本研究建立了一种从代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）小鼠中分离原代肝细胞的标准方案，可在无需人工脂质加载的情况下，开展与脂肪变性和代谢功能障碍相关的疾病研究。该方法可获得高产量、高活力的肝细胞，适用于机制研究和治疗探索。
本文内容
摘要
摘要
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）以肝细胞内病理性脂质蓄积（脂肪变性）为特征，已成为一项重大且日益严重的全球健康负担。原代小鼠肝细胞培养是阐明MASLD发病机制及治疗干预不可或缺的离体（ex vivo）模型。然而，从脂肪变性肝脏中可靠地分离高质量肝细胞在技术上仍具挑战性。本文介绍一种利用胶原酶灌注技术从MASLD小鼠中高效分离原代肝细胞的简易方案。该方案所获得的肝细胞具有天然的脂肪变性特征，无需通过添加棕榈酸和油酸进行人工诱导，从而保留了更接近生理状态的表型。本方法可获得高活力、高纯度的肝细胞，且普遍适用于从MASLD小鼠中大量分离肝细胞。此外，该方法也适用于药理学评估或基因干预研究。综上所述，我们提供了一种可重复的方案，用于分离高得率、高纯度和高活力的肝细胞，以支持后续的细胞生物学研究，推动发现MASLD新的治疗靶点和药物。
引言
代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（MASLD）以肝细胞内病理性脂质蓄积为特征，是全球最常见的慢性肝病1据估计，MASLD 影响全球 38% 的成年人口，已成为人类健康的重要威胁2MASLD 的发病机制尚未完全阐明，且治疗选择非常有限。发现新的治疗靶点并开发针对 MASLD 的靶向药物 已成为一项迫切的临床需求。肝细胞作为构成肝脏的主要细胞类型，是肝脏糖、脂质和药物代谢的主要场所。与肝细胞系相比，原代肝细胞保留了更为完整的肝细胞功能，是研究肝脏疾病机制和药物开发的有力工具。3从脂肪肝小鼠中分离和培养原代肝细胞是研究肝脏病理生理学的基本技术，包括脂质代谢、胰岛素抵抗和炎症反应等。先前建立的用于脂肪肝小鼠模型肝细胞分离的实验方案采用梯度离心法，可有效分离出正常肝细胞和脂质蓄积型肝细胞群体。因此，所获得的富含脂质的肝细胞构成了研究这些病理过程的关键细胞资源。 体外 研究脂肪肝疾病病理生物学的模型系统3该方法的主要目标是简便且经济地获得高活力、高产量的肝细胞，这些肝细胞保留了疾病特异性的表型特征，因而能够模拟代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）。 体外.
小鼠肝细胞分离的一般步骤包括一个两步法，首先使用等渗灌注液（如Hank's平衡盐溶液，HBSS）灌流肝脏以清除血液，随后使用含胶原酶的消化液消化肝脏。近年来，肝脏灌注与酶消化技术的进步已提高了雌性小鼠原代肝细胞的得率和活力。4对传统的两步胶原酶灌注方法进行改进，例如优化缓冲液组成和缩短消化时间，对于将实验方案适配于脂肪肝样本至关重要。原代肝细胞作为揭示代谢相关脂肪性肝病（MASLD）及其心脏代谢并发症病理生理机制不可或缺的模型，尤其在通过内皮介质和血管生成因子介导心肝交互作用及肝-血管轴相互作用方面具有重要作用。5,6这些细胞为驱动疾病进展的多器官通讯网络提供了关键见解，这一点已通过代谢性脂肪肝病（MASLD）、慢性肾病和缺血性心脏病之间的临床关联得到证实。7，同时为开发针对代谢综合征肝脏和心血管表现的靶向治疗提供了生理学上相关联的研究平台。目前 体外 MASLD 的研究主要依赖棕榈酸/油酸（PA/OA）刺激的正常肝细胞或人肝细胞系（如 HepG2 和 Huh7），这些模型难以充分模拟疾病状态下脂肪变性肝细胞的病理生理特征，限制了其在心-肝-血管相互作用研究中的转化应用价值。该方法无法再现 MASLD 进展过程中典型的慢性代谢功能障碍、炎症微环境以及疾病特异性的器官间串扰。
本方案可用于从MASLD小鼠中分离肝细胞，无需人工添加棕榈酸和油酸处理。总之，我们提出了一种简单且可重复的方法，能够获得高产量、高活力的肝细胞，适用于下游细胞生物学研究，有助于发现MASLD新的治疗靶点并推动药物开发。
方案
所有实验步骤均经中国科学技术大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。本研究中，雄性C57BL/6J小鼠接受高脂饮食（HFD，#12492，Research Diet）喂养超过12周。
1. 胶原包被培养板或培养皿的制备
- 向35 mL双蒸水中加入15 mL 100%乙醇2O (ddH₂O)2O). 用30%乙醇配制50 μg/mL的I型胶原溶液，使用无菌0.22 µm滤器过滤。
- 按每平方厘米30 µL的量用胶原蛋白溶液包被细胞培养板或培养皿2室温（RT）孵育1小时。
- 用移液器除去多余液体，干燥培养皿。将包被的培养皿置于紫外线下照射0.5小时以进行灭菌。4 °C保存，保存时间少于1个月。
注意：紫外灯的波长为254 nm，紫外强度不低于400 mw/m2紫外灯源与胶原蛋白包被培养皿之间的距离为1 m。
