研究小鼠继发性大脑中动脉闭塞模型中的缺血性卒中复发性损伤

摘要

本文介绍了一种在小鼠中进行继发性大脑中动脉阻塞的方法，用于研究复发性缺血性卒中的进展过程。文中描述了手术操作步骤、术后护理、神经元病理学改变以及生存率。

摘要

脑卒中是全球第二大死亡和致残原因，其中复发性脑卒中显著导致不良预后及加重神经系统负担。尽管急性期临床脑卒中管理已取得进展，但由于操作复杂性和高死亡率，用于研究复发性缺血性脑卒中的实验模型仍十分有限。本研究旨在建立一种小鼠复发性缺血性脑卒中模型，并采用两阶段大脑中动脉闭塞（MCAO）方案评估其脑部病理改变和功能缺陷。成年雄性C57BL/6J小鼠在激光多普勒血流监测下接受短暂性MCAO手术，并在首次手术14天后实施二次MCAO以模拟脑卒中复发。术后评估包括运动活动分析、采用六分制评分系统进行神经行为缺陷评分、炎症标志物检测（包括缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）），以及苏木精-伊红（H&E）染色的组织病理学评估。与对照组相比，经历复发性MCAO的小鼠表现出显著降低的运动活动能力、减慢的移动速度、下降的神经行为评分以及升高的炎症标志物水平。组织病理学检测显示，复发性MCAO小鼠的皮层和海马区出现中至重度的神经元细胞坏死、神经毡空泡化及局灶性出血。该复发性MCAO操作亦诱导了炎症标志物的表达。此两阶段MCAO小鼠模型首次提供了一种可有效模拟复发性缺血性脑卒中、具有稳定神经功能和病理结果且改善术后存活率的方法。该模型可为机制研究提供可靠平台，并有望用于未来针对复发性脑卒中的神经保护疗法的评估。

引言

脑卒中仍是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因，给临床和经济社会带来重大负担。全球有超过3000万人受到脑卒中及其后果的影响，包括行动能力丧失、认知功能障碍以及血管疾病风险增加^1,2。尽管在急性期治疗方面已取得进展，例如溶栓治疗和血管内取栓术，但许多幸存者仍面临较高的卒中复发风险，而复发与预后恶化、残疾程度加重及死亡率上升密切相关。大约10%-20%的患者在首次发病后的90天内会发生复发性卒中，其中短暂性脑缺血发作或轻型卒中期间的风险最高³。更重要的是，复发性卒中常累及不同的血管区域，导致更广泛的脑梗死和更严重的脑损伤，例如脑血流动力学障碍⁴、急性和慢性免疫调节紊乱以及皮层下神经元坏死⁵，提示大脑在初次缺血性损伤后可能变得更加脆弱，并引发更多并发症。

近期一些研究在实验动物中建立了缺血性或出血性卒中模型，揭示了具有区域特异性的损伤模式、神经血管反应的破坏以及不同的内源性修复机制，以更好地模拟人类临床状况^6,7。然而，由于操作复杂且死亡率较高，复发性卒中的研究模型仍不够完善。一些先前的研究建立了光栓塞性....

方案

所有动物实验均经中国台湾大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）审查和批准（研究计划编号20230335），并依照实验室动物照护与使用的既定伦理准则进行。

1. 动物准备

1. 将8周龄雄性C57BL/6J小鼠（体重20-25 g）饲养在环境条件可控的环境中，温度为22 ± 1 °C，相对湿度为55%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。提供人道护理，并自由供应食物和蒸馏水。
2. 将28只雄性小鼠随机分为三组：假手术组（n = 8）、MCAO组（n = 10）和复发性MCAO组（n = 10）。动物隔离两周（−d14）；在−d7进行适应性饲养、称重和分组；在d0实施MCAO手术；在d0、d2、d14和d16进行行为学测试；并在d14进行复发性MCAO手术。

2. 首次手术性大脑中动脉阻断（MCAO）操作

1. 将所有手术器械通过高压灭菌法进行灭菌，称量每只小鼠体重，在首次切口前1小时以5 mg/kg剂量口服卡洛芬，并使用含3%异氟烷的氧气混合气体诱导麻醉。
2. 监测呼吸频率（100–120次/分钟，BPM），并通过检查眼睑反射和吞咽反射评估麻醉深度。将动物置于电子加热板上，以维持体温在37 °C。
3. 剃除头部后方及颈部的毛发，并使用真空装置清除小鼠皮肤....

