用于组装和使用微型生物反应器阵列 （MBRA） 的更新协议

Summary

微型生物反应器阵列 （MBRA） 是一种高通量、可定制的连续流培养系统，能够培养复杂的微生物群落，支持并行实验以研究微生物组动力学、治疗相互作用和微生物对环境因素的反应。

Abstract

人类微生物组由多样化和动态的微生物群落组成，在宿主健康中发挥着重要作用。了解这些群落及其对环境因素的反应对于推进基于微生物组的治疗至关重要。用于培养人源性微生物群的传统 体外 模型通常缺乏可扩展性，并且需要广泛的技术专业知识，从而限制了其可及性和通量。为了解决这些限制，我们开发了微型生物反应器阵列 （MBRA） 系统——一种模块化、单级、连续流平台，用于微生物群落的高通量培养。该系统能够并行培养多达 48 个不同的微生物群落，支持实验灵活性，同时保持复杂生态系统的稳定增长。该协议提供了有关 MBRA 制造、组装、灭菌和作的详细指导。该系统的模块化设计允许轻松集成到厌氧室中，并支持针对各种实验应用进行定制。它已被用于研究微生物对抗生素、膳食化合物和病原体入侵的反应，并筛查病原体耐药群落。凭借其可访问性、可扩展性和可重复性，MBRA 代表了研究微生物相互作用和推进微生物组研究的强大模型系统。

Introduction

人类微生物组是一个复杂的微生物生态系统，在众多生理过程中发挥着关键作用，并深刻影响着人类健康。人类微生物组跨越我们全身的许多解剖部位，每个部位都包含动态微生物群落，以我们尚未完全了解的方式积极相互作用¹.扩展我们对微生物群落参与健康和疾病的了解取决于我们对这些环境中发生的微生物相互作用的理解¹.为了有效地研究和纵这些复杂的系统以达到治疗目的，需要采用还原论方法。使用简化的模型系统探索个体微生物相互作用有助于更好地理解微生物组的全部复杂性²。

有多种模型系统可用于培养人源性微生物群落。这些系统加深了我们对人类相关微生物群落的理解，范围从单阶段批量培养到更复杂的多阶段连续流动系统。模型系统，如人类肠道微生物生态系统模拟器³、双血管单级趋化器系统⁴ 和肠道微生物群环境控制系统⁵ ，复制了特定解剖部位的生理条件，并 提供了微生物环境 的近似体外近似值。然而，微生物学家对它们的采用受到限制，因为它们成本高昂，需要高水平的技术专长来运行和维护，并且吞吐量有限。

为了应对这些挑战，我们开发了微型生物反应器阵列（MBRA）系统——一种连续流的单级培养系统，旨在促进来自不同来源的微生物群落在受^{控环境中的}稳定生长^6,7,8。MBRA 系统以其组装和作的简单性以及高通量能力而从其他肠道模型中脱颖而出，允许同时培养多个微生物群落，从而提高实验效率。此外，该系统的简单紧凑性使其可以在厌氧和微氧室内运行，以促进厌氧和缺氧部位（例如胃肠道和阴道）的细菌生长。该系统的多功能性已被用于筛选艰难梭菌耐药胃肠道群落⁹，以及测试抗生素^10,11和膳食底物¹²对微生物群落的影响。

MBRA 是通过 3D 打印或增材制造制造的，在我们的材料选择中优先考虑透明度和防水性（有关聚合物信息，请参阅 材料表 ）。每个阵列包含六个独立的腔室，所有腔室都配备了用于培养基导入、废物导出和样品收集的端口。新鲜培养基连续供应到系统中，同时提取废物，流速由两个蠕动泵精确控制。使用搅拌棒和 60 点搅拌板不断搅拌系统中的内容物，以促进均匀培养。此处描述的方案针对每个腔室 15 mL 的工作容积进行了优化，尽管每个生物反应器可以容纳 1-20 mL 的范围，具体取决于实验要求。蠕动泵和泵管可适应 0.016 至 2.9 mL/min 的流速，分别对应于约 15.63 至 0.09 小时的周转率。虽然该系统与多种培养基配方以及膳食或营养添加剂兼容，但必须考虑一些实际考虑因素：高粘度介质可能需要重新校准流速，未溶解颗粒或不溶性成分的存在可能会堵塞泵管或狭窄的连接器，尤其是在较低流速下。系统的模块化允许通过调整介质选择、样品收集、流速和工作容积来快速、轻松地定制实验。结合四个 24 通道蠕动泵和两个 60 点搅拌板，该系统可以在单个厌氧室中运行每个实验 48 个独立的腔室，支持高通量厌氧筛选。

