通过油红O染色评估腺相关病毒8型-PCSK9注射小鼠主动脉中的动脉粥样硬化

摘要

本方案详细描述了使用油红O染色法对小鼠主动脉内表面动脉粥样硬化病变进行解剖、灌注、染色、成像和定量分析的逐步操作方法。

摘要

小鼠模型长期以来一直是动脉粥样硬化研究中的基础工具，为深入了解斑块形成、脂质代谢和心血管炎症背后的分子与细胞机制提供了关键见解。除了Apoe^-/-或Ldlr^-/-小鼠外，在正常C57BL/6J小鼠中注射AAV8-PCSK9^D377Y并同时喂食西方型饮食，已成为动脉粥样硬化转化研究中常用的模型。油红O染色是可视化血管组织中中性脂质积聚的核心技术。由于其操作简便、成本低廉且对脂质富集病变具有高灵敏度，该方法已成为临床前研究中评估动脉粥样硬化斑块负荷的金标准。本研究提供了一套详细且可重复的操作流程，用于整装主动脉（en face aorta）的解剖、灌注、纵向切开、油红O染色、成像以及动脉粥样硬化负荷的半自动化定量分析，无需使用针固定或复杂的装片步骤。我们的结果表明，AAV8-PCSK9^D377Y注射联合西方型饮食喂养可有效诱导小鼠体内显著的动脉粥样硬化病变形成，且整装主动脉油红O染色是一种可靠且高效的脂质沉积与斑块负荷评估技术。此外，尽管本方案针对C57BL/6J小鼠中AAV8-PCSK9诱导的模型进行了优化，但也可轻松适用于其他模型和物种，例如Apoe^-/-小鼠、Ldlr^-/-小鼠以及Ldlr^-/-金黄地鼠。

引言

动脉粥样硬化以脂质在动脉内膜沉积及炎症反应为特征，是冠状动脉疾病和一系列心血管疾病（CVD）的病理基础，包括心肌梗死和脑卒中^1,2,3,4。目前，CVD仍是全球发病率和死亡率最高的疾病，对全球公共卫生和经济造成重大负担^3,5。作为CVD的主要病理基础，动脉粥样硬化受到广泛研究关注，旨在揭示其潜在机制并开发有效的治疗策略。小鼠模型在阐明动脉粥样硬化发生机制及评估潜在治疗干预措施方面发挥着核心作用⁶。动物模型的发展极大地推动了我们对动脉粥样硬化发生过程的理解，使研究人员能够解析其中涉及的细胞与分子机制，并评估新兴的治疗策略^6,7。经典的动脉粥样硬化小鼠模型，如载脂蛋白E缺陷（Apoe^−/−）和低密度脂蛋白受体缺陷（Ldlr^−/−）小鼠，长期以来被用于诱导高脂血症和显著的斑块形成。然而，这些基因修饰品系的培育和维持需要大量繁育工作，耗时较长，且限制了实验的灵活性^8,9,10。为克服这些局限性，一种利用携带前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）功能获得性突变基因的8型腺相关病毒（AAV8-PCSK9^D377Y）的替代方法日益受到重视。当该病毒与西方型高脂高胆固醇饮食联合应用于野生型C57BL/6J小鼠时，可在相对较短的时间内有效诱导高胆固醇血症和动脉粥样硬化病变，而无需进行复杂的基因杂交或回交至易发动脉粥样硬化的遗传背景^9,11。尽管该方法具有优势，AAV8-PCSK9模型仍存在某些局限性需加以考虑。值得注意的是，高胆固醇血症的程度及动脉粥样硬化病变的发展可能受到病毒剂量和给药方式等因素的影响，这可能导致个体动物间的变异性，进而影响实验结果的可重复性¹¹。

为了评估此类模型中的疾病负荷，主动脉全长油红O染色是一种成熟且灵敏的技术，可用于可视化并定量血管腔表面沿程的富含脂质的动脉粥样硬化病变^12,13。该方法可提供定性和定量数据，广泛应用于临床前研究中，以评估基因操作、药物干预或饮食调节的影响¹⁴。

