本文描述了一系列方法，包括从人血浆中分离低密度脂蛋白（LDL）、将HL-60细胞分化为类似中性粒细胞的细胞、在LDL存在条件下制备中性粒细胞胞外陷阱（NETs），以及用NETs与LDL的混合物刺激人主动脉内皮细胞。
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摘要
摘要
中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）已被证实是多种非感染性疾病中的致病因素，并与动脉粥样硬化和血栓形成等心血管疾病密切相关。在血管壁中可观察到NET的形成，且有充分证据表明，NET形成的血浆标志物水平随疾病严重程度升高而增加。中性粒细胞来源的NET组分，包括髓过氧化物酶和蛋白酶，可影响血浆脂蛋白及血管稳态。本文描述了一系列利用在低密度脂蛋白（LDL）存在条件下形成的NET刺激血管细胞的方法。LDL通过超速离心法从人血浆中分离获得。HL-60细胞经全反式维甲酸诱导分化为中性粒细胞样细胞。转 视黄酸诱导其分化为类中性粒细胞，随后用佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯（PMA）刺激以诱导中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成。去除并洗去PMA后，细胞进一步与低密度脂蛋白（LDL）共孵育。收集含有NET和LDL的上清液，立即用于刺激人主动脉内皮细胞（HAECs）。作为代表性反应，NET处理引起的HAECs形态学改变在LDL存在下进一步增强，提示NET形成与LDL联合作用可增强HAECs的反应性。这些方法有助于探究中性粒细胞活化及NET相关炎症状态下LDL对内皮细胞的影响，从而为血浆LDL水平升高相关的心血管疾病发病机制提供新的见解。
引言
中性粒细胞胞外陷阱（NETs）由活化的中性粒细胞在细菌感染以及非感染性但生理上合理的条件下产生，会释放去浓缩的DNA和蛋白质，例如组蛋白、髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶1。由于这些组分可破坏边缘细胞和组织，导致持续性炎症，NET的形成已被认为是多种急性和慢性疾病发生与发展的致病因素，包括类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病、阿尔茨海默病、癌症转移以及心血管疾病2。对人类动脉粥样硬化3和腹主动脉瘤4血管病变的组织学分析显示，中性粒细胞浸润与NET形成在空间上共定位。在循环血液中，NET标志物（如瓜氨酸化组蛋白、NET-DNA和MPO）的水平随冠状动脉疾病严重程度而升高5。在动脉粥样硬化的早期阶段，NET的形成通常先于由巨噬细胞驱动的泡沫细胞形成所介导的脂质积聚6,7。这些现象强烈提示，NET形成过程中释放到细胞外的MPO和蛋白水解酶不仅可作用于血管组织，还可作用于血液成分，例如脂蛋白。脂蛋白是脆弱的脂质-蛋白质复合物，可被NET来源的蛋白质（如MPO）所损伤8；因此，NET的形成可导致脂蛋白的结构和生物化学改变，从而影响血管稳态。然而，NET形成与脂蛋白在血管细胞诱导的失调及炎症反应中的协同作用仍不明确。
本文提供了一种研究人血管内皮细胞在经由HL-60来源的类中性粒细胞制备的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）以及自人血浆中分离的低密度脂蛋白（LDL）处理后所诱导的细胞反应的方法。代表性结果展示了通过超速离心法从人血浆中分离LDL的过程，以及LDL共孵育后NETs刺激人主动脉内皮细胞（HAECs）所引发的细胞反应。该方法可广泛应用于涉及其他脂蛋白的血管细胞研究。
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方案
低密度脂蛋白（LDL）制备方案已获得昭和药科大学药学院伦理委员会批准（编号：231）。所有参与者均按照《赫尔辛基宣言》的要求签署书面知情同意书，并自愿参与本研究。细胞操作均在超净工作台中无菌进行。纳入标准为年龄在22至65岁之间。排除标准包括吸烟史、已存在的心血管疾病（如冠心病、脑卒中和外周动脉疾病）、严重肝功能障碍，以及未得到控制的慢性疾病，包括糖尿病、高血压、血脂异常、严重炎症性疾病和癌症。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 从人血浆中分离低密度脂蛋白（LDL）
- 从健康人类志愿者采集全血，加入抗凝剂肝素（10 单位/mL）。
- 将肝素管中获取的 45–50 mL 人全血离心（700 × g，4 °C 下 15 分钟）。确保缓慢降低离心机转速。收集上层含血浆组分的液体。
- 以与步骤 1.2 相同的减速条件进行两次离心（700 × g，4 °C 下 15 分钟），以去除血细胞。加入 1:1,000 体积的 250 mM EDTA（pH 7.4），防止二价金属离子介导的脂蛋白氧化。
- 将 2.7 mL 血浆置于 4 mL 聚碳酸酯（4PC）管中，覆盖 900 µL 含 250 µM EDTA 的磷酸盐缓冲液（PBS/EDTA），然后进行超速离心（600,000 × g，4 °C 下 7 分钟）。
- 弃去上层 900 µL 液体以去除乳糜微粒。在血浆上层叠加 900 µL PBS/EDTA，然后进行超速离心（600,000 × g，4 °C 下 2.5 小时）。
- 弃去上层 900 µL 液体以去除极低密度脂蛋白（VLDL）。此步骤至关重要，可防止其他脂蛋白组分污染低密度脂蛋白（LDL）。
- 加入 540 µL 的 0.5 g/mL KBr 溶液，将密度调节至 d = 1.063，随后用移液器轻轻混匀，再进行超速离心（600,000 × g，4 °C 下 2.5 小时）。
