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微型生物反应器阵列（MBRA）组装与使用的更新方案

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DOI：

10.3791/68788

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2025年9月5日

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1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Alkek Center for Metagenomics & Microbiome Research, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

微型生物反应器阵列（MBRA）是一种高通量、可定制的连续流培养系统，能够培养复杂的微生物群落，支持并行实验，用于研究微生物组动态、治疗相互作用以及微生物对环境因素的响应。

摘要

人类微生物组包含多样且动态变化的微生物群落，在宿主健康中发挥着至关重要的作用。深入了解这些群落及其对环境因素的响应，对于推动基于微生物组的治疗手段至关重要。传统的体外（in vitro）培养人源微生物群落模型通常缺乏可扩展性，且需要高度专业的技术操作，限制了其可及性和通量。为克服这些局限，我们开发了微型生物反应器阵列（Minibioreactor Array, MBRA）系统——一种模块化、单阶段、连续流式的高通量微生物群落培养平台。该系统可并行培养多达48个不同的微生物群落，在维持复杂生态系统稳定生长的同时，支持实验设计的灵活性。本实验方案详细介绍了MBRA的制备、组装、灭菌及操作流程。该系统的模块化设计便于其在厌氧环境中的整合，并可根据多种实验需求进行定制化调整。该系统已被用于研究微生物群落对抗生素、膳食成分及病原体入侵的响应，并可用于筛选抗病原体定植的微生物群落。凭借其良好的可及性、可扩展性和可重复性，MBRA系统为研究微生物相互作用及推动微生物组研究提供了一个强有力的模型平台。

引言

人类微生物组是一个复杂的微生物生态系统，在多种生理过程中发挥着关键作用，并深刻影响人类健康。人类微生物组遍布全身多个解剖部位，每个部位都含有动态的微生物群落，它们以我们尚未完全理解的方式进行活跃的相互作用1。要拓展我们对微生物群落在健康与疾病中作用的认识，关键在于理解这些环境中发生的微生物相互作用1。为了有效研究并针对治疗目的调控这些复杂的系统，必须采用还原论的方法。利用简化的模型系统来探究单个微生物之间的相互作用，有助于更深入地理解微生物组的整体复杂性2。

可用于培养人源微生物群落的模型系统种类繁多。这些系统推动了我们对与人类相关的微生物群落的理解，其形式从单阶段批量培养到更为复杂的多阶段连续流动系统不等。例如，人类肠道微生物生态系统模拟器3双容器单阶段连续培养器 系统4 肠道微生物群环境控制系统5 复制特定解剖部位的生理条件并提供密切 体外 微生物环境的近似模拟。然而，由于这些系统成本高昂、运行和维护需要高水平的技术专长，且通量有限，微生物学家对其采用仍受到限制。

为应对这些挑战，我们开发了微型生物反应器阵列（Minibioreactor Array, MBRA）系统——一种连续流动、单阶段培养系统，旨在促进来自不同来源的微生物群落在受控环境中稳定生长6,7,8。MBRA系统与其他肠道模型相比，具有组装和操作简便的优势，同时具备高通量能力，可实现多个微生物群落的同步培养，显著提升实验效率。此外，该系统结构简单紧凑，可在厌氧和微氧环境中运行，从而促进来自厌氧和低氧部位（如胃肠道和阴道）细菌的生长。该系统的多功能性已被用于筛选抗 Clostridioides difficile的胃肠道微生物群落9，以及评估抗生素10,11和饮食底物12对微生物群落的影响。

MBRA 通过 3D 打印或增材制造技术制备，在材料选择上优先考虑透明度和防水性（聚合物信息见材料表）。每个阵列包含六个独立腔室，均配备用于培养基输入、废液排出和样品采集的端口。新鲜培养基通过两个蠕动泵精确控制流速，持续输入系统，同时并发地排出废液。系统内的内容物通过搅拌子和一个 60 位搅拌板持续搅动，以促进培养体系的均一性。本方案针对每个腔室 15 mL 的工作体积进行了优化，但每个生物反应器可根据实验需求容纳 1–20 mL 的体积范围。蠕动泵及其泵管可支持 0.016 至 2.9 mL/min 的流速范围，分别对应约 15.63 至 0.09 h 的换液速率。尽管该系统适用于多种培养基配方以及膳食或营养添加剂，但仍需考虑一些实际因素：高黏度培养基可能需要重新校准流速，未溶解颗粒或不溶性成分的存在可能导致泵管或狭窄连接处堵塞，尤其在较低流速下更易发生。系统的模块化设计允许通过调整培养基选择、样品采集方式、流速和工作体积，快速便捷地定制实验方案。结合四台 24 通道蠕动泵和两台 60 位搅拌板，该系统可在单个厌氧舱内同时运行 48 个独立腔室，支持高通量厌氧筛选。