该协议可作为我们实验室^开发的先前发表的MBRA组装和作方法的可视化指南和更新版本4。我们采用了几项关键改进，以提高可重复性、简化工作流程并最大限度地减少污染。首先，PTFE 吸管现在经过化学蚀刻，以防止它们脱落并落入生物反应器室。其次，在进料管线上添加了介质吸管，以将介质流入腔室底部，防止介质从腔室壁上滴落。这是已知的生物膜形成来源。第三，C-flex 管的长度已标准化并缩短，并且设计了 3D 打印的管架，以创建更紧凑、更有条理的设置。最后，生物反应器不再在每次使用之间完全拆卸，从而显着减少了与重复实验相关的时间和材料成本。这些和其他增量改进反映了基于我们实验室多个项目中广泛使用该系统的迭代优化。

Protocol

注意：该协议用于制备和组装单个MBRA条带（图1）。每个 MBRA 由一个 3D 打印的生物反应器、促进生长培养基流入的管道和促进废物从生物反应器室排出的管道组成。表 1 中列出了组成单个 MBRA 的部件的完整列表，包括图像。所需的其他设备包括两个蠕动泵和一个搅拌板（有关设备细节，请参阅 材料表 ）。

1. 预组装准备

1. 聚四氟乙烯 （PTFE） 蚀刻
   注意：虽然PTFE的化学性质使其成为该MBRA系统的理想选择，但其润滑性使其无法仅使用环氧树脂与其他生物反应器部件粘合。为了将 PTFE 管固定到螺纹外螺纹鲁尔中，必须首先对其进行化学蚀刻，以允许环氧树脂粘合。使用碳氟化合物蚀刻剂（参见 材料表）。 图 2A 可作为胶带 PTFE 管的视觉指南，以促进此蚀刻过程。
   1. 切割 12 根 25 毫米长的 PTFE 管。其中六个将在蚀刻后被切成两半，作为进料线的吸管（“介质吸管”）。
      注意：只应蚀刻正在粘合的部分。为防止内表面和不需要的区域蚀刻，必须在两端用胶带粘住并密封管子。
   2. 使用通用实验室标签胶带（19 mm宽），将胶带完全缠绕在顶部，覆盖~5 mm的PTFE管（图2A）。在底部周围贴上另一段胶带，覆盖 ~10 mm 的 PTFE 管（图 2A）。
   3. 用力捏住胶带的末端，以避免蚀刻溶液到达PTFE内部（图2A）。这应该会留下 ~10 毫米的 PTFE 管路暴露在外进行蚀刻。
   4. 制备四种溶液：加热至55°C的碳氟化合物蚀刻液（碳氟化合物蚀刻液的详细信息见材料表），100%乙醇（EtOH），加热至70°C的蒸馏H₂O + 2-5%乙酸，加热至70°C。
      注意：氟碳蚀刻剂溶液具有很强的腐蚀性。使用 PPE 在通风橱中执行所有步骤。根据机构指南处置化学品。
   5. 将所有溶液加热至步骤 1.1.4 中指示的温度。氟碳蚀刻液应在水浴中加热，其他溶液可在热板上加热。将溶液倒入 4 个独立的玻璃容器中，其深度足以完全浸没胶带管。
   6. 将所有 PTFE 管浸入碳氟化合物蚀刻液中。旋转以确保均匀的表面曝光。浸泡 1 分钟，直到蚀刻表面变成棕色。
      注意：金属撇渣器过滤器勺可用于在溶液之间转移 PTFE 管。
   7. 将管子转移到 EtOH 浴槽中 5-20 秒。
   8. 将管子转移到 70 °C H₂0 浴槽中 15-30 秒。
   9. 将管子转移到 70 °C H₂0 + 2-5% 乙酸浴中 1 分钟。
   10. 拆下管道并放在通风橱内的吸水垫上。让蚀刻管干燥过夜（至少 16 小时）。干燥后，从蚀刻管上取下胶带。
   11. 蚀刻的PTFE已准备好粘合，如果在室温下储存，将保持可粘合数月。一旦蚀刻表面的棕色褪色，就不再可粘合。
       注意： 请勿将蚀刻的 PTFE 暴露在紫外线下，因为它会降低蚀刻性能。
   12. 将 6 根蚀刻的 PTFE 管切成两半，用作进料管线的吸管（图 2A）。
2. 环氧树脂废料和介质吸管
   1. 将 6 根蚀刻的 PTFE 废料吸管和 6 根蚀刻的 PTFE 介质吸管中的每一个插入各自的螺纹外螺纹鲁尔机中。确保蚀刻表面与外螺纹鲁尔的底部对齐（图 2）。
   2. 在称重船或培养皿中以 1：1 的比例混合环氧树脂和硬化剂。使用 1 mL 移液器吸头，在螺纹外螺纹鲁尔的底部与 PTFE 管路相交处涂上环氧树脂。
   3. 垂直放置每块，让环氧树脂凝固 24 小时。
      注意：空移液器 1 mL 吸头盒可以很好地将它们保持直立。