- 收集上层 540 µL 含 LDL 的液体。出现黄色至橙色层表明 LDL 分离成功9。转移至透析膜中。
- 将 LDL 组分在 4 °C 避光条件下，用 2 L PBS/EDTA 透析三次，以去除 KBr。
- 将 LDL 储存于 4 °C 避光环境中，待用。
2. 聚-L-赖氨酸或明胶包被孔板的制备
- 通过将0.1%的聚-L-赖氨酸溶液用无菌水稀释，配制0.01%的聚-L-赖氨酸溶液10，然后用0.2 µm无菌滤器过滤。使用前于4 °C保存。
- 向12孔板的每孔中加入152 μL的0.01%聚-L-赖氨酸溶液，孵育至少5 min。
- 吸除溶液，然后每孔用 200 μL 无菌水洗涤一次，并干燥至少2 h。
- 在制备NETs前，于室温下保存。
3. 明胶包被孔板的制备
- 使用前，用无菌水稀释2%明胶溶液，制备0.1%明胶溶液。
- 向12孔板的每孔中加入152 μL的0.1%明胶溶液，并孵育至少5分钟11。
- 移除溶液，然后每孔加入200 μL无菌水洗涤一次，并干燥至少2小时。
- 使用前于室温下保存。
4. 人主动脉内皮细胞（HAECs）的培养与制备
- 根据制造商说明书，使用含有2%胎牛血清（FCS）、5 ng/mL表皮生长因子、10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/mL胰岛素样生长因子、0.5 ng/mL血管内皮生长因子、1 µg/mL抗坏血酸、22.5 µg/mL肝素和0.2 µg/mL氢化可的松的完全培养基，在未包被的培养瓶中培养原代人支气管上皮细胞（HAECs）。每隔一天换液一次，直至细胞融合度达到70%–80%。
- 进行刺激实验时，将HAECs接种于明胶包被的12孔板中。每隔一天更换培养基，直至细胞达到完全融合。实验应在第4至第7代之间进行。
5. 中性粒细胞样 HL-60 细胞的制备及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的诱导
- 使用未处理的培养皿，以添加了5%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基培养HL-60细胞。
- 为制备HL-60来源的中性粒细胞样细胞，培养2 × 106 每10 mL HL-60细胞在含2 µM全反式维甲酸的RPMI-1640培养基中培养4天转 视黄酸（AtRA）
6. 用LDL制备NETs
- 在用 2 µM AtRA 处理 4 天后收集 HL-60 细胞。HL-60 细胞向类中性粒细胞分化后，细胞体积变小。
- 离心细胞（220 × g，18–22 °C 下离心 4 分钟）。吸除上清液，并用等体积的无血清 RPMI-1640 培养基洗涤细胞。
- 再次离心细胞（220 × g，18–22 °C 下离心 4 分钟），然后用无血清 RPMI-1640 培养基重悬细胞。
- 计数细胞，然后将细胞重悬于无血清 RPMI-1640 培养基中，调整细胞密度至 2 × 106 个细胞/mL，并将 0.5 mL 细胞悬液接种至预先用多聚-L-赖氨酸包被的 12 孔板各孔中。培养至少 30 分钟。
- 向孔中加入 100 µL 无血清 RPMI-1640 培养基，其中含或不含佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯（PMA），使 PMA 的终浓度为 0 或 50 nM。继续培养 30 分钟。
- 移除培养基，用无血清 RPMI-1640 培养基洗涤细胞一次。更换为含或不含 20 µg/mL 低密度脂蛋白（LDL）的无血清 RPMI-1640 培养基，继续培养 2 小时。
- 收集培养上清液，离心（700 × g，18–22 °C 下离心 3 分钟）以去除细胞碎片。
7. 用 NETs 和 LDL 刺激 HAECs
- 更换为 0.5 mL 新鲜培养基，在刺激前至少培养 30 分钟。
- 向 HAEC 培养皿中加入含有 NETs 和 LDL 的培养基（步骤 6.7）以及 LDL，共 167 µL。观察刺激 12 小时或更长时间后 HAECs 的形态学变化。
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结果
通过连续超速离心法从人血浆中去除乳糜微粒及极低密度脂蛋白（VLDL）组分后，将人血浆与溴化钾（KBr）溶液混合，调节密度至d = 1.063。此步骤中，残留的沉淀物未完全溶解于溶液中，应避免剧烈混匀以防止产生气泡，从而保持低密度脂蛋白（LDL）的完整性。超速离心后，通过肉眼观察顶部呈现的黄色至橙色层来鉴定LDL9（图1），该颜色可将其与下方无色溶液区分开来。通常情况下，在将收集的LDL组分对磷酸盐缓冲液/乙二胺四乙酸（PBS/EDTA）进行透析后，可从45–50 mL人血中获得约23–25 mL血浆，并从中分离出约4.3 mL的LDL组分，其蛋白浓度约为4 mg/mL。
用 2 µM AtRA 处理 HL-60 细胞可诱导其分化为类似中性粒细胞的细胞（dHL-60），细胞体积减小。值得注意的是，在制备 dHL-60 细胞时，应避免使用贴壁细胞培养皿，因为 dHL-60 细胞容易黏附于培养皿表面，导致细胞收获量减少。此外，与 HL-60 细胞相比，dHL-60...
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讨论