本方案是本实验室先前发表的MBRA组装与操作方法的可视化指南及更新版本4。我们已引入多项关键改进，以提高实验的可重复性、简化操作流程并最大限度减少污染。首先，现对聚四氟乙烯（PTFE）吸管进行化学蚀刻处理，防止其脱落并掉入生物反应器腔室中。其次，在进液管路中新增一根培养基导向吸管，使培养基直接流入腔室底部，避免液体沿腔室壁滴落——这曾是生物膜形成的一个已知来源。第三，C-flex管路的长度已实现标准化并缩短，同时设计了3D打印的管路固定架，使整体装置更紧凑、更有序。最后，生物反应器在每次使用之间不再完全拆解，显著降低了重复实验所需的时间和材料成本。这些及其他逐步优化措施，反映了本实验室在多个项目中长期广泛使用该系统后所进行的迭代式改进。

方案

注意：本方案适用于制备和组装单个 MBRA 条带（图1）。每个 MBRA 由一个3D打印的生物反应器、用于输送培养基的进液管路以及用于排出生物反应器腔室废液的出液管路组成。构成单个 MBRA 的所有组件完整清单（包括图片）见表1。所需其他设备包括两台蠕动泵和一个搅拌平台（具体设备信息见材料表）。

1. 预组装准备

  1. 聚四氟乙烯（PTFE）蚀刻
    注意：尽管聚四氟乙烯的化学性质使其非常适合用于本MBRA系统，但其润滑性导致仅使用环氧树脂无法将其与其他生物反应器部件牢固粘接。为了将PTFE管固定在螺纹公鲁尔接头中，必须首先对其进行化学蚀刻，以便环氧树脂能够实现粘接。需使用氟碳蚀刻剂（参见材料表）。图2A 提供了用胶带包裹PTFE管以辅助蚀刻过程的可视化指导。
    1. 裁剪12段长度为25 mm的PTFE管。其中6段将在蚀刻后切成两半，用作进液管线的吸管（"培养基吸管"）。
      注意：仅需对将要粘接的部分进行蚀刻。为防止蚀刻液接触管内表面或非目标区域，必须在管子两端用胶带密封。
    2. 使用通用实验室标签胶带（19 mm宽），将胶带完全缠绕在管子顶部，覆盖约5 mm的PTFE管（图2A）。再用另一段胶带缠绕底部，覆盖约10 mm的PTFE管（图2A）。
    3. 用力捏紧胶带两端，防止蚀刻液进入PTFE管内部（图2A）。这样应使约10 mm长的PTFE管段暴露出来用于蚀刻。
    4. 准备四种溶液：加热至55 °C的氟碳蚀刻剂溶液（氟碳蚀刻剂溶液的详细信息见 材料表）、100%乙醇（EtOH）、加热至70 °C的蒸馏H2O，以及加热至70 °C的含2–5%乙酸的蒸馏H2O。
      警告：氟碳蚀刻剂溶液具有强腐蚀性。所有操作必须在通风橱内佩戴个人防护装备（PPE）进行。化学品废弃物应按照机构规定处理。
    5. 将所有溶液加热至步骤1.1.4中指定的温度。氟碳蚀刻剂溶液应在水浴中加热，其他溶液可在加热板上加热。将溶液分别倒入4个足够深的玻璃容器中，确保能完全浸没已贴胶带的管子。
    6. 将所有PTFE管浸入氟碳蚀刻剂溶液中，轻轻搅动以确保表面均匀接触。浸泡1分钟，直至蚀刻表面变为棕色。
      注意：可使用金属滤网勺在不同溶液之间转移PTFE管。
    7. 将管子转移至乙醇（EtOH）浴中处理5–20秒。
    8. 将管子转移至70 °C的H2O浴中处理15–30秒。
    9. 将管子转移至70 °C的含2–5%乙酸的H2O浴中处理1分钟。
    10. 取出管子并放置在通风橱内的吸水垫上。让蚀刻后的管子干燥过夜（至少16小时）。干燥后，从蚀刻管上移除胶带。
    11. 蚀刻后的PTFE管即可用于粘接，并可在室温下保存数月仍保持可粘接性。一旦蚀刻表面的棕色褪去，则不再具备粘接能力。
      注意：切勿将蚀刻后的PTFE暴露于紫外光下，否则会破坏蚀刻效果。
    12. 将6根已蚀刻的PTFE管各切成两半，作为进液管线的吸管（图2A）。
  2. 环氧树脂固定废液管和培养基吸管
    1. 将6根已蚀刻的PTFE废液管和6根已蚀刻的PTFE培养基吸管分别插入对应的螺纹公鲁尔接头中。确保蚀刻面与公鲁尔接头底部对齐（图2）。
    2. 在称量皿或培养皿中按1:1比例混合环氧树脂与固化剂。使用1 mL移液器吸头，在螺纹公鲁尔接头与PTFE管连接处的基部周围涂抹环氧树脂。
    3. 将各组件垂直放置，使环氧树脂固化24小时。
      注意：空的1 mL移液器吸头盒可很好地用于固定组件使其保持直立。