2. MBRA组装

1. MBRA 和零件准备
   1. 确保 Minibioreactor 阵列条是 3D 打印的（参见 补充文件 1）并包含 6 个独立的生物反应器室。每个腔室包含三个 1/4 英寸端口，必须通过螺纹插入配件。使用 1/4 英寸 28NF 分数丝锥和 T 形手柄丝锥扳手进行螺纹加工。
      注意： 建议在对端口进行螺纹处理时使用丝锥导轨，以确保铅垂螺纹。
   2. 穿线后，用水冲洗每个生物反应器室，以去除任何塑料残留物。向每个腔室中加入一个 10 x 3 mm 磁力搅拌棒和 1 mL 蒸馏水。水将有助于高压灭菌过程中的灭菌过程。
   3. 在生物反应器的每个端口顶部放置一个橡胶垫圈。对于每个腔室，将 1 个废吸管螺纹公鲁尔机、1 个介质吸管螺纹公鲁尔机和 1 个空螺纹公鲁尔机拧入每个端口，如 图 2B 所示。
   4. 将 6 个橡胶隔垫插入 3/32 英寸内螺纹鲁尔倒钩上。将隔膜的上袖向下折叠以覆盖颈部。将它们连接到 图 2B 中所示的每个腔室的端口。
   5. 切割以下长度的 C-flex 管条：2 3/8 英寸、3 11/16 英寸、5 1/4 英寸、6 1/2 英寸、7 13/16 英寸和 9 英寸和 9 英寸（废料管线和进料管线每个长度需要两个）。切割后，将 1/8 英寸内螺纹鲁尔倒钩连接到一端，将外螺纹鲁尔锁连接器连接到每段管子的另一端。
      注意：此处使用的长度经过优化，以减少杂乱，并适用于放置在距离搅拌板 ~1 英寸处的泵。根据所需的设置，可能需要更长的长度。
   6. 将 1/16 英寸内螺纹鲁尔倒钩插入红色 2 档 E-lab 管（1.14 mm 内径）和橙色 2 档 E-lab 管（0.89 mm 内径）的两端。对每个 MBRA 条带重复此过程六次。
      注意： 为了更容易插入 1/16 英寸内螺纹鲁尔倒钩，请将 E-lab 管的末端短暂浸入接近沸腾的水中以软化塑料。
   7. 将 E-lab 管连接到步骤 2.1.5 中准备好的 C-flex 管。6 种长度的 C-flex 管中的每一种都应通过母鲁尔 连接到 一条红色和一条橙色 E-lab 线。
   8. 切割 21 个 1 英寸的 C-flex 管、一个 2 英寸的、3 个 3 英寸的 C-flex 管。将 1/8 英寸内螺纹鲁尔倒钩和外螺纹鲁尔锁连接器连接到一个 3 英寸管件和 12 英寸管件的末端。对于剩余的管路，将公鲁尔锁连接器连接到两端。这些部件将包括废料线和进料线树组件。
2. 废弃线树木组装
   1. 按照 图 3B 所示的 3D 图组装废料线树。
   2. 将红色 2 档 E-lab 管（内径 1.14 毫米）的暴露端连接到组装好的废料管线树上的末端公鲁尔锁。根据连接到 2 级 E-lab 管的 C-flex 管的长度按升序连接这些管。将带有 1/8 英寸内螺纹鲁尔倒钩和外螺纹鲁尔锁连接器的 3 英寸 C-flex 管连接到废料管树的顶部。
3. 进料线树组件
   1. 按照 图 3A 所示的 3D 图组装进料线树。
      注意： 进料线树不包含废料线树中使用的公对公鲁尔连接器。根据我们的经验，这些连接器容易泄漏并且很容易松动，从而增加了生物反应器室和培养基瓶的污染风险。为了缓解这种情况，在构造馈线树时不带这些组件。
   2. 将橙色 2 档 E-lab 管（0.89 mm 内径）的暴露端连接到组装好的进料线树上的末端公鲁尔锁上。根据连接到 2 级 E-lab 管的 C-flex 管的长度按升序连接这些管。将 12 英寸 C-flex 管连接到进料管树的顶部。
4. 完整组装：将准备好的组分组合到 MBRA 培养系统中。
   1. 将进料管树末端的可变长度 C-flex 管按升序连接到生物反应器，最短的线在生物反应器条的左侧，最长的线在右侧。
   2. 将废弃物管线树末端的可变长度 C-flex 管按降序连接到生物反应器条上，最长的线在左边，最短的线在右边。最短的废物管线位于生物反应器条的右侧，因为它最靠近废物泵。相比之下，最长的进料管线位于右侧，因为进料泵位于左侧（图 1）。
5. 组装阵列的灭菌：准备组装的系统进行灭菌。
   1. 将所有 C-flex 进料管线捆绑在 MBRA 的左侧，并用麻花扎带固定。对条带右侧的废料管线执行相同的作。
   2. 在 C-flex 管线之间用橙色的 2 档 E-lab 管形成一个环。使用高压灭菌胶带固定环。对生物反应器条废物侧的红色 2 档 E-lab 管执行相同的作。这将在高压灭菌过程中节省空间。
   3. 用一块箔纸盖住废料管线末端的母鲁尔机和进料线树，以防止从高压灭菌器中取出后受到污染。松开每个生物反应器室上带有隔垫的外螺纹鲁尔，以使蒸汽在高压灭菌过程中逸出。
      注意：此步骤对于确保在高压灭菌过程中允许蒸汽逸出生物反应器至关重要。如果通风不当，生物反应器室可能会开裂。
   4. 将MBRA放入高压灭菌箱中，并将进料线和废料线树拉伸到与装有MBRA的箱相邻的单独箱中。如果 1/16 英寸内螺纹鲁尔倒钩附近的 E-lab 管或 C-flex 管的任何部分在高压灭菌过程中扭结，则管可能会堵塞，阻碍介质或废物流。
   5. 在 121 °C 下高压灭菌，≥ 15 psi 25 分钟。使用液体循环典型的慢速排气程序。在高压灭菌循环后，让生物反应器在室温下冷却。MBRA 充分冷却后，用隔垫重新拧紧螺纹外螺纹鲁尔。
      注意：高压灭菌的生物反应器条变得具有延展性，如果压缩则容易开裂。在拧紧配件之前，请留出足够的时间冷却。
      注意：橙色的 2 档 E-lab 管在高压灭菌过程中容易破裂，并可能与 1/16 英寸内螺纹鲁尔倒钩分离。如果发生开裂，用 70% 乙醇喷洒两端，然后用无菌剃须刀切割开裂的一端，并将管子重新连接到鲁尔倒钩上。或者，附加了 1/16 英寸内螺纹鲁尔的 E-lab 管可以在高压灭菌袋中单独灭菌，并且可以更换整个管。

