低密度脂蛋白存在下利用中性粒细胞胞外诱捕网刺激血管内皮细胞

摘要

本文描述了一系列方法，包括从人血浆中分离低密度脂蛋白（LDL）、将HL-60细胞分化为类似中性粒细胞的细胞、在LDL存在条件下制备中性粒细胞胞外陷阱（NETs），以及用NETs与LDL的混合物刺激人主动脉内皮细胞。

摘要

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）已被证实是多种非感染性疾病中的致病因素，并与动脉粥样硬化和血栓形成等心血管疾病密切相关。在血管壁中可观察到NET的形成，且有充分证据表明，NET形成的血浆标志物水平随疾病严重程度升高而增加。中性粒细胞来源的NET组分，包括髓过氧化物酶和蛋白酶，可影响血浆脂蛋白及血管稳态。本文描述了一系列利用在低密度脂蛋白（LDL）存在条件下形成的NET刺激血管细胞的方法。LDL通过超速离心法从人血浆中分离获得。HL-60细胞经全反式维甲酸诱导分化为中性粒细胞样细胞。转 视黄酸诱导其分化为类中性粒细胞，随后用佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯（PMA）刺激以诱导中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成。去除并洗去PMA后，细胞进一步与低密度脂蛋白（LDL）共孵育。收集含有NET和LDL的上清液，立即用于刺激人主动脉内皮细胞（HAECs）。作为代表性反应，NET处理引起的HAECs形态学改变在LDL存在下进一步增强，提示NET形成与LDL联合作用可增强HAECs的反应性。这些方法有助于探究中性粒细胞活化及NET相关炎症状态下LDL对内皮细胞的影响，从而为血浆LDL水平升高相关的心血管疾病发病机制提供新的见解。

引言

中性粒细胞胞外陷阱（NETs）由活化的中性粒细胞在细菌感染以及非感染性但生理上合理的条件下产生，会释放去浓缩的DNA和蛋白质，例如组蛋白、髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶¹。由于这些组分可破坏边缘细胞和组织，导致持续性炎症，NET的形成已被认为是多种急性和慢性疾病发生与发展的致病因素，包括类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病、阿尔茨海默病、癌症转移以及心血管疾病²。对人类动脉粥样硬化³和腹主动脉瘤⁴血管病变的组织学分析显示，中性粒细胞浸润与NET形成在空间上共定位。在循环血液中，NET标志物（如瓜氨酸化组蛋白、NET-DNA和MPO）的水平随冠状动脉疾病严重程度而升高⁵。在动脉粥样硬化的早期阶段，NET的形成通常先于由巨噬细胞驱动的泡沫细胞形成所介导的脂质积聚^6,7。这些现象强烈提示，NET形成过程中释放到细胞外的MPO和蛋白水解酶不仅可作用于血管组织，还可作用于血液成分，例如脂蛋白。脂蛋白是脆弱的脂质-蛋白质复合物，可被NET来源的蛋白质（如MPO）所损伤⁸；因此，NET的形成可导致脂蛋白的结构和生物化学改变，从而影响血管稳....

方案

低密度脂蛋白（LDL）制备方案已获得昭和药科大学药学院伦理委员会批准（编号：231）。所有参与者均按照《赫尔辛基宣言》的要求签署书面知情同意书，并自愿参与本研究。细胞操作均在超净工作台中无菌进行。纳入标准为年龄在22至65岁之间。排除标准包括吸烟史、已存在的心血管疾病（如冠心病、脑卒中和外周动脉疾病）、严重肝功能障碍，以及未得到控制的慢性疾病，包括糖尿病、高血压、血脂异常、严重炎症性疾病和癌症。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 从人血浆中分离低密度脂蛋白（LDL）

1. 从健康人类志愿者采集全血，加入抗凝剂肝素（10 单位/mL）。
2. 将肝素管中获取的 45–50 mL 人全血离心（700 × g，4 °C 下 15 分钟）。确保缓慢降低离心机转速。收集上层含血浆组分的液体。
3. 以与步骤 1.2 相同的减速条件进行两次离心（700 × g，4 °C 下 15 分钟），以去除血细胞。加入 1:1,000 体积的 250 mM EDTA（pH 7.4），防止二价金属离子介导的脂蛋白氧化。
4. 将 2.7 mL 血浆置于 4 mL 聚碳酸酯（4PC）管中，覆盖 900 µL 含 250 µM EDTA 的磷酸盐缓冲液（PBS/EDTA），然后进行超速离心（600,000 × g，4 °C 下....