2. MBRA 组装

  1. MBRA 及部件准备
    1. 确保微型生物反应器阵列条带已通过3D打印制备（参见 补充文件 1）并包含6个独立的生物反应器腔室。每个腔室具有三个¼英寸端口，需进行攻丝以安装接头。使用¼英寸-28NF细牙丝锥配合T型手柄丝锥扳手进行攻丝。
      注意：攻丝端口时建议使用导向夹具，以确保螺纹垂直。
    2. 穿线完成后，用清水冲洗每个生物反应器腔室，以去除任何塑料残留物。向每个腔室中加入一根10 mm × 3 mm的磁力搅拌子和1 mL蒸馏水。蒸馏水有助于灭菌过程中高压蒸汽灭菌的进行。
    3. 在生物反应器每个端口的上方放置一个橡胶垫圈。对于每个腔室，按照图示，将1根废液管用螺纹公鲁尔接头、1根培养基管用螺纹公鲁尔接头和1根空管用螺纹公鲁尔接头分别拧入各个端口。 图2B.
    4. 将6个橡胶隔垫插入3/32英寸雌性鲁尔接头。将隔垫的上部套筒向下折叠，覆盖接头颈部。将这些隔垫连接至各腔室所示端口 图2B.
    5. 裁剪C-flex管材，长度分别为：2 3/8英寸、3 11/16英寸、5 1/4英寸、6 1/2英寸、7 13/16英寸和9英寸 （废液管路和进样管路各需要两根该长度的管子）。切割完成后，将1/8英寸的雌性鲁尔凸接头连接至每根管子的一端，另一端则连接雄性鲁尔锁紧接头。
      注意：此处使用的长度经过优化，旨在减少杂乱，并适用于距离搅拌板约1英寸的泵。根据所需的装置设置，可能需要更长的长度。
    6. 将1/16英寸雌性鲁尔接头插入红色2-止动E-lab管（内径1.14 mm）和橙色2-止动E-lab管（内径0.89 mm）的每一端。每条MBRA条重复此操作六次。
      注意：为便于插入1/16英寸雌性鲁尔凸头接头，可将E-lab导管末端短暂浸入接近沸水中，以软化塑料。
    7. 将E-lab管路连接至步骤2.1.5中准备好的C-flex管路。每段C-flex管路应连接一条红色和一条橙色的E-lab管路 通过 雌性鲁尔接头
    8. 剪取21段1英寸、1段2英寸、3段3英寸和1段12英寸的C-flex管。将一段3英寸管和12英寸管的两端分别连接一个1/8英寸雌性鲁尔凸头接头和一个雄性鲁尔锁紧接头。其余管段的两端均连接雄性鲁尔锁紧接头。这些管段将用于组装废液管路和进样管路树状组件。
  2. 废液管路组件
    1. 遵循所示的3D示意图 图3B 组装废液管路系统。
    2. 将红色双止口E-lab管（内径1.14 mm）暴露的末端连接至已组装的废液管路分支末端的雄性鲁尔锁接头。根据C-flex管连接至双止口E-lab管的长度，按升序依次连接。将一端带有1/8英寸雌性鲁尔卡套和雄性鲁尔锁接头的3英寸C-flex管连接至废液管路分支的顶部。
  3. 进料管线树组件
    1. 遵循所示的3D示意图 图3A 组装进料管线树。
      注意：进液管路树中未使用废液管路树中的公对公鲁尔接头。根据我们的经验，这些接头容易发生泄漏，且易松动，从而增加生物反应器腔室和培养基瓶的污染风险。为降低此风险，进液管路树的构建未包含此类组件。
    2. 将橙色双止动E-lab管（内径0.89 mm）暴露的末端依次连接至已组装的进液管路树末端的雄性鲁尔锁接头，连接顺序应根据C-flex管与双止动E-lab管相连的长度由短到长进行。将12英寸C-flex管连接至进液管路树的顶部。
  4. 完整组装：将制备好的组件整合至MBRA培养系统中。
    1. 将可变长度的C型柔性管按从短到长的顺序依次连接至进料管路系统的末端，并对应连接至生物反应器，最短的管路置于生物反应器条带的左侧，最长的置于右侧。
    2. 将可变长度的C型柔性管按从长到短的顺序依次连接至废液管路分支末端的生物反应器条带上，最长的管路置于左侧，最短的置于右侧。最短的废液管位于生物反应器条带的右侧，因其最靠近废液泵；相反，最长的补料管位于右侧，是因为补料泵位于左侧图1).
  5. 组装阵列的灭菌：为组装好的系统进行灭菌准备。
    1. 将MBRA左侧的所有C-flex进样管路捆扎在一起，并用扭结扎带固定。同样，将条带右侧的废液管路也进行捆扎并用扭结扎带固定。
    2. 在C-flex管路之间用橙色双止动E-lab管形成一个环路，使用 autoclave 胶带固定该环路。在生物反应器条的废液侧，对红色双止动E-lab管进行相同操作。这有助于在灭菌过程中节省空间。
    3. 用铝箔覆盖废液管路和进液管路树末端的雌性鲁尔接头，以防止从高压灭菌器中取出后受到污染。松开每个生物反应器腔室上带隔垫的雄性螺纹鲁尔接头，以便在高压灭菌过程中使蒸汽逸出。
      注意：此步骤至关重要，可确保在高压灭菌过程中蒸汽能够从生物反应器中排出。若未正确排气，可能导致生物反应器腔室破裂。
    4. 将MBRA放入高压灭菌桶中，并将进液管路和废液管路分别拉直，置于盛放MBRA的桶旁的独立容器中。若在高压灭菌过程中，靠近1/16英寸雌性鲁尔接头的E-lab管路或任何C-flex管路段发生折弯，可能导致管路堵塞，阻碍培养基或废液的流动。
    5. 在121 °C、≥15 psi条件下高压灭菌25分钟。使用适用于液体循环的慢速排气程序。灭菌结束后，使生物反应器在室温下冷却。MBRA充分冷却后，重新拧紧带隔垫的螺纹公路易接头。
      注意：灭菌后的生物反应器条带若受压会变软并易发生开裂。请留出足够冷却时间，再拧紧接头。
      注意：橙色的2-stop E-lab导管在高压灭菌过程中容易发生开裂，并可能从1/16英寸雌性鲁尔接头处脱落。若出现开裂，需用70%乙醇喷洒导管两端，然后用无菌刀片切除开裂端，并将导管重新连接至鲁尔接头。或者，可将带有1/16英寸雌性鲁尔接头的额外E-lab导管单独装入高压灭菌袋中进行灭菌，之后整根更换导管。