3. 介质和废瓶组装

1. 培养基瓶组件
   注意：在本例中，整个系统都用一个 2L 瓶子进料。有关培养基瓶盖组件的图像，请参阅 图 4A 。
   1. 将 Dibafit 适配器（瓶盖适配器）拧入 Q 系列瓶盖顶部的两个螺纹端口。将一段 3 英寸的 C-flex 管添加到其中一个适配器，将一段 12 英寸的 C-flex 管添加到另一个适配器。在每个管路段的末端，添加一个外螺纹鲁尔锁连接器。
      注意：到达 MBRA 的进料管树所需的管路长度可能会有所不同，并且可以相应地进行调整。
   2. 切割一根 12 英寸的 PTFE 管，作为吸管，从中抽取培养基。使用剃须刀片以 45° 角切割末端，以防止瓶子侧壁堵塞。将 PTFE 插入连接到 C-flex 管 12 英寸部分的瓶盖底部的小孔中。
   3. 切割一根 2 英寸的 C-flex 管，并将内螺纹鲁尔倒钩连接到一端，将外螺纹鲁尔锁连接器连接到另一端。将此管连接到最终连接到进料管树的 12 英寸管路部分。用夹子固定 2 英寸的部件。将 Pinchcock 的环放在瓶盖的 3 英寸管子上。这将作为临时塞子，以防止高压灭菌期间和之后的介质泄漏。
   4. 准备所需的培养基。将完全组装好的瓶盖安装在培养基瓶上。如上所述，将 12 英寸 C-flex 管缠绕在瓶子上，并将末端与 2 英寸管上的夹紧固定。不要拧紧盖子，而是稍微松开它，以防止高压灭菌过程中压力积聚。
   5. 用箔纸覆盖从瓶盖伸出的 3 英寸管的末端。高压灭菌时间适合培养基的方案。灭菌后，从 3 英寸管上取下箔片，并将 0.22 μm 针头过滤器拧入公鲁尔锁连接器。这将允许气流在泵送时进入培养基瓶，但可以防止污染。
      注意： 使用前，请确保 Q 系列瓶盖紧紧密封在瓶子上，因为密封不当可能会妨碍正常流动。
2. 废瓶组装：为避免每天更换废瓶，实验室创建了一个分层废物收集系统（图 4B），允许在实验期间将多个 2L 瓶子装满废物。分层废物系统的设置如下：
   1. 将瓶盖适配器拧入 Q 系列瓶盖顶部的两个螺纹端口。对 2-4 个瓶盖重复上述步骤，具体取决于所需的废物储存瓶的数量。
   2. 为每个瓶盖切割一块 2 英寸的 PTFE。将此部件插入瓶盖内指定用于将废物清除到系统中的下一个瓶子的孔中。
   3. 切割一段足够长的 C-flex 管，以便在从泵引出的废物管线树到废水瓶系统的位置之间伸展。将公鲁尔锁连接器安装到与废料管树相邻的一端，并将另一端连接到瓶盖适配器，瓶盖上没有 PTFE 管。
   4. 切割第二根 C-flex 管以连接第一个和第二个废瓶上的瓶盖。将管子连接到瓶盖适配器上，第一个瓶子上有 PTFE 吸管，第二个瓶子上没有 PTFE 吸管，连接到瓶盖适配器上。
      注意：分层废液瓶级联中的每个瓶子必须位于第一个瓶子上方，以允许重力协助从一个瓶子流向下一个瓶子（图 4B）。建议将所有瓶子放入辅助容器（例如，开放式塑料储物箱）中，并使用立管（例如倒置锐器容器）按降序排列。
   5. 根据需要继续此链条以获得任意数量的瓶子。在最后一个瓶子上，将带有公鲁尔锁连接器的 3 英寸 C-flex 管段连接到自由瓶盖适配器。然后连接一个 20 mL 注射器以施加真空并促进废物级联。

