所示，核酸提取试剂盒配套提供的100 nm磁珠产生的平均Ct值最小，表明与其他测试粒径相比，100 nm磁珠具有更优的核酸提取效率。
ddPCR 和 qPCR 系统优化分析
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讨论
肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，一直是医学研究的重点。在本研究中，我们探讨了肺癌的多个关键方面，旨在为其诊断、治疗和预后提供更深入的见解。肺癌精准诊断与治疗的基石在于准确的基因检测。正如 Zhao 等人25所展示的，传统基因检测严重依赖高质量的组织样本，且成本高、耗时长。研究团队采用无标注的深度学习人工智能方法开发的 DeepGEM 模型，为肺癌基因检测带来了新的方向，能够更准确、及时且经济地预测肿瘤基因突变及其空间分布25。这一成果表明，在肺癌研究中，我们应积极探寻跨学科技术手段，以优化现有的诊疗流程。
在肺癌基因突变检测领域，基于ddPCR技术已取得显著的研究成果。Williamson等26研究表明，ddPCR在检测非小细胞肺癌EGFR突变方面具有高准确性和快速性，例如检测EGFR L858R突变的分析灵敏度可低至0.01%的变异等位基因分数，检测EGFR 19号外显子缺失突变的灵敏度为0.1%。Tang等
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
云南省科学技术厅 & 昆明医科大学应用基础研究联合专项项目，202101AY070001-134
作者贡献
Youming Lei 和 Guoli Lv 对本工作贡献相同，为共同第一作者。Youming Lei 和 Guoli Lv 负责研究的构思与设计。Qingmei Yang 参与了数据收集与分析。Jin Duan 和 Yunfei Shi 负责监督数据分析与结果解释，修订了稿件，并批准了最终版本予以发表。所有作者均已阅读并同意最终稿件内容。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1× TE 缓冲液 | Sangon Biotech | B548144 | 用于 DNA 稀释的 Tris-EDTA 缓冲液 |
| 4× Unimix-U 酶混合液 | TargetingOne Bio | UNIMIXU-4X | ddPCR 酶混合液 |
| A300 快速热循环仪 | LongGene | A300 | 用于 PCR 扩增 |
| 生物芯片分析仪 | SEED Bio | DigitalPCR-Biochip | 数字 PCR 检测系统 |
| 液滴样本制备仪 | 新羿生物科技 | 数字 PCR 平台 TD-2 | 微液滴制备 |
| 磁珠法核酸提取试剂盒 | 莱敏斯科技 | MXP-1005 | 核酸提取 |
| 微液滴生成芯片 | TargetingOne Biotech | MG-Chip-01 | 用于生成 ddPCR 所需的微液滴 |
| NanoDrop | Allsheng | NC-500 | 样本提取后核酸浓度测定 |
| NanoDrop ND-500 分光光度计 | Allsheng Instruments | ND-500 | 用于 DNA 定量的分光光度计 |
| PCR 仪器 A300 快速热循环仪 | LongGene | A300 | 用于 PCR 扩增的热循环仪 |
| 引物和 TaqMan 探针 | Sangon Biotech | 定制合成 | 用于 T790M 突变检测的引物和 TaqMan 探针 |
| qPCR 仪器 Gentier mini | 天隆科技 | Gentier mini | 实时荧光定量 PCR 仪器 |
| T790M 突变质粒 | 青科生物 | T790M | 标准曲线与检测限测试 |
参考文献
- Boustany, Y., et al. Advanced non-small cell lung cancer: EGFR mutation analysis using pyrosequencing and the fully automated qPCR-based IdyllaTM system. Cancer Control. 30, 10732748231177538(2023).
- Sung, H., et al.
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