2. 灌注液的制备
- 在分离肝细胞前数天，准备表1中指定的肝细胞分离试剂和培养基。使用无菌0.22 µm滤头过滤灌注液A和B，4 °C保存，保存时间不超过1个月。准备水浴锅，并将温度设定为37 °C。
- 将灌注液A和B在37 °C水浴中预热。在手术前，向80 mL预热的灌注液B中加入40 mg IV型胶原酶。
- 在室温下，使用蠕动泵以4 mL/min的流速泵入75% EtOH，持续5分钟。随后将泵管从75% EtOH切换至预热的灌注液A。
注意：按照图1A所示配置组装加热循环灌注装置。
3. 手术步骤
- 使用批准的方法对小鼠进行麻醉。腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）。在继续操作前确认翻正反射消失。
- 将小鼠的上下肢固定在解剖板上。用75%酒精对术区进行消毒。
- 使用解剖器械切开腹膜内外层。用棉签将内脏器官拨向小鼠左侧，以暴露下腔静脉（IVC）和肝门静脉（PV）。
- 用棉签按压下腔静脉使其隆起。将22 G留置针平行插入下腔静脉。
- 抽出留置针中的金属针芯，将导管部分保留在下腔静脉内。将导管连接至带有0.22 µm滤器的灌注管路。
注意：留置针由金属针部分和塑料导管部分组成。确保准确插入下腔静脉，并等待留置针内充满血液。彻底排除留置针内的所有气泡。整个操作应迅速完成，以避免血栓形成。 - 设置灌注液A的灌注速率为5 mL/min。开始灌注，并观察肝脏直至其明显肿胀，立即剪断门静脉。
- 用棉签轻轻按摩肝脏，确保血液充分冲洗。继续灌注直至肝脏变为土黄色。
- 切换至含0.05% IV型胶原酶的灌注液B。继续灌注直至肝脏完全消化。
注意：每只小鼠肝脏消化至少需要10分钟。每只小鼠使用80 mL含胶原酶的灌注液B足以完成肝脏消化。肝组织经充分酶解后达到最大程度的软化，包膜包裹的实质组织变得极为脆弱，易受机械性破坏。 - 将肝脏从小鼠腹腔中取出，放入盛有DMEM的10 cm培养皿中。
- 在生物安全柜中操作，用镊子将肝脏撕碎成粉末状（消化良好的肝脏可轻易释放肝细胞）。
- 将悬液经70 µm细胞筛过滤至无菌50 mL离心管中。用DMEM培养基将体积调至45 mL（每只小鼠）。
- 以50 × g 离心4分钟。完全倾去上清液。
- 用DMEM培养基重悬沉淀，终体积为25 mL（每只小鼠）。再次以50 × g 离心2分钟。
- 完全倾去上清液。将沉淀重悬于25 mL含10%胎牛血清（FBS）的培养基中。
- 充分混匀细胞悬液。用台盼蓝染色进行细胞计数，并立即接种进行培养。
注意：将含2 × 105 个细胞的2 mL培养基接种至胶原包被的6孔板中。细胞接种2小时后更换DMEM培养基。
结果
本实验方案应用于高脂饮食（HFD）喂养超过12周的雄性C57BL/6J小鼠。分离得到的原代肝细胞被用于形态学和功能检测。从约40 g小鼠肝脏中，每次分离平均获得2 × 107个细胞。通过Calcein AM染色检测活细胞，确定细胞活力在85%–86%之间。每只饮食诱导肥胖（DIO）小鼠分离所得细胞数量足以接种15块标准6孔板。图1B–G以图示形式展示了DIO小鼠原代肝细胞分离与培养的代表性结果。鉴于小鼠肝细胞在药效动力学和肝脏病理生理学研究中的广泛应用，我们特别通过药理学和生物学反应谱分析，评估了分离细胞的降脂功效。
对饮食诱导肥胖小鼠原代肝细胞进行油红O染色和尼罗红染色。
为了检测饮食诱导肥胖（DIO）小鼠原代肝细胞的形态和功能，我们进行了油红O染色和尼罗红染色。从DIO小鼠中分离的原代肝细胞被接种于6孔板或培养皿中。细胞贴壁12小时后，对6孔板中的细胞进行油红O染色。此外，我们选用银杏素（ISOGK）来研究其对采用既定分离技术所获得的DIO小鼠原代肝细胞的作用。我们发现，ISOGK是一种强效的天然小分子三磷酸柠檬酸裂解酶（ACLY）抑制剂，能够抑制高胆固醇血症和动脉粥样硬化，并减少肝脏脂质沉积。细胞经不同浓度的ISOGK处理12小时后进行尼罗红染色。油红O染色和尼罗红染色结果显示，DIO小鼠的原代肝细胞中存在大量脂滴沉积（图2），而ISOGK能够以浓度依赖的方式减少肝细胞中的脂质积聚8。这表明分离得到的DIO原代肝细胞具有良好的存活能力，并且在药物处理后仍保持脂质代谢功能。此外，我们先前的研究也表明，ISOGK能够以剂量依赖的方式减少小鼠肝脏中肝细胞的脂质沉积8。
对饮食诱导肥胖小鼠原代肝细胞进行BODIPY染色
为了研究生物刺激对饮食诱导肥胖（DIO）小鼠原代肝细胞的影响，我们进行了BODIPY染色。将分离得到的原代肝细胞接种于共聚焦培养皿中用于BODIPY染色。细胞接种12小时后，加入重组腺病毒IER2（Ad-Ier2）或对照腺病毒（Ad-NC），继续孵育24小时，随后进行BODIPY染色。BODIPY染色结果显示，DIO小鼠的原代肝细胞中存在大量脂质积聚（图3），而与Ad-NC组相比，Ier2的过表达显著减少了肝细胞中的脂质积聚（图3）。这表明，分离获得的DIO原代肝细胞在经过生物处理后仍保持了脂质代谢功能。