4. MBRA连接、作、拆卸

1. 连接到泵
   1. 取下将 E-lab 管路固定在一起的高压灭菌胶带，用于废液管线和进料管线。解开 C-flex 管束。
   2. 将 MBRA 放置在搅拌板顶部的两个泵之间。可以使用 3D 打印支架将其夹在板上（参见 补充文件 2）。确保它与搅拌板上指示的搅拌位置对齐。
   3. 将进料管 E-lab 管连接到蠕动泵滤芯上。将 E-lab 管的挡块定位到墨盒上的插槽中。对搅拌板右侧泵上的废料管 E-lab 管路执行相同的作。
   4. 将蠕动泵滤芯锁定到泵中。确保墨盒完全靠在泵上，并且管道位于墨盒的通道内。
      注意： 如果打算在 24 小时内开始流动，请仅将墨盒锁定在泵上。如果在没有介质流动的情况下保持夹紧时间超过 24 小时，管子可能会被压缩和堵塞。如果发生这种情况，只需取下夹子并在压缩点轻轻按摩管子即可。
   5. 使用 3D 打印的管架整理 C-flex 管（补充文件 3）。
   6. 将废物管线树的末端连接到通向废物瓶的管道上。
      注意：当运行多个 MBRA 时，在连接到通向废水瓶的管道之前，需要将废物管树分叉在一起。这可以通过为每个额外的 MBRA 创建一个简单的分支树来完成。
   7. 将进料管线入口管上的内螺纹鲁尔连接到介质瓶盖上 12 英寸管上的外螺纹连接器。
      注意：此时两端都应无菌。避免接触任何潜在的污染源。如果怀疑有污染，请在连接前将两端浸泡在 10% 漂白剂中 10 分钟。
   8. 打开两个泵以开始介质流动。确保泵沿正确的方向流动（如果废物位于泵右侧，则均设置为顺时针（“CW”））。
   9. 观察落入每个生物反应器室的培养基液滴的大小和节奏;这方面的任何较大差异都可能表明流速可变性。如果观察到可变性，建议更换连接到有问题的生物反应器室的任何橙色 2 级 E-lab 进料管。这将有助于限制实验运行中的流速变化。
      注意： 这是诊断和修复系统中任何泄漏的时候了，因此请密切监控初始填充过程。
   10. 一旦生物反应器室达到容量，关闭两个泵并让生物反应器静置24-48小时。此步骤对于在实验开始前检查腔室中是否有任何潜在污染至关重要。
2. MBRA接种
   注意：在这里，我们描述了对隔膜进行灭菌和注射接种物的基本方案。
   1. 根据所需的规格制备接种物。
   2. 使用塑料滴管将新鲜制作的 10% 漂白剂溶液涂抹在每个生物反应器室的隔垫顶部。沉积足够的漂白剂以完全覆盖隔膜的顶部。让它静置 10 分钟。使用无菌实验室湿巾擦干隔膜。
   3. 使用一根 3 英寸长的 22 G 针头和装有样品的注射器，刺穿隔膜的中心。确保针头接触腔室内的培养基，然后将接种物注入生物反应器腔室。通过取出介质并将其重新注射回腔室来冲洗注射器。从隔膜中取出针头并将它们丢弃在锐器容器中。
   4. 在开始流动之前，根据实验设计，让接种物生长一段适当的时间。例如，粪便细菌群落需要初始批量生长 4-16 小时才能增加足够的生物量⁸。
   5. 根据所需的周转时间，将两台泵打开至所需的流速。有关流速的更多信息，请参阅蠕动泵手册。
      注意：无论所需的流速如何，废物泵都应始终以高于介质泵的速度运行，以确保生物反应器室不会溢出。对于我们的胃肠道细菌群落培养，我们使用 1.92 mL/h 的周转率，通过将培养基泵设置为 1.0 rpm，将废物泵设置为 2.0 rpm 来实现。
   6. 同样，观察落入每个生物反应器室的培养基液滴的大小和节奏，其中任何较大的差异都可能表明流速可变性。如果观察到可变性，建议更换连接到有问题的生物反应器室的任何橙色 2 档 E-lab 进料管。这将有助于限制实验运行中的流速变化。
3. MBRA 采样
   1. 在每个生物反应器室的隔膜顶部涂抹 10% 的漂白剂溶液，足以完全覆盖表面。让它静置 10 分钟。10 分钟后，使用无菌实验室湿巾擦干隔膜。
   2. 使用 3 英寸长的 22 号针头和注射器，刺穿隔膜的中心并将针头完全插入生物反应器室。握住注射器的同时，向后拉柱塞以将样品从腔室中取出。
      注意：避免一次去除超过生物反应器室总体积的 20%。去除超过此数量可能会破坏微生物群落，因为废物外流会中断，直到新鲜培养基将腔室重新填充到PTFE废吸管水平。
   3. 取出针头并将样品分配到适当的容器中。将针头丢弃在锐器容器中。
4. MBRA拆解和翻新
   注意：实验后，MBRA 需要消毒并为未来的实验做准备。
   1. 用去离子 （DI） 水中的 1 L 10% 漂白剂切换培养基输入。将两个泵的流速增加到最大，以用漂白剂溶液取代生物反应器室中的内容物。
   2. 一旦腔室变得清晰（所有介质都已用漂白剂代替），将MBRA倒置以在填充线上方消毒5分钟。5 分钟后，正确放置试纸并再等待 5 分钟进行灭菌。
      注意：如上所述，不要让漂白剂放置超过 10 分钟，因为这会导致塑料变色以及介质和废管变弱。
   3. 用 1 L 去离子水代替 10% 漂白剂溶液。用去离子水冲洗系统，直到所有水都通过。断开生物反应器 E-lab 管与泵的连接并拆下 MBRA。
   4. 要翻新，请从每个腔室中取出用过的隔垫和除 1mL 水外的所有水。
   5. 更换隔垫和橙色 2 级 E-lab 管，并按照前面的步骤准备高压灭菌（步骤 2.5.1 至 2.5.5）最多 3 次。第三次重复使用后，应完全拆卸MBRA，更换C-flex管，并用70%EtOH对每个单独的部件进行灭菌，如果损坏则进行更换。容纳废料和进料 PTFE 的环氧树脂在几次高压灭菌循环后会变脆，需要重新涂抹。
      注意：每次运行之间更换橙色的 2 级 E-lab 管，以限制磨损和重复高压灭菌循环引起的流速变化。