本研究介绍了一种实用且可重复的实验方案，用于对整装小鼠主动脉中的动脉粥样硬化病变进行分离、灌注、纵向切开、Oil Red O 染色、成像以及半自动定量分析。在本方案中，通过尾静脉注射，以每只小鼠 5 × 10¹¹ 拷贝载体基因组（vg）的剂量给予 AAV8-PCSK9^D377Y。当与高脂饮食（WD，其中 40% 的热量来自脂肪，含 1.25% 胆固醇）联合使用时，可在 12–16 周内观察到显著的动脉粥样硬化病变形成。本方案优化了操作流程的各个步骤，无需将组织固定在石蜡表面，而是采用一种简化的展平技术，从而降低了实验变异性与技术难度。该方法不仅针对 C57BL/6J 小鼠中 AAV8-PCSK9^D377Y 诱导的模型进行了优化，还可直接应用于其他广泛使用的动脉粥样硬化模型，包括 Apoe^-/- 和 Ldlr^-/- 小鼠，以及 Ldlr^-/- 叙利亚金黄地鼠^{15,16,17,18,19}，后者因其类似人类的脂质代谢特征而成为一种极具前景的动物模型。

方案

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南的规定，并经中国科学技术大学动物伦理委员会批准（伦理批准号：USTCACUC27120124102）。

注意：所有涉及 AAV8-PCSK9 的操作均须在二级生物安全水平（BSL-2）条件下，在经认证的 II 级生物安全柜中进行。操作人员必须穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、一次性手套和护目镜。

1. 小鼠动脉粥样硬化的诱导

1. 通过尾静脉向一只8周龄的C57BL/6J小鼠静脉注射AAV8-PCSK9^D377Y（5 × 10¹¹ vg/只）。
2. 注射后立即给予小鼠WD饮食（含40% kcal脂肪和1.25%胆固醇）。
3. 持续喂养WD饮食12–16周，以诱导动脉粥样硬化病变形成。
   注意：通常采用12周的喂养周期，已证明可有效诱导明显的动脉粥样硬化斑块形成，尤其是在AAV8-PCSK9诱导的模型中。更长的周期（例如16周）可能导致更晚期的病变，具体实验目标应决定最佳时间点。
4. 在整个喂养期间定期监测小鼠的体重、一般健康状况和血浆脂质水平。进行脂质谱分析时，在基线及选定时间点（例如每4周一次），在短暂异氟烷麻醉下通过下颌下静脉或尾静脉采血获取血样。

2. 安乐死与灌注

1. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（200 mg/kg）处死小鼠。
2. 打开胸腔以暴露心脏。
3. 在右心耳处做一切口，使用21 G针头经左心室灌注冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS，约10 mL），以冲洗血液。

3. 主动脉解剖

1. 去除肺和胸腺等多余组织，暴露从心脏到膈肌的胸主动脉。
2. 使用精细解剖剪和精密镊子去除主动脉弓周围的脂肪组织。轻轻抬起靠近膈肌处胸主动脉基部周围的脂肪组织。沿脂肪组织根部用精细解剖剪进行切除（确保不损伤血管结构），并继续向上解剖至主动脉弓，以充分暴露主动脉血管。
   注意：从主动脉分离血管周围脂肪组织非常关键，建议在此步骤中保留主动脉 原位 （在从小鼠体内取出前）进行主动脉血管周围脂肪的分离，因为一旦主动脉被解剖并置于PBS中，再进行血管周围脂肪的分离在技术上较为困难。
3. 使用精密剪刀在胸主动脉基部横断血管。用镊子提起切断的血管末端，沿血管向主动脉弓方向向上解剖。在适当距离处切断主动脉的三个主要分支。
4. 在主动脉根部进行横断，以分离胸主动脉与心脏，完整获取该血管段用于后续分析。
5. 将切除的血管转移至预冷的4%多聚甲醛（PFA）溶液中，于4 °C孵育过夜（12–16 h）。为标准化操作并便于批量处理，在固定过程中将单个主动脉置于24孔或48孔板的孔中。
   注意：避免长时间固定（超过24小时），因为PFA中孵育过度可能导致血管硬化，影响纵向切片及后续分析。
   警告：4% PFA 是一种有毒且易挥发的固定剂，可能造成呼吸道和皮肤暴露风险。所有涉及 PFA 固定的步骤必须在通风橱内操作，并佩戴个人防护装备（PPE），包括丁腈手套、实验服和护目镜。避免吸入和皮肤接触。使用过的 PFA 溶液应收集于指定的甲醛废液容器中，明确标记，并由机构或有资质的化学废弃物处理机构作为危险化学废物进行处置。