图1：实验示意图及代表性结果。（A）实验示意图使用 FigDraw 软件绘制。将留置针经手术植入并固定于下腔静脉（IVC），随后切断门静脉（PV），同时通过蠕动泵输送恒温控制的灌注液，以实现持续的肝脏灌注和酶消化。（B）将留置针插入解剖后小鼠的下腔静脉（IVC）。箭头指示下腔静脉和门静脉的位置。（C）肝脏被含胶原酶的灌注液完全消化。（D、E）离心后获得的原代肝细胞沉淀。（F）原代小鼠肝细胞接种后24小时的形态（比例尺 = 100 µm）。箭头指示肝细胞内脂滴的位置。（G）原代小鼠肝细胞中HNF4α的免疫荧光染色。细胞分别与抗HNF4α抗体或IgG同型对照抗体孵育，细胞核用DAPI复染（蓝色）。HNF4α信号显示为绿色（比例尺 = 50 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：饮食诱导肥胖（DIO）小鼠原代肝细胞中的脂质积累。（A）从DIO小鼠分离的原代肝细胞中的油红O染色脂质。（B）从DIO小鼠分离的原代肝细胞中的尼罗红染色脂质。（C）从DIO小鼠（12周高脂饮食）分离的原代肝细胞的代表性尼罗红染色图像，经溶剂对照或指定浓度的银杏内酯B（ISOGK）处理12小时。所有图像中细胞核均用DAPI复染（蓝色）。图C经Zhang等8许可重复使用。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：BODIPY染色显示饮食诱导肥胖小鼠原代肝细胞中的脂质积聚。 对喂食高脂饮食（HFD）12周的小鼠分离得到的原代肝细胞，经24小时对照腺病毒（Ad-NC）或表达Ier2的重组腺病毒（Ad-Ier2）处理后，进行BODIPY脂质染色的代表性图像。请点击此处查看该图的放大版本。
| 灌注液 A（1 L 体积配制） | 用量 | 终浓度 | 操作说明 |
| NaCl | 8000 mg | 136.7 mM | 加入 950 mL 去离子水或蒸馏水，调节 pH 至 7.4，定容至 1 L。4 °C 保存。 |
| KCl | 400 mg | 5.4 mM | |
| Na2HPO4·12H2O | 132 mg | 0.37 mM | |
| K2HPO4 | 60 mg | 0.34 mM | |
| 1 M HEPES | 1 mL | 1 mM | |
| NaHCO3 | 350 mg | 4.2 mM | |
| 100 mM EGTA | 5 mL | 0.5 mM | |
| 葡萄糖 | 1000 mg | 5.6 mM | |
| 灌注液 B（1 L 体积配制） | 用量 | 终浓度 | 操作说明 |
| NaCl | 8000 mg | 136.7 mM | 加入 950 mL 去离子水或蒸馏水，调节 pH 至 7.4，定容至 1 L。4 °C 保存。 |
| KCl | 400 mg | 5.4 mM | |
| Na2HPO4·12H2O | 132 mg | 0.37 mM | |
| K2HPO4 | 60 mg | 0.34 mM | |
| 1 M HEPES | 1 mL | 1 mM | |
| NaHCO3 | 350 mg | 4.2 mM | |
| 2 M CaCl2 | 2.5 mL | 5 mM | |
| 葡萄糖 | 1000 mg | 5.6 mM |
表1：肝细胞分离所需缓冲液。
讨论
分离有活力的小鼠肝细胞涉及一个关键的两步法操作，首先使用等渗溶液进行彻底的血管灌注以清除血液成分，随后使用具有活性的胶原酶溶液进行可控的酶消化9,10。成功的分离依赖于在整个过程中维持最佳生理条件，特别是灌注液的稳定温度（37 °C）和 pH 值（7.2–7.4），因为这些参数直接决定细胞的存活率11,12。初始灌注阶段彻底清除血液对于后续组织的有效消化至关重要。酶消化阶段需要使用新鲜配制且活性经过验证的胶原酶，并需精确控制消化时间，以实现组织完全解离的同时保持细胞完整性。使用无菌棉签提供轻柔的机械辅助可增强消化的均匀性。该操作过程中维持无菌状态至关重要，若有条件，灌注应尽可能在生物安全柜内进行。当操作得当时，该方法可稳定获得高产量的功能完整的原代肝细胞，相较于永生化细胞系，其在代谢疾病研究中具有更高的生理相关性。
本方案可用于批量制备适合多次使用的灌注液，且无需高压灭菌。每次实验消耗的灌注液A少于150 mL，灌注液B少于50 mL，每只小鼠实验所用IV型胶原酶的成本低于10美元。整个细胞分离过程约需30分钟，即可从一只小鼠获得高活力、高得率的肝细胞。单只小鼠的分离通常可获得足够接种十余个培养皿的细胞量，且在正常小鼠和饮食诱导肥胖小鼠中结果均稳定可靠。值得注意的是，从肥胖小鼠分离得到的肝细胞仍保留大量脂滴，同时维持正常的脂质代谢功能，因此特别适用于脂质代谢紊乱相关的药理学筛选和机制研究。本实验室已利用正常小鼠经PA/OA刺激的原代肝细胞13,14以及饮食诱导肥胖（DIO）小鼠分离的原代肝细胞，开展过与代谢相关脂肪性肝病（MASLD）相关的机制及药理学研究8。然而，这两种实验方法在细胞活力和得率方面的系统性比较分析仍有待进一步完善。