Results

为了促进厌氧细菌（例如胃肠道中的细菌）的生长，MBRA 可以在厌氧室内设置和作。为了证明直接从人体内相关部位生长复杂细菌群落的能力，制备了人类粪便样本并在该系统中生长。所有工作均在设置为 37°C 的厌氧室中进行，培养物在我们的生物反应器培养基 BRM3⁷ 中生长。

粪浆是通过厌氧解冻人粪便，然后与磷酸盐缓冲盐水（PBS）混合至终浓度为25% w / v来制备的。确认无菌后，向九个生物反应器室接种3mL相同的粪便浆液。微生物群落在没有培养基输入或废物去除的情况下过夜生长，从而在16小时内进行单独的批次培养。然后，打开进料泵并将流速设置为 1.92 mL/h。连续流动四天后，从生物反应器中收集样品，并使用 16S rRNA 基因测序分析微生物群落组成，然后使用 Deblur 进行去噪，并使用 QIIME 2¹³ 中的 SILVA 138 SSU 数据库进行分类学分类。在所有九个重复中总共检测到了 65 个属，但生物反应器仅由 18 个属占主导地位，每个属在九个重复中的任何一个中都至少包含 2% 的丰度（图 5）。生物反应器显示出高重现性，因此在所有 9 个重复中都检测到了 65 个属中的 22 个，并且在至少一半的重复中检测到了另外 17 个属。至少一个反应器中不存在的大多数属（43 个属中的 37 个）是稀有物种，每个属在生物反应器中的相对丰度低于 2%。总之，连续流MBRA培养物支持来自同一粪便样品的复杂、可重复的微生物群落，即使在每个生物反应器腔室中单独分批培养16小时后也是如此。

图 1：微型生物反应器阵列 （MBRA）。 完全组装的 MBRA，包括进料和废料管树、生物反应器室和生物反应器条的标签。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：PTFE 蚀刻指南和 MBRA 端口布局。 （A） 介质和废 PTFE 吸管蚀刻流程图。（B）每个生物反应器室包含一个用于培养基吸管+螺纹公鲁尔、废料吸管+螺纹公鲁尔和隔膜+螺纹公鲁尔的端口。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：MBRA 饲料和废料线树。 （A） 进料线树和 （B） 废料线树的组装中要遵循的代表性图像。 请点击此处查看此图的大图。

图 4：培养基瓶盖和废物层系统。 （A） 用于将培养基拉入 MBRA 的组装 Q 系列瓶盖示例。（B） 分层废物收集系统的图像。 请点击此处查看此图的大图。

图5：细菌属的相对丰度。 （A） 堆叠条形图显示了在显示的任何样本中至少占 2% 丰度的所有属的相对丰度。（B） 观测到的 OTU 的 alpha 多样性指标和所有九个生物反应器室之间的香农多样性。所有九个生物反应器室都接种了从人类粪便制备的相同粪便浆液。 请点击此处查看此图的大图。