4. 油红O染色

1. 用 PBS 清洗固定的主动脉三次，以去除残留的 PFA。
2. 如图1所示，在解剖显微镜下使用精细剪刀沿主动脉根部内侧弯曲处纵向剪开主动脉。或者，可在固定前预先纵向剪开主动脉，这可能有助于在封片过程中更轻松地展开和对齐血管。如有需要，可进一步纵向剪开主动脉弓的主要分支——如头臂干动脉（BCA）、右颈总动脉（RCA）和左锁骨下动脉——以暴露更多区域¹¹。操作时需格外小心，因为这些区域的斑块可能脱落或受损。
   注意：可根据操作者偏好和组织状态选择任一方法。
3. 将0.5%的异丙醇储备液与去离子水按3:2体积比（v/v）稀释，配制 Oil Red O 工作液（终浓度为0.3%）。在37 °C水浴中孵育5分钟，使染料完全溶解。
4. 使用0.22–0.45 µm滤膜过滤，以去除沉淀物。将溶液保存在37 °C水浴中备用。
5. 吸除各孔中的 PBS，加入 Oil Red O 工作液，完全浸没主动脉。室温（RT）孵育10分钟。
6. 孵育结束后，吸除染色液，并立即向每孔加入1 mL 60%异丙醇。将培养板置于摇床上，轻轻振荡进行洗涤。
7. 约30秒后，当血管非病变区域呈现半透明状态时，吸除异丙醇终止洗涤。用 PBS 将样本冲洗两次。
8. Oil Red O 染色后，如有必要，可进一步修剪残留的血管周围脂肪组织。此时脂肪组织通常已充分着色且易于识别，可在不破坏血管壁完整性的前提下实现更精确的辨认与去除。
9. Oil Red O 染色后，将主动脉纵向剪开，并小心地将其平整铺于载玻片上，立即在体视显微镜下进行成像。
10. 或者，在成像前可将样本短期保存于4 °C的 PBS 中。对于难以展平的动脉，可用细针将其固定在黑色石蜡板上，以确保最佳位置和清晰度。如需长期保存，可将染色后的血管铺于载玻片上，用甘油明胶封片后直接成像。
    注意：为避免残留 Oil Red O 造成污染，应将染色后的主动脉转移至新培养板中进行洗涤。
    警告：Oil Red O 是一种脂溶性染料，通常以异丙醇配制，具有易燃性和刺激性。操作 ORO 溶液时应在化学通风橱中进行，避免吸入蒸气；避免接触皮肤和眼睛。Oil Red O 染色液应单独收集于易燃化学废弃物容器中，并根据当地危险废物处理法规进行处置。

5. 成像

1. 将染色的主动脉置于白色背景上以增强对比度。保持血管的柔韧性。
   注意：高对比度背景有助于使用图像分析软件更高效地识别斑块。用户也可根据偏好选用其他颜色的背景。
2. 使用平板扫描仪或配备高分辨率相机的体视显微镜对整个主动脉进行成像。
3. 确保各样本之间的光照均匀且放大倍数一致（例如 6 至 8 倍）。若主动脉在成像过程中变干，可使用浸有生理盐水或 PBS 的猕猴桃擦拭布重新润湿。