3. 培养基与废液瓶组装

  1. 培养基瓶组件
    注意：在本示例中，整个系统由一个2L的瓶子供液。请参见图4A以查看培养基瓶盖组件的示意图。
    1. 将Dibafit接头（瓶盖适配器）旋入Q系列瓶盖顶部的两个螺纹接口中。在一个接头上连接一段3英寸长的C-flex管，另一个接头上连接一段12英寸长的C-flex管。在每段管子的末端安装一个雄性鲁尔锁接头。
      注意：连接至MBRA进液管路树所需的管子长度可能有所不同，可根据实际情况进行调整。
    2. 截取一段12英寸长的PTFE管，作为吸取培养基的吸管。使用剃刀片将管的一端切成45°斜角，以防止瓶壁堵塞。将PTFE管插入瓶盖底部的小孔中，该孔连接至12英寸长的C-flex管。
    3. 截取一段2英寸长的C-flex管，在一端安装雌性鲁尔卡套接头，另一端安装雄性鲁尔锁接头。将此管段连接到最终将接入进液管路树的12英寸管段上。用一个止流夹固定该2英寸管段，并将止流夹的环套在瓶盖的3英寸管上。这将作为临时堵头，防止灭菌过程中及之后发生培养基泄漏。
    4. 配制所需培养基。将完全组装好的瓶盖安装到培养基瓶上。将12英寸长的C-flex管绕在瓶身周围，并如上所述用2英寸管上的止流夹固定其末端。不要将瓶盖拧得太紧，应略微松动，以避免灭菌过程中产生压力积聚。
    5. 用铝箔包裹从瓶盖引出的3英寸管末端。根据培养基的灭菌规程选择适当的灭菌时间进行高压灭菌。灭菌完成后，移除3英寸管末端的铝箔，并在雄性鲁尔锁接头上旋入一个0.22 µm的一次性针筒滤器。这可在泵送过程中允许空气进入培养基瓶，同时防止污染。
      注意：使用前请确保Q系列瓶盖已牢固密封在瓶子上，因为密封不良可能导致液体流动不畅。
  2. 废液瓶组件：为避免每天更换废液瓶，实验室设计了一种分级式废液收集系统（图4B），可在实验期间依次填满多个2L废液瓶。该分级废液系统的组装步骤如下：
    1. 将瓶盖适配器旋入Q系列瓶盖顶部的两个螺纹接口中。根据所需废液储存瓶的数量，重复此步骤2–4次。
    2. 为每个瓶盖截取一段2英寸长的PTFE管。将该管段插入瓶盖中指定用于将废液排至系统下一瓶的孔内。
    3. 截取一段足够长的C-flex管，使其能从泵引出的废液管路树延伸至废液瓶系统所在位置。在靠近废液管路树的一端安装雄性鲁尔锁接头，并将另一端连接至瓶盖适配器（该瓶盖上无PTFE管）。
    4. 再截取一段C-flex管，用于连接第一和第二个废液瓶的瓶盖。将管子一端连接至第一个瓶盖适配器（该瓶盖上有PTFE吸管），另一端连接至第二个瓶盖适配器（该瓶盖上无PTFE吸管）。
      注意：在分级废液瓶级联系统中，每个后续瓶子的位置必须高于前一个，以便利用重力促进废液从一个瓶子流向下一个（图4B）。建议将所有瓶子放置在一个次级容器内（例如开口的塑料储物箱），并使用垫高物（如倒置的锐器盒）按高度递减顺序排列。
    5. 根据需要重复上述连接方式，形成更长的级联系统。在最后一个瓶子上，将一段3英寸长的C-flex管（末端带雄性鲁尔锁接头）连接至未使用的瓶盖适配器，然后连接一个20 mL注射器，以施加负压并促进废液的级联排放。