表 1：MBRA 组件。完全组装 MBRA 所需的所有单个部件的图像和描述，以及每个组件所需的数量。 请按此下载此表。

表 2：故障排除指南。 运行 MBRA 时遇到的常见问题及其潜在原因和推荐的解决方案。 请按此下载此表。

补充文件1： 用于 3D 打印 Minibioreactor 阵列条的 Stl 文件。 请点击此处下载此文件。

补充文件2： 用于 3D 打印用于将生物反应器固定到搅拌板上的生物反应器支架的 Stl 文件。 请点击此处下载此文件。

补充文件 3.： 用于 3D 打印用于组织 C-flex 废物和从 MBRA 延伸的进料管的管架的 Stl 文件。 请点击此处下载此文件。

Discussion

该协议描述了用于细菌群落高通量培养的微型生物反应器阵列（MBRA）的完整组装和基本作，对先前发表的方法进行了几项关键改进。MBRA 系统仍然是一种多功能且经济高效的工具，它使研究人员能够培养复杂的微生物生态系统，同时并行支持大量实验重复。在此更新版本中，我们引入了改进，以提高可重复性、简化工作流程并降低污染风险。其中包括用于防止脱落的化学蚀刻PTFE吸管（图2），介质管线上的进料吸管（图2）以最大限度地减少生物膜的形成，标准化的管路长度和随附的3D打印管支架（补充文件3）以实现更紧凑和有条理的设置，以及优化的重复使用方案，无需在实验之间完全拆卸。这些改进共同代表了通过在我们实验室的各种实验应用中广泛使用 MBRA 系统而开发的迭代改进。通过解决关键的组装步骤和实际增强功能，本次讨论强调了 MBRA 作为不断发展的微生物组研究模型系统的效用。

MBRA 系统的成功在很大程度上依赖于组件的精确组装和灭菌，以确保无污染运行。关键步骤包括正确安装 Q 系列盖子、管道和连接器，这有助于模块化组装并实现介质输入和废物收集。确保培养基瓶、废物储罐和生物反应器室之间的紧密密封对于防止泄漏和保持无菌条件至关重要。另一个关键步骤是在实验前验证蠕动泵流速，因为不一致会导致培养基输送不均匀，并可能影响微生物生长动力学。大多数使用盒式磁带的多通道蠕动泵都包括一个闭塞调节机构，应用于微调每个通道的流量。即使进行了适当的校准，E-lab 管仍然是可变性的主要来源。为了缓解这种情况，在初始填充和实验开始期间，目视监测进入每个生物反应器腔室的介质液滴的频率和大小非常重要。这些目视检查可以及早发现流速不一致，否则可能会影响实验的可重复性。 表 2 提供了在组装和使用 MBRA 过程中遇到的常见问题的故障排除策略。这些故障排除步骤可确保实验的可重复性，并防止长期培养过程中的中断。

尽管 MBRA 系统具有优势，但它在设计实验时必须考虑某些局限性。与更先进的系统不同，MBRA 缺乏主动监测功能，例如实时光密度 （OD） 测量、pH 控制和温度调节。由于缺乏主动测量，限制了系统实时监测微生物生长和代谢活动动态变化的能力。此外，虽然该系统支持室内厌氧培养，但它不包括集成气体控制，这可能会限制需要精确的微需氧或富含 CO₂ 环境的应用。对于需要此类控制的研究，具有内置气体调节功能的替代系统可能更合适。

与现有生物反应器模型相比，MBRA系统具有关键优势，包括高通量，可扩展性和成本效益，同时保留了在连续流动下培养复杂细菌群落的能力，以模拟人类胃肠道等动态环境^6,8,10。其紧凑的模块化设计允许同时运行多个生物反应器，使其成为高通量研究的理想选择，例如筛选粪便来源的群落对病原体入侵的抵抗力⁹。这种模块化设计提供了广泛的实验灵活性：每个条带可以由单个培养基瓶提供，如本协议所示，也可以由多达六个不同的培养基源提供，每个生物反应器室一个。工作容积由插入每个腔室废液口的细长PTFE废料吸管的长度决定，该吸管决定了液体高度;在该协议中，25 mm吸管保持15 mL的工作体积，但可以通过修剪或延长吸管来达到1-20 mL之间的体积。此外，将较短的进料吸管插入培养基入口，将流入引导至腔室底部，防止介质从腔壁滴落，并减少填充线上方的生物膜形成。还可以调整泵速或泵管直径以改变系统的周转率。迄今为止，MBRA系统已被广泛用于研究微生物群落响应多种因素的功能和组成变化，包括抗生素¹⁰、抗癌药物¹⁴和各种膳食化合物12,15,16,17。简单的模块化设计使其成为适应各种实验需求的理想选择。例如，MBRA 已被修改为在类似趋化剂条件下研究生物膜¹⁸，证明了其在浮游培养物之外的微生物生态学研究中的多功能性。