分离原代肝细胞的方法有多种3,4,15，然而从正常小鼠中分离 仍是标准方法。因此，我们建立并优化了从饮食诱导肥胖（DIO）小鼠中分离原代肝细胞的实验方案。本研究中针对DIO小鼠开发并优化的分离技术，在保持高细胞得率和高活力的同时，克服了脂肪肝研究中的三个关键局限性。第一，通过精确优化灌注参数和酶消化条件，该方法显著提高了富含脂质肝细胞的分离效率。第二，所获得的原代肝细胞保留了病理相关的特征，包括完整的脂滴形态和疾病特异性的代谢谱型，从而提供了更符合生理状态的 体外 用于研究肝细胞脂质代谢的模型。第三，该方案操作简便且可重复性高，显著降低了建立代谢相关脂肪性肝病（MASLD）研究模型的技术门槛。这一技术进步提供了一个生理相关性较强的原代肝细胞平台，不仅能够支持针对肥胖相关MASLD的机制研究和高通量药物筛选，还独特地促进了涉及内皮介质的心-肝交互作用及肝-血管轴相互作用的研究。该方法在研究疾病特异性的病理过程（包括脂毒性、胰岛素抵抗和炎症反应）方面具有显著应用价值16,17，同时通过标准化的活力和产量评估，支持针对肝脂肪变性及相关心血管并发症的新型治疗药物的发现，从而弥补代谢相关脂肪性肝病（MASLD）药物开发及肝病学研究中多器官间通讯的关键空白。
披露
作者未报告存在潜在的利益冲突。
致谢
本工作受到国家自然科学基金 [编号：82373967] 的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mL 无菌离心管 | Nest | 602052 | |
| 抗 HNF4α 抗体 | Immunoway | YM8517 | |
| 抗 IgG 抗体 | Proteintech | 30000-0-AP | |
| BODIPY | Thermo Fisher Scientific | D3922 | |
| CaCl2 | Merck (SigmaAldrich) | C5670 | |
| 离心机 | Thermo | Sorvall ST16R | |
| Ⅰ型胶原蛋白 | Corning | 354236 | |
| Ⅳ型胶原酶 | Sangon Biotech | A004186-0001 | |
| 固定针 | BRAUN | 4254074B | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco | C11995500BT | |
| EGTA | Yeasen | 60339ES10 | |
| 乙醇 | Merck (SigmaAldrich) | 493511 | |
| 胎牛血清 | Sigma | F2442 | |
| 葡萄糖 | Merck (SigmaAldrich) | G7021 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 银杏毒素 | MedChemExpress | HY-N2117 | |
| K2HPO4 | Merck (Supelco) | PHR2900 | |
| KCl | Merck (SigmaAldrich) | P3911 | |
| Na2HPO4 ·12H2O | Merck (SigmaAldrich) | 04273 | |
| NaCl | Merck (SigmaAldrich) | S9888 | |
| NaHCO3 | Merck (SigmaAldrich) | S6014 | |
| 0.22µm 针式滤器 | Millex-GP | SLGV033RB | |
| 尼罗红 | Invitrogen | N1142 | |
| 青霉素/链霉素（100X） | Gibco | 15140122 | |
| 重组腺病毒 | Obio Technology Corp., ltd. | 由 Obio Technology Corp., ltd. 构建编码 Flag 标签小鼠 IER2（Ad-Ier2, NM_010499.4）的重组腺病毒和对照腺病毒（Ad-NC） | |
| 戊巴比妥钠 | Merck (SigmaAldrich) | P3761 | |
| 无菌细胞筛，100 μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 台盼蓝 | Beyotime | ST2780-5g | |
| 可调流速蠕动泵 | Longer | BT100-1F |
参考文献
- Israelsen, M., Francque, S., Tsochatzis, E. A., Krag, A. Steatotic liver disease. Lancet. 404 (10464), 1761-1778 (2024).