本方案描述了由低密度脂蛋白（LDL）共存条件下诱导dHL-60细胞形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）并对其进行制备，随后用于分析人主动脉内皮细胞（HAEC）的反应。本方案的重要之处在于使用含有NETs和LDL的新鲜培养基刺激细胞，而许多其他研究则采用在-20 °C冷冻保存的NETs储备液。由于脂蛋白是脂质-蛋白质复合物，其完整结构和特性在冻融过程中会丧失，导致LDL发生变性和聚集。当前方法的一个优势在于，类中性粒细胞释放的NET形成产物（如去浓缩DNA、组蛋白、髓过氧化物酶（MPO）和弹性蛋白酶）以及脂蛋白均保持完整，并可立即应用于HAEC。因此，在NET形成过程中由类中性粒细胞释放的酶活性得以维持。值得注意的是，本方案的结果可能反映了NETs共孵育对LDL改变的影响。先前有研究报道，天然LDL不会增强PMA处理的dHL-60细胞释放DNA或MPO12。这些数据表明，HAEC的反应可能是由中性粒细胞来源成分诱导的天然LDL改变所引起的。考虑到髓过氧化物酶（MPO）产生的次氯酸反应生成的酶促氧化脂质（包括氯化磷脂和脂肪酸）可诱导炎症反应13，...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分由日本促进科学振兴会（JSPS）科研费（课题编号 23K10897 和 19K07069）资助。我们感谢 Editage（www.editage.jp）对英文文本的语言润色。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1% 聚-L-赖氨酸 | SigmaAldrich | P8920-100ML | |
| 10 cm 培养皿 | Corning | 430591 | |
| 12 孔组织培养板 | Falcon | 353043 | |
| 2% 明胶 | SigmaAldrich | G1393-20ML | |
| 4PC 管 | Himac | S404332A | |
| 全反式维甲酸 | Wako | 188-01113 | 可使用任意供应商产品替代 |
| 纤维素透析管 | MISUMI Group Inc. | 0327-23-37-07 (UC18-32-100) | 可使用任意供应商产品替代 |
| EDTA | Dojindo | 345-01865 | 可使用任意供应商产品替代 |
| 内皮细胞生长培养基 2 试剂盒 | PromoCell | C-22111 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | 可使用任意供应商产品替代 |
| 肝素钠（5,000 单位/5 mL） | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | 可使用任意供应商产品替代 | |
| 高速冷冻离心机 | TOMY | SRX-201 | 加速度：9，减速度：7 |
| 人主动脉内皮细胞 | Lonza | cc-2535 | |
| KBr | Wako | 168-03475 | 可使用任意供应商产品替代 |
| KEYENCE 显微镜软件 | KEYENCE | BZ-II Analyzer | |
| 微量超速离心机 | Himac | CS150GX | |
| 显微镜 | OLYMPUS | CK40 | |
| 显微镜 | KEYENCE | BZ-9000 | 用于延时成像（可选） |
| 显微镜相机 | Nikon | DS-Fi3 | |
| 显微镜相机软件 | Nikon | DS-L4 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 100ML | 可使用任意供应商产品替代 |
| 磷酸盐缓冲液（×10） | 将 2.6 g NaH2PO4·2H2O、29 g Na2HPO4·12H2O、80 g NaCl 和 2.0 g KCl 溶于蒸馏水中，定容至 1 L。 （可使用任意供应商产品替代） | ||
| PMA（佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯） | Wako | 162-23591 | 可使用任意供应商产品替代 |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | （CC-5022：HEPES 缓冲盐溶液，CC-5012：胰蛋白酶/EDTA，CC-5002：胰蛋白酶中和液） |
| 转子 | Himac | S100AT6-0242 | |
| RPMI-1640（含酚红） | Wako | 189-02025 | 可使用任意供应商产品替代 |
| RPMI-1640（不含酚红） | Wako | 186-02155 | 可使用任意供应商产品替代 |
| T-25 培养瓶 | Corning | 3275 |
参考文献
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
- Wang, H., et al. Neutrophil extracellular traps in homeostasis and disease. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 235(2024).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thromb Haemost. 107 (3), 597-598 (2012).
- Meher, A. K., et al. Novel role of IL (Interleukin)-1β in neutrophil extracellular trap formation and abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (4), 843-853 (2018).
- Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (8), 2032-2040 (2013).
- Liu, Y., et al. Myeloid-specific deletion of Peptidylarginine Deiminase 4 mitigates atherosclerosis. Front Immunol. 9, 1680(2018).
- Zhai, M., et al. Extracellular traps from activated vascular smooth muscle cells drive the progression of atherosclerosis. Nat Commun. 13 (1), 7500(2022).
- Abdo, A. I., Rayner, B. S., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. Low-density lipoprotein modified by myeloperoxidase oxidants induces endothelial dysfunction. Redox Biol. 13, 623-632 (2017).
- Mueller, P. A., et al. A method for lipoprotein (a) Isolation from a small volume of plasma with applications for clinical research. Sci Rep. 12 (1), 9138(2022).
- Hosseinzadeh, A., Messer, P. K., Urban, C. F. Stable redox-cycling nitroxide tempol inhibits NET formation. Front Immunol. 3, 391(2012).
- Gupta, A. K., et al. Activated endothelial cells induce neutrophil extracellular traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death. FEBS Lett. 584 (14), 3193-3197 (2010).
- Obama, T., et al. Cooperative action of oxidized low-density lipoproteins and neutrophils on endothelial inflammatory responses through neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 10, 1899(2019).
- Schröter, J., Schiller, J. Chlorinated phospholipids and fatty acids: Patho)physiological relevance, potential toxicity, and analysis of lipid chlorohydrins. Oxid Med Cell Longev. 2016, 8386362(2016).
- Nose, F., et al. Crucial role of perilipin-3 (TIP47) in formation of lipid droplets and PGE2 production in HL-60-derived neutrophils. PLoS One. 8 (8), e71542(2013).
- Manda-Handzlik, A., et al. The influence of agents differentiating HL-60 cells toward granulocyte-like cells on their ability to release neutrophil extracellular traps. Immunol Cell Biol. 96 (4), 413-425 (2018).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Ohinata, H., Obama, T., Makiyama, T., Watanabe, Y., Itabe, H. High-density lipoprotein suppresses neutrophil extracellular traps enhanced by oxidized low-density lipoprotein or oxidized phospholipids. Int J Mol Sci. 23 (22), 13992(2022).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils, and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. J Pathol. 247 (4), 505-512 (2019).
- Xu, J., et al. Differential roles of eosinophils in cardiovascular disease. Nat Rev Cardiol. 22 (3), 165-182 (2025).
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