4. MBRA 的连接、操作与拆卸

  1. 连接泵
    1. 移除固定废液管和进料管 E-lab 管路的高压灭菌胶带。解开 C-flex 管路的捆扎。
    2. 将 MBRA 置于搅拌板顶部的两个泵之间。可使用 3D 打印支架将其固定在板上（参见补充文件 2）。确保其与搅拌板上标明的搅拌位置对齐。
    3. 将进料管线的 E-lab 管路连接至蠕动泵的泵头。将 E-lab 管路的限位端插入泵头的插槽中。对位于搅拌板右侧泵上的废液管线 E-lab 管路进行相同操作。
    4. 将蠕动泵泵头锁定在泵体中。确保泵头完全贴合泵体，且管路位于泵头通道内。
      注意：仅在计划 24 小时内启动流体流动时才将泵头锁紧。若泵头夹紧后超过 24 小时未通培养基，管路可能被压扁并堵塞。若发生此情况，只需松开夹具，并在受压部位轻轻按摩管路即可。
    5. 使用 3D 打印的管路支架整理 C-flex 管路（补充文件 3）。
    6. 将废液支管末端连接至通向废液瓶的管路。
      注意：当运行多个 MBRA 时，需在连接至废液瓶管路前将各废液支管合并分叉。可通过为每个额外的 MBRA 创建简单的分支结构实现。
    7. 将进料管线入口管的雌接头连接至培养基瓶盖上 12 英寸管的雄接头。
      注意：此时两端均应保持无菌。避免用手或其他潜在污染源接触。若怀疑污染，连接前应将两端浸泡于 10% 次氯酸钠溶液中 10 分钟。
    8. 启动两个泵以开始培养基流动。确保泵的流向正确（若废液管位于泵右侧，则两个泵均应设置为顺时针（"CW"）方向）。
    9. 观察落入每个生物反应器腔室的培养基液滴的大小和频率；若存在显著差异，可能表明流速不均。若发现流速不均，建议更换与异常腔室相连的橙色双限位 E-lab 进料管。这有助于在实验运行中减少流速波动。
      注意：此时应诊断并修复系统中的任何泄漏，因此需密切监控初始填充过程。
    10. 当生物反应器腔室充满后，关闭两个泵，使生物反应器静置 24–48 小时。此步骤对于在实验开始前检测腔室中是否存在潜在污染至关重要。
  2. MBRA 接种
    注意：此处描述的是对隔膜进行灭菌并注入接种物的基本操作流程。
    1. 根据所需条件准备接种物。
    2. 使用塑料滴管将新配制的 10% 次氯酸钠溶液滴加至每个生物反应器腔室的隔膜顶部。滴加足量溶液以完全覆盖隔膜表面，静置 10 分钟。随后用无菌实验室擦拭纸擦干隔膜。
    3. 使用一支 3 英寸长的 22 号针头和装有样品的注射器，刺穿隔膜中心。确保针头接触腔室内的培养基，然后将接种物注入生物反应器腔室。通过抽出部分培养基再重新注入腔室的方式冲洗注射器。拔出针头后，将其放入锐器容器中处理。
    4. 根据实验设计，在启动流动前让接种物生长适当时间。例如，粪便细菌群落需要 4–16 小时的初始批次培养，以增加足够的生物量8。
    5. 根据所需的更换时间，将两个泵开启至目标流速。有关流速的更多信息，请参阅蠕动泵使用手册。
      注意：无论目标流速如何，废液泵的运行速度应始终高于培养基泵，以确保生物反应器腔室不会溢出。在我们进行胃肠道细菌群落培养时，采用 1.92 mL/h 的更换速率，通过将培养基泵设为 1.0 rpm、废液泵设为 2.0 rpm 实现。
    6. 再次观察落入每个生物反应器腔室的培养基液滴的大小和频率，若存在显著差异，可能表明流速不均。若发现流速不均，建议更换与异常腔室相连的橙色双限位 E-lab 进料管。这有助于在实验运行中减少流速波动。
  3. MBRA 取样
    1. 将 10% 次氯酸钠溶液滴加至每个生物反应器腔室隔膜顶部，用量应足以完全覆盖表面。静置 10 分钟后，用无菌实验室擦拭纸擦干隔膜。
    2. 使用一支 3 英寸长的 22 号针头和注射器，刺穿隔膜中心并将针头完全插入生物反应器腔室。持住注射器，回拉活塞以从腔室中抽取样品。
      注意：单次取样量不应超过生物反应器腔室总体积的 20%。超过此量可能导致微生物群落失衡，因为废物流出将在新鲜培养基重新填充至 PTFE 废液吸管液位前被中断。
    3. 拔出针头，将样品排入适当的容器中。将针头放入锐器容器中处理。
  4. MBRA 拆卸与翻新
    注意：实验结束后，需对 MBRA 进行灭菌处理，以便用于后续实验。
    1. 将进料入口更换为 1 L 的 10% 次氯酸钠去离子水（DI 水）溶液。将两个泵的流速调至最大，以用次氯酸钠溶液置换生物反应器腔室中的内容物。
    2. 当腔室变透明（所有培养基已被次氯酸钠溶液替换）后，将 MBRA 倒置，使填充线以上部分消毒 5 分钟。5 分钟后将装置复位，再静置 5 分钟完成灭菌。
      注意：请勿让次氯酸钠溶液停留超过上述 10 分钟，否则会导致塑料变色以及培养基和废液管路强度下降。
    3. 将 10% 次氯酸钠溶液更换为 1 L 去离子水。用去离子水冲洗系统，直至全部水流通过。断开生物反应器 E-lab 管路与泵的连接，并取下 MBRA。
    4. 进行翻新时，移除各腔室中已使用的隔膜及除 1 mL 外的所有水分。
    5. 更换新的隔膜和橙色双限位 E-lab 管路，并重复前述步骤（2.5.1 至 2.5.5）进行高压灭菌准备，最多可重复 3 次。第三次重复使用后，应完全拆解 MBRA，更换 C-flex 管路，并对各个部件使用 70% 乙醇灭菌或更换损坏部件。多次高压灭菌循环后，固定废液和进料 PTFE 管的环氧树脂会变脆，需重新涂抹。
      注意：每次运行之间均需更换橙色双限位 E-lab 管路，以减少因磨损和反复高压灭菌循环导致的流速波动。