- Targher, G., Byrne, C. D., Tilg, H. Masld: A systemic metabolic disorder with cardiovascular and malignant complications. Gut. 73 (4), 691-702 (2024).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protoc. 1 (3), 100222(2020).
- Feng, M., Divall, S., Wu, S. An improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation. J Vis Exp. (176), e61812(2021).
- Driessen, S., et al. Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease and the heart. Hepatology. , (2023).
- Chew, N. W. S., et al. Cardiovascular-liver-metabolic health: Recommendations in screening, diagnosis, and management of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease in cardiovascular disease via modified delphi approach. Circulation. 151 (1), 98-119 (2025).
- Miyamori, D., et al. Coexistence of metabolic dysfunction-associated fatty liver disease and chronic kidney disease is a more potent risk factor for ischemic heart disease. J Am Heart Assoc. 12 (14), e030269(2023).
- Zhang, Z., et al. A natural small molecule isoginkgetin alleviates hypercholesterolemia and atherosclerosis by targeting ACLY. Theranostics. 15 (10), 4325-4344 (2025).
- Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods Mol Biol. 987, 283-293 (2013).
- Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: Cell characterization and asialoglycoprotein receptor-based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. J Vis Exp. (140), e58323(2018).
- Xu, S., et al. TRIM56 protects against nonalcoholic fatty liver disease by promoting the degradation of fatty acid synthase. J Clin Invest. 134 (5), e166149(2024).
- Xu, S., et al. The clinical antiprotozoal drug halofuginone promotes weight loss by elevating GDF15 and FGF21. Sci Adv. 11 (13), eadt3142(2025).
- Tiriticco, V., et al. Rat liver perfusion and primary hepatocytes isolation: An old procedure crucial for cutting-edge 3D organoids culture. J Vis Exp. (213), e66857(2024).
- Wei, S., et al. Nafld and nash: Etiology, targets and emerging therapies. Drug Discov Today. 29 (3), 103910(2024).
- Fang, T., et al. Mouse models of nonalcoholic fatty liver disease (nafld): Pathomechanisms and pharmacotherapies. Int J Biol Sci. 18 (15), 5681-5697 (2022).
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