MBRA 系统的未来迭代可能会受益于额外的工程升级，从而扩展其功能、精度和吞吐量潜力。其中一项增强功能是在每个生物反应器腔室中加入额外的端口。这些端口可用于支持对环境参数（如 pH、温度、气体或光密度）的主动监测。这将通过允许实时反馈和监控来解决该模型最重要的限制之一。对腔室或端口几何形状的改进可以促进更彻底和更容易的清洁，减少残留物的堆积和变色，并提高长期可重复使用性。将额外的蠕动泵与可编程定时器集成将允许脉冲或昼夜培养基输入，从而更好地模拟宿主相关环境，例如人类肠道中的进食周期。最后，使用替代材料（例如耐化学腐蚀、可高压灭菌的聚合物）进行 3D 打印可以实现更高的耐用性以及与更广泛的试剂的兼容性。这些改进可以显着扩大 MBRA 平台的实验范围和保真度。

总之，MBRA 为在受控条件下培养和研究微生物群落提供了一个强大的高通量平台。虽然它在主动监测和 pH 控制方面存在局限性，但其灵活性、可扩展性和成本效益使其成为各种微生物学研究的宝贵工具，特别是那些需要高可复制性和实验通量的研究。重要的是，该系统的模块化设计和制造方法使其具有固有的适应性;研究人员已经并可以继续定制 MBRA 以适应广泛的实验目标。这种适应性确保 MBRA 能够与新兴的科学问题和技术一起继续发展，保持其作为微生物组研究多功能平台的相关性。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
V型丝锥导轨，标准尺寸0-80至5/8”	大鳄鱼工具	STD500NP
0.22 & 亩;M 针头过滤器	渔夫	SLGVR33RS
2mag MIXdrive 60 搅拌驱动器（仅驱动器）	2MAG	中频 41060
Air-tite 皮下注射针头，22G x3”	大众	89219-274
BD 1mL 滑头无菌注射器无菌	渔夫	14-823-434
生物反应器	原型实验室	那	由 DMS Somos Watershed 塑料 3D 打印而成。模板见补充文件 1
生物反应器支架	原型实验室	那	由 PA 12 Black 3D 打印而成。模板见补充文件2。
Diba Omnifit Q 系列溶剂瓶盖，GL38/38-430（玻璃），2 个 UNF（F） 端口，不带阀门，蓝色	科尔·帕默	电子邮箱：EW-21942-86
Diba Omnifit 管材，PTFE，1/8“ （3.2 mm） OD x 1.5 mm ID	科尔·帕默	电子邮箱：EW-21942-76
Dibafit 适配器，1/4“-28 UNF（M） 平底至 3.2 mm 内径，PEEK	科尔·帕默	电子邮箱：EW-21941-49
IRWIN 12001ZR 丝锥扳手 #0-1/4“ T 型手柄	亚马逊河	B00004YOB0
Irwin Hanson 高碳钢 SAE 分数丝锥 1/4 英寸1 件	索隆	G7695682
乐泰重型环氧树脂快速套装 8 液量盎司瓶	亚马逊河	B0044F59N0
公对公鲁尔锁连接器	达尔文微流控	DM-MM-LUER-PP	备选： Strategic Applications Inc 公对公鲁尔连接器 - 10/包 - Fisher - NC9876577
Masterflex 适配器接头，鲁尔对鲁尔，尼龙，Avantor	大众	MFLX45502-56
Masterflex 接头，尼龙，直型，内螺纹鲁尔到软管倒钩适配器，1/16“ 内径	大众	MFLX45502-00
Masterflex 接头，尼龙，直型，内螺纹鲁尔到软管倒钩适配器，3/32“ 内径	大众	MFLX45502-02
Masterflex 接头，尼龙，直型，内螺纹鲁尔到软管倒钩适配器，1/8”	大众	MFLX45502-04
Masterflex 接头，尼龙，直，外螺纹鲁尔锁到软管倒钩适配器，1/8	大众	MFLX45505-04
Masterflex 接头，尼龙，直型，外螺纹鲁尔 x 1/4-28 UNF	大众	MFLX45505-82
Masterflex 接头，聚丙烯，弯头，内螺纹鲁尔至内螺纹鲁尔适配器	大众	MFLX45508-26
Masterflex Ismatec 泵管，2 档，Tygon S3 E-Lab，0.89 mm 内径	大众	MFLX96460-26
Masterflex Ismatec 泵管，2 档，Tygon S3 E-Lab，1.14 mm 内径	大众	MFLX96460-30
Masterflex®传输管，C-Flex，不透明白色，1/8“ 内径 x 1/4” 外径;25 英尺	大众	MFLX06424-67
莫尔's 管用夹管	大众	470201-374
氯丁橡胶挡泥板垫圈 ½”外径 x ¼”内径 x 1/16”厚度	亚马逊河	B01A29F1R0
精密密封橡胶隔垫	西格玛·奥尔德里奇	Z553905
Spinbar 微搅拌棒	大众	58948-375
四蚀刻	R.S.休斯特公司	TE-500型
管架	原型实验室	那	由 PA 12 Black 3D 打印而成。模板见补充文件3。
Watson-Marlow 205S 多通道插装泵	沃森-马洛	020.3724.00A	折扣，替代：Ismatec IPC 数字蠕动泵 MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 或 Masterflex Ismatec IPC 蠕动泵，0.1 至 11.25 rpm，24 通道，115/230 VAC，Avantor，VWR，MFLX78006-48-CH