结果

首次和复发性大脑中动脉闭塞小鼠的运动活动及神经元损伤评估
在首次大脑中动脉闭塞（MCAO）操作中，将一根硅胶包被的尼龙单丝线从颈外动脉（ECA）经颈内动脉（ICA）插入至大脑中动脉（MCA）持续40分钟。当线栓位于MCA区域时，可通过激光多普勒仪检测到脑血流（CBF）显著下降（下降至基线值的<30%）。在此操作过程中，所有小鼠均稳定达到该阈值并存活。既往一些研究表明，在其他实验中，MCAO手术后14天，小鼠体重变化已恢复¹⁹，且生存状态稳定^2,20,21。

因此，在本研究中，我们假设大脑中动脉阻塞（MCAO）小鼠在14天后将恢复并趋于稳定，适合进行二次MCAO手术治疗。在复发性MCAO操作中，将硅胶包被的尼龙单丝从颈总动脉（CCA）插入至大脑中动脉（MCA），并可持续稳定地检测脑血流（CBF） <.......

讨论

脑卒中仍是全球第二大死亡和致残原因，具有较高的卒中复发风险。目前，尽管医学技术和策略不断进步，但卒中的预防及其复发的防控仍不足以满足改善需求。近几十年来，多种脑卒中研究模型已广泛应用于缺血性脑卒中损伤及机制的研究。其中，大脑中动脉阻塞（MCAO）手术方法被认为在超过40%的神经机制探索和保护性研究中，最接近人类缺血性脑卒中的病理状态和并发症²⁴。然而，由于二次MCAO手术操作的复杂性和多样性，极少有研究在动物实验中探讨缺血性复发性脑卒中。Qiao 等人已相继在大鼠中成功建立了二次MCAO模型²⁵。

与我们的研究结果类似，神经元的病理改变（包括空泡变性和细胞坏死丢失）在复发动物中更为明显（图3）。相反，令人意外的是，我们还发现神经元损伤和运动能力的严重程度不及初次MCAO（图2）。然而，最近一项研究表明，在MCAO大鼠中，继发性缺血事件后复发脑区的脑损伤程度会减轻

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-0 丝线缝合线	中国台湾 Shin-Teh Inc.	ST1N-ST6
1毫米冠状小鼠脑切片器	赛默飞世尔科技公司，美国	V11335
动物毛发剪毛器	URBANER. Inc. 中国台湾	MB033
冠状小鼠脑切片器	Zivic 仪器公司，美国	BSMAS001-1
数字图像系统	Azure Biosystems公司，美国加利福尼亚州都柏林	Azure -300
电子双极电凝器	印度马特	AARON 940
电子加热板	Reptizoo	AHM23
眼膏	美国洛迪兽医护理中心	17033-21-38
激光多普勒检测器	Moor instruments UK	moorVMS-LDF1-HP
激光多普勒探头适配器	赛默飞世尔科技公司	05-700-76
运动活动检测器	Orchid scientific 公司	所有迷宫追踪软件。
（所有迷宫系统）	Orchid scientific 公司	Trackezi. ver 7.39
微血管血管夹	中国台湾 Shin-Teh Inc.	ST-M104
显微外科血管剪	中国台湾 Shin-Teh Inc.	ST-V108
呼吸频率监测仪	SDR scientific Ltd. US	SAR-830/AP
硅橡胶包覆尼龙单丝	Fisher Scientific	NC1773962
皮肤镊	中国台湾 Shin-Teh Inc.	ST-H212
皮肤剪	中国台湾 Shin-Teh Inc.	ST-S014PK
无菌棉签	Winner Medical	401 003
转移系统	半干式转膜系统。Bio-rad Laboratory，美国	1703940
<强>化学品
10% 聚维酮–碘溶液	吉田制药株式会社 日本	聚乙烯吡咯烷酮–我 10%
75% 乙醇溶液	Sigma-Aldrich，美国	111727
阿莫西林	Sigma-Aldrich，美国	A5955
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich，美国	A2153
卡洛芬	Plexx Inc. UK	MD150-2
GAPDH 抗体	Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州，美国	Sc-32233
H&E 溶液	BioPioneer Tech. CO. TW	G1005
缺氧诱导因子1α抗体	美国马萨诸塞州，细胞信号技术公司	#36169
异氟烷（麻醉剂）	生命科学	R510-22-10
无菌生理盐水	Nova-Tech Inc. USA	1760RX
肿瘤坏死因子α	美国马萨诸塞州，细胞信号传导技术公司	#3707