结果

通过连续超速离心法从人血浆中去除乳糜微粒及极低密度脂蛋白（VLDL）组分后，将人血浆与溴化钾（KBr）溶液混合，调节密度至d = 1.063。此步骤中，残留的沉淀物未完全溶解于溶液中，应避免剧烈混匀以防止产生气泡，从而保持低密度脂蛋白（LDL）的完整性。超速离心后，通过肉眼观察顶部呈现的黄色至橙色层来鉴定LDL⁹（图1），该颜色可将其与下方无色溶液区分开来。通常情况下，在将收集的LDL组分对磷酸盐缓冲液/乙二胺四乙酸（PBS/EDTA）进行透析后，可从45–50 mL人血中获得约23–25 mL血浆，并从中分离出约4.3 mL的LDL组分，其蛋白浓度约为4 mg/mL。

用 2 µM AtRA 处理 HL-60 细胞可诱导其分化为类似中性粒细胞的细胞（dHL-60），细胞体积减小。值得注意的是，在制备 dHL-60 细胞时，应避免使用贴壁细胞培养皿，因为 dHL-60 细胞容易黏附于培养皿表面，导致细胞收获量减少。此外，与 HL-60 细胞相比，dHL-60.......

讨论

本方案描述了由低密度脂蛋白（LDL）共存条件下诱导dHL-60细胞形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）并对其进行制备，随后用于分析人主动脉内皮细胞（HAEC）的反应。本方案的重要之处在于使用含有NETs和LDL的新鲜培养基刺激细胞，而许多其他研究则采用在-20 °C冷冻保存的NETs储备液。由于脂蛋白是脂质-蛋白质复合物，其完整结构和特性在冻融过程中会丧失，导致LDL发生变性和聚集。当前方法的一个优势在于，类中性粒细胞释放的NET形成产物（如去浓缩DNA、组蛋白、髓过氧化物酶（MPO）和弹性蛋白酶）以及脂蛋白均保持完整，并可立即应用于HAEC。因此，在NET形成过程中由类中性粒细胞释放的酶活性得以维持。值得注意的是，本方案的结果可能反映了NETs共孵育对LDL改变的影响。先前有研究报道，天然LDL不会增强PMA处理的dHL-60细胞释放DNA或MPO¹²。这些数据表明，HAEC的反应可能是由中性粒细胞来源成分诱导的天然LDL改变所引起的。考虑到髓过氧化物酶（MPO）产生的次氯酸反应生成的酶促氧化脂质（包括氯化磷脂和脂肪酸）可诱导炎症反应¹³，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1% 聚-L-赖氨酸	SigmaAldrich	P8920-100ML
10 cm 培养皿	Corning	430591
12 孔组织培养板	Falcon	353043
2% 明胶	SigmaAldrich	G1393-20ML
4PC 管	Himac	S404332A
全反式维甲酸	Wako	188-01113	可使用任意供应商产品替代
纤维素透析管	MISUMI Group Inc.	0327-23-37-07 (UC18-32-100)	可使用任意供应商产品替代
EDTA	Dojindo	345-01865	可使用任意供应商产品替代
内皮细胞生长培养基 2 试剂盒	PromoCell	C-22111
胎牛血清	Gibco	10270-106	可使用任意供应商产品替代
肝素钠（5,000 单位/5 mL）	Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.		可使用任意供应商产品替代
高速冷冻离心机	TOMY	SRX-201	加速度：9，减速度：7
人主动脉内皮细胞	Lonza	cc-2535
KBr	Wako	168-03475	可使用任意供应商产品替代
KEYENCE 显微镜软件	KEYENCE	BZ-II Analyzer
微量超速离心机	Himac	CS150GX
显微镜	OLYMPUS	CK40
显微镜	KEYENCE	BZ-9000	用于延时成像（可选）
显微镜相机	Nikon	DS-Fi3
显微镜相机软件	Nikon	DS-L4
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122 100ML	可使用任意供应商产品替代
磷酸盐缓冲液（×10）			将 2.6 g NaH2PO4·2H2O、29 g Na2HPO4·12H2O、80 g NaCl 和 2.0 g KCl 溶于蒸馏水中，定容至 1 L。 （可使用任意供应商产品替代）
PMA（佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯）	Wako	162-23591	可使用任意供应商产品替代
ReagentPack	Lonza	CC-5034	（CC-5022：HEPES 缓冲盐溶液，CC-5012：胰蛋白酶/EDTA，CC-5002：胰蛋白酶中和液）
转子	Himac	S100AT6-0242
RPMI-1640（含酚红）	Wako	189-02025	可使用任意供应商产品替代
RPMI-1640（不含酚红）	Wako	186-02155	可使用任意供应商产品替代
T-25 培养瓶	Corning	3275