结果

为了促进胃肠道等来源的厌氧菌生长，可在厌氧环境中搭建并运行MBRA系统。为展示直接从人体相关部位培养复杂细菌群落的能力，本实验制备了一个人类粪便样本并在该系统中进行培养。所有操作均在设定为37°C的厌氧环境中进行，菌群在我们的生物反应器培养基BRM37中培养。

通过在厌氧条件下解冻人粪便，然后与磷酸盐缓冲盐水（PBS）混合，制备成终浓度为25%（w/v）的粪便悬液。确认无菌后，将9个生物反应器腔室分别接种3 mL相同的粪便悬液。微生物群落在无培养基输入和废物清除的条件下培养过夜，形成9个独立的分批培养体系，持续16小时。随后启动进料泵，设定流速为1.92 mL/h。连续流动培养四天后，从生物反应器中采集样品，采用16S rRNA基因测序分析微生物群落组成，并在QIIME 2中使用Deblur进行去噪处理，结合SILVA 138 SSU数据库进行分类学注释13。在所有9个重复样本中共检测到65个属，但生物反应器中的群落主要由18个属主导，每个属在任意一个重复样本中的相对丰度均不低于2%（图5）。生物反应器表现出高度可重复性，65个属中有22个在全部9个重复中均被检测到，另有17个属在至少一半的重复中出现。在至少一个反应器中未检出的43个属中，大多数（37个属）为稀有物种，其在生物反应器中的相对丰度均低于2%。综上所述，连续流动的MBRA培养系统能够支持来源于同一样本的复杂且可重复的微生物群落，即使各生物反应器腔室经历了16小时的独立分批培养后仍保持稳定。

显示进料和废液管路系统的生物反应器示意图，展示实验流程系统的设置。
图1：微型生物反应器阵列（MBRA）。完全组装好的MBRA，包括进料和废液管路系统、生物反应器腔室以及生物反应器条带的标签。请点击此处查看该图的放大版本。

实验室装置中培养基和废液管理用的聚四氟乙烯管路制备及吸管组装示意图。
图2：聚四氟乙烯（PTFE）刻蚀指南及MBRA端口布局。（A）用于培养基和废液聚四氟乙烯吸管刻蚀的操作流程图。（B）每个生物反应器腔室均包含一个用于培养基吸管加螺纹公鲁尔接头的端口、一个用于废液吸管加螺纹公鲁尔接头的端口，以及一个用于隔垫加螺纹公鲁尔接头的端口。请点击此处查看该图的放大版本。

用于流体动力学研究和系统设计的模块化管道配置示意图。
图3：MBRA进料管路与废液管路系统示意图。 组装（A）进料管路系统和（B）废液管路系统的代表性示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

废液 containment 装置示意图；图中显示从一级到三级 containment 及连接点。
图 4：培养基瓶盖与废液分级收集系统。（A）组装好的 Q 系列瓶盖示例，用于将培养基吸入 MBRAs。（B）废液分级收集系统的图像。请点击此处查看该图的放大版本。

不同反应器中微生物群落的相对丰度图和多样性箱线图。
图 5：细菌属的相对丰度。（A）堆叠柱状图显示了在任一样本中相对丰度至少达到 2% 的所有属的组成情况。（B）九个生物反应器腔室之间的观测 OTU 数和 Shannon 多样性指数的 α 多样性指标。所有九个生物反应器腔室均接种了由人粪便制备的相同粪便悬液。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：MBRA组件。完全组装MBRA所需的所有单个部件的图像和描述，以及每个组件所需的数量。请点击此处下载该表格。

表2：故障排除指南。 运行MBRA过程中可能遇到的常见问题，及其潜在原因和推荐解决方案。请点击此处下载该表格。

补充文件 1：用于 3D 打印微型生物反应器阵列条的 Stl 文件。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：用于3D打印生物反应器支架的Stl文件，该支架用于将生物反应器固定在搅拌板上。请点击此处下载该文件。