6. 动脉粥样硬化病变的定量分析

1. 在 ImageJ 中打开图像。以下步骤以 ImageJ 为例说明分析流程。
   注意：也可根据用户偏好和可用性使用其他图像分析软件（例如 Zeiss Zen、Fiji）。
2. 使用已知参考物（例如比例尺或标尺）设置比例尺。使用 直线工具 沿已知距离绘制线段。进入 分析 > 设置比例尺，输入距离和单位，选择 全局，然后点击 确定。
3. 使用 多边形 或 自由手选工具 轮廓勾画整个主动脉区域。
4. 使用 分析 > 测量 功能测量面积。
5. 使用 图像 > 调整 > 颜色阈值 识别动脉粥样硬化斑块区域。调节 饱和度 和 亮度，以分离出 Oil Red O 阳性区域。
6. 点击 选择 生成染色区域的二值化选区。使用 分析 > 测量 测量所选区域。对同一批次中的所有图像应用相同的阈值设置。
   注意：由于残留脂肪或伪影可能导致假阳性染色，用户可根据具体实验需求和图像质量，选择手动或半自动定义斑块区域。斑块区域的手动描记可采用与定义总血管面积相同的方法进行。
7. 将结果导出（文件 > 另存为 > 结果）为 .csv 格式，以便进一步分析。
8. 将斑块面积表示为（斑块面积 / 总主动脉面积）× 100%。为更准确地评估动脉粥样硬化斑块负荷，可按解剖区域（例如主动脉弓，尤其是内弯处，以及整个主动脉）分别量化斑块面积，并将结果表示为各区域斑块面积占该区域总表面积的百分比：斑块面积（%）=（斑块面积 / 区域总面积）× 100%。
   注意：为尽量减少潜在偏倚，建议采用盲法分析。若需分析大量图像，可使用宏记录器（插件 > 宏 > 记录）对从阈值设定到测量的整个工作流程进行自动化，并通过 处理 > 批处理 > 宏 批量处理，从而实现高效且可重复的高通量分析。

结果

为评估主动脉壁内脂质沉积的程度，对注射了 AAV8-PCSK9^D377Y 并饲喂西方饮食 12 周的雄性 C57BL/6J 小鼠以及年龄匹配的对照小鼠分离出的主动脉进行了整体 Oil Red O 染色。在经 PBS 全身灌注并仔细解剖后，将完整主动脉小心地沿纵轴剖开，使用 Oil Red O 染色以显示富含脂质的动脉粥样硬化病变。整个实验流程如图 2所示。如图 3所示，在对照小鼠中几乎未观察到 Oil Red O 阳性区域（红色，斑块覆盖率为 0%），而在注射 AAV8-PCSK9^D377Y 的小鼠中，此类区域显著增加（平均斑块覆盖率为 17%），尤其是在主动脉弓及其分支点周围（病变部位与 Apoe 或 Ldlr 缺陷小鼠中观察到的相似）。定量分析进一步表明，与对照组相比，AAV8-PCSK9 组的斑块负荷显著增加。这些结果表明，注射 AAV8-PCSK9^D377Y 并结合西方饮食饲喂可在小鼠中成功诱导显著的动脉粥样硬化，且整体 Oil Red O 染色...

讨论

本研究中描述的内皮面油红O染色方法为评估整个主动脉的动脉粥样硬化病变负荷提供了一种稳健、可重复且高效的方案。在本研究中，我们特别选择主动脉弓和胸主动脉作为斑块分析的关注区域，而非整个主动脉。这一决策基于AAV8-PCSK9^D377Y模型的特点²⁰，该模型通常产生的动脉粥样硬化斑块范围较经典的基因敲除模型（如Apoe^−/−和Ldlr^−/−小鼠）更局限。在相同时间的西方饮食喂养（例如12–16周）下，AAV8-PCSK9^D377Y模型往往表现出较小的病变面积，且斑块主要集中在主动脉弓。此外，为了遵循使用实验动物研究的"3R"原则，并最大化主动脉组织的利用效率，腹主动脉可被小心分离并保留用于其他下游分析，例如RNA提取或分子谱型分析。这种灵活性增强了该实验方案的整体效率和适用性。若将该方法应用于其他小鼠品系或物种，可能需要对特定操作步骤（如注射剂量、饮食持续时间或解剖技术...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J 小鼠	GemPharmatech	NO. N000013
4% 多聚甲醛	Beyotime	P0099	用于组织固定
AAV8-PCSK9D377Y 病毒颗粒	Wzbio	pAV208001	用于诱导动脉粥样硬化
精细镊子	Fine Science Tools	No. 11254-20	用于主动脉解剖
ImageJ	NIH	1.47
异丙醇	生工生物	A600918	用于清除多余的油红 O 染料
异丙醇中 0.5% 油红 O 溶液	Poly Scientific R&D Corp	S1849-32OZ	用于油红 O 染色
磷酸盐缓冲液	Servicebio	G4202	用于主动脉灌注和清洗
弹簧剪刀	Fine Science Tools	No. 15003-08	用于主动脉解剖
体视显微镜	Mshot	MZ62	用于主动脉解剖和成像
西方饮食	Research Diet	D12108C	用于诱导动脉粥样硬化