补充文件 3.：用于 3D 打印管架的 Stl 文件，该管架用于整理从 MBRA 延伸出的 C-flex 废液和进液管路。请点击此处下载该文件。

讨论

本方案描述了用于细菌群落高通量培养的微型生物反应器阵列（Minibioreactor Array, MBRA）的完整组装及基本操作流程，并对先前发表的方法进行了多项关键性优化。MBRA 系统仍是一种多功能且成本低廉的工具，可支持研究人员并行培养复杂的微生物生态系统，并实现大量实验重复。在本更新版本中，我们引入了若干改进措施，以提高实验可重复性、简化操作流程并降低污染风险。这些改进包括采用化学蚀刻的聚四氟乙烯（PTFE）吸管（图2）以防止其脱落，在培养基管线上增设进样吸管（图2）以减少生物膜形成，使用标准化长度的管路并配合3D打印的管路固定架（补充文件3），使装置更紧凑、布局更有序，以及优化了重复使用方案，避免了实验间完全拆卸的需要。上述优化措施是在本实验室长期、广泛地将MBRA系统应用于多种不同实验场景过程中逐步发展完善的。通过对关键组装步骤和实际操作改进的详细阐述，本文强调了MBRA 作为微生物组研究中持续演进的模型系统的实用价值。

MBRA 系统的成功运行在很大程度上依赖于组件的精确组装和灭菌，以确保无污染操作。关键步骤包括正确安装 Q 系列瓶盖、管路和连接件，这些部件支持模块化组装，并实现培养基输入和废液收集。确保培养基瓶、废液储液罐与生物反应器腔室之间形成严密密封，对于防止泄漏并维持无菌环境至关重要。另一个关键步骤是在实验前验证蠕动泵的流速，因为流速不一致可能导致培养基输送不均，进而影响微生物的生长动态。大多数使用盒式结构的多通道蠕动泵都配有压扁度调节机制，应利用该机制对每个通道的流速进行精细调节。即使经过正确校准，E 型实验管路仍是变异性的主要来源。为减轻这一问题，在初始填充阶段以及实验开始时，必须目视监测进入每个生物反应器腔室的培养基液滴的频率和大小。这些目视检查有助于及早发现可能影响实验可重复性的流速异常。表 2 提供了在 MBRA 组装和使用过程中常见问题的故障排除策略。这些故障排除步骤可确保实验间的可重复性，并防止长期培养过程中出现中断。

尽管MBRA系统具有优势，但在设计实验时也必须考虑其某些局限性。与更先进的系统相比，MBRA缺乏主动监测功能，例如实时光密度（OD）测量、pH控制和温度调节。这种主动测量能力的缺失限制了系统对微生物生长和代谢活性动态变化的实时监测能力。此外，虽然该系统支持在培养腔内进行厌氧培养，但未配备集成的气体控制系统，这可能限制其在需要精确微需氧或富含CO2环境中的应用。对于需要此类控制的研究，采用内置气体调控功能的其他系统可能更为合适。

MBRA 系统相较于现有的生物反应器模型具有多项关键优势，包括高通量、可扩展性和成本效益，同时仍能维持在连续流动条件下培养复杂的细菌群落，以模拟人类胃肠道等动态环境6,8,10。其紧凑且模块化的设计支持多个生物反应器同时运行，非常适合高通量研究，例如筛选粪便来源的微生物群落对病原体入侵的抗性9。该模块化设计提供了广泛的实验灵活性：每个反应条可通过一个培养基瓶供液（如本方案所示），也可由最多六个不同的培养基来源分别供给，每个生物反应器腔室对应一种。工作体积由插入每个腔室废液口的细长聚四氟乙烯（PTFE）废液管长度决定，该长度设定了液面高度；在本方案中，25 mm 的废液管维持 15 mL 的工作体积，但通过裁剪或延长废液管，可实现 1–20 mL 范围内的不同体积。此外，较短的进液管插入培养基入口，以引导流入液体朝向腔室底部，防止培养基沿腔壁流下，从而减少液面以上区域的生物膜形成。泵的转速或泵管直径也可调节，以改变系统的更新速率。迄今为止，MBRA 系统已广泛用于研究微生物群落在多种因素影响下的功能与组成变化，包括抗生素10、癌症药物14以及多种膳食成分12,15,16,17。其结构简单且模块化的设计使其易于根据各种实验需求进行改造。例如，MBRA 已被改进用于在类似恒化器的条件下研究生物膜18，展示了其在浮游培养之外的微生物生态学研究中的广泛适用性。

MBRA 系统的未来迭代版本可通过进一步的工程改进，提升其功能、精确性和通量潜力。其中一项改进是在每个生物反应器腔室中增加额外的端口。这些端口可用于主动监测环境参数，如 pH、温度、气体或光密度，从而通过实现实时反馈与监测，解决该模型目前最主要的局限之一。优化腔室或端口的几何结构，可促进更彻底且便于操作的清洗，减少残留物积聚和变色，提高长期重复使用的可行性。集成更多带有可编程定时器的蠕动泵，可实现脉冲式或昼夜节律性的培养基输入，更真实地模拟宿主相关环境，例如人体肠道中的进食周期。最后，采用替代材料（如耐化学腐蚀、可高压灭菌的聚合物）进行 3D 打印，可能显著增强系统的耐用性，并提高与更广泛试剂的兼容性。这些改进措施共同作用，有望大幅拓展 MBRA 平台的实验范围和模拟保真度。

综上所述，MBRA 提供了一个功能强大、高通量的平台，可在受控条件下培养并研究微生物群落。尽管其在实时监测和 pH 控制方面存在局限性，但凭借其灵活性、可扩展性和成本效益，MBRA 已成为多种微生物学研究中不可或缺的工具，尤其适用于需要高重复性和高实验通量的研究。重要的是，该系统的模块化设计和制造方法使其具有内在的适应性；研究人员已经并可继续根据多种实验目标对 MBRA 进行定制。这种适应性确保了 MBRA 能够随着新兴科学问题和技术的发展而持续演进，保持其作为微生物组研究多功能平台的相关性与实用性。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）T32传染病分子基础博士前培训项目（NIH T32DK007664）以及NIH U19AI157981“黏膜表面微生物组发现与对抗抗生素耐药性的机制研究”项目的资助。

作者感谢 Hayden Curnyn 在本系统所用生物反应器支架和管路支架的设计与制造方面所做的贡献。

图2和图3部分使用 https://BioRender.com 制作

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 V-Tap 指南，标准尺寸 0-80 至 5/8"Big Gator ToolsSTD500NP 
0.22 μm 注射器滤器FisherSLGVR33RS
2mag MIXdrive 60 搅拌驱动器（仅驱动单元）2MAGMF 41060
Air-tite 皮下注射针头，22G ×3"VWR89219-274
BD 1 mL Slip Tip 无菌注射器 无菌Fisher14-823-434
生物反应器Proto-LabsNA使用DMS Somos Watershed塑料3D打印而成。模板见补充文件1
生物反应器支架Proto-LabsNA使用PA 12黑色材料3D打印而成。模板见补充文件2。
Diba Omnifit Q系列溶剂瓶盖，GL38/38-430（玻璃），2个UNF(F)接口无阀门，蓝色Cole ParmerEW-21942-86
Diba Omnifit 管路，PTFE 材质，1/8 英寸" (3.2 mm) 外径 × 1.5 mm 内径Cole ParmerEW-21942-76
Dibafit 适配器，1/4"-28 UNF（M）平底转3.2 mm内径，聚醚醚酮（PEEK）Cole ParmerEW-21941-49
IRWIN 12001ZR 扳手 #0-1/4" T型手柄亚马逊B00004YOB0
Irwin Hanson 高碳钢 SAE 分数丝锥 1/4 英寸 1 支佐罗G7695682
Loctite 重型环氧树脂快速固化胶 8液盎司瓶装亚马逊B0044F59N0
雄性至雄性鲁尔锁接头达尔文微流控DM-MM-LUER-PP 替代方案：Strategic Applications Inc 两通鲁尔接头（公对公）- 10个/包 - Fisher - NC9876577
Masterflex 接头配件，鲁尔接头转鲁尔接头，尼龙材质，AvantorVWRMFLX45502-56
Masterflex 接头，尼龙材质，直型，雌性鲁尔接头转软管接头，1/16" IDVWRMFLX45502-00
Masterflex 接头，尼龙材质，直型，雌性鲁尔接头转软管接头，3/32" IDVWRMFLX45502-02
Masterflex 接头，尼龙材质，直型，雌性鲁尔接头转软管接头，1/8"VWRMFLX45502-04
Masterflex 接头，尼龙材质，直型，公型鲁尔锁扣转软管接头，1/8VWRMFLX45505-04
Masterflex 接头，尼龙材质，直型，公鲁尔接头 × 1/4-28 UNFVWRMFLX45505-82
Masterflex 接头，聚丙烯，弯头，雌性鲁尔接雌性鲁尔适配器VWRMFLX45508-26
Masterflex Ismatec 泵管，2-通道，Tygon S3 E-Lab，内径 0.89 mmVWRMFLX96460-26
Masterflex Ismatec 泵管，2-滚轮，Tygon S3 E-Lab，内径 1.14 mmVWRMFLX96460-30
Masterflex® 转移管，C-Flex材质，不透明白色，1/8英寸" ID x 1/4" OD；25 英尺VWRMFLX06424-67
莫尔’用于管路的止血夹 VWR470201-374
氯丁橡胶护舷垫圈 ½” OD x ¼” ID x 1/16” 厚度 亚马逊B01A29F1R0
精密密封橡胶隔垫Sigma AldrichZ553905
Spinbar 微型搅拌子VWR58948-375
四重蚀刻R.S. Hughest 公司TE-500
管路固定架Proto-LabsNA使用PA 12黑色材料3D打印而成。模板见补充文件3。
Watson-Marlow 205S 多通道盒式泵Watson-Marlow020.3724.00A已停用，替代产品：Ismatec IPC 数字式蠕动泵 MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 或 Masterflex Ismatec IPC 蠕动泵，转速范围 0.1 至 11.25 rpm，24 通道，115/230 VAC，Avantor，VWR，MFLX78006-48-CH

参考文献

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