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方法文章

联合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a检测法用于检测 Fusarium oxysporum 专化型 cubense 热带4号小种

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DOI：

10.3791/68841

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2025年11月14日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University, 2CIRAD, UMR PVBMT, 3Department of Genetics, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a检测技术的方法，用于检测侵入性植物病原菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense 热带4号小种。

摘要

定期且准确的监测是有效管理植物病害的核心。监测结果可指示采取何种措施最为合适，并判断是否需要进行预防、根除或无需采取行动。仅基于寄主植物症状学的监测方法往往不可靠，因为生物和非生物胁迫引起的症状具有相似性。基于实验室的分子检测方法，如聚合酶链式反应（PCR）和定量（q）PCR，是目前最常用且可靠的植物病原检测手段，但其依赖昂贵的设备和熟练的操作人员。本文介绍一种结合简化DNA提取、重组酶聚合酶扩增（RPA）以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas12a（RPA-Cas12a）的技术方案，用于检测入侵性病原菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense 热带4号小种（Foc TR4）。该技术提供了一种简便的单管检测替代方案，分析稳健性强，相较于现有的分子检测方法具有更高的特异性，且无需使用昂贵和复杂的实验室设备。

引言

由土传真菌病原体Fusarium oxysporum f. sp. cubense（Foc）引起的枯萎病，被全球公认为历史上最具破坏性的跨境植物病害之一1。一旦侵入新地区，Foc 会保持潜伏状态，直到感病植株出现症状，这一过程可能持续数月，从而使真菌在未被察觉的情况下定殖并扩散。由于该病原菌可产生抗逆性强的厚垣孢子，且香蕉种植多为多年生模式，一旦定殖，几乎无法通过经济手段根除。因此，预防和早期检测对于保护易受侵害的种植者至关重要1。目前由Foc热带4号小种（TR4）引发的疫情，需要通过定期监测，在高风险区域识别出出现症状的香蕉植株。非生物胁迫因素（如水分胁迫和某些营养元素缺乏）会导致植株外部黄化，其症状与Foc TR4感染相似。此外，不同Foc小种引起的症状也难以区分。因此，必须通过实验室分离纯化，继而进行表型和分子检测，才能实现对Foc TR4的可靠鉴定2。目前已有多种可用于Foc TR4检测的分子检测方法，包括PCR、定量（q）PCR以及环介导等温扩增（LAMP）技术3,4,5,6,7。然而，大多数这些方法仍需昂贵的设备和专业技能，且必须在实验室环境中进行。重组酶介导的等温扩增（RPA）可在恒温条件下进行，因此无需依赖上述设备，适用于田间现场检测方案8。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas系统已越来越多地被用于改进分子诊断技术9。这些系统因成本低廉、操作简便，且无需使用特殊仪器，因而适用于现场检测。基于CRISPR的诊断方法通常包括对目标序列进行等温扩增，随后通过CRISPR-Cas蛋白识别目标序列，并非特异性地切割DNA或RNA荧光报告分子，从而指示目标的存在10,11。在CRISPR-Cas12a系统中，CRISPR RNA（crRNA）引导Cas12a识别并切割核酸靶标。该crRNA可通过与互补序列杂交，设计用于靶向特定的DNA或RNA区域。一旦结合，Cas12a将以单核苷酸特异性切割目标序列，并随之非特异性地切割报告分子12。最近，CRISPR-Cas12a系统已被用于检测多种具有重要经济意义的植物致病真菌13,14,15,16,17,18,19,20。

本方案描述了一种单管检测技术的开发，该技术结合了简化的DNA提取、重组酶聚合酶扩增（RPA）以及CRISPR/Cas12a技术（RPA-Cas12a），用于检测香蕉枯萎病菌热带4号生理小种（Foc TR4），检测结果既可在便携式荧光仪上读取，也可在廉价的发光二极管（LED）蓝光透射仪下肉眼观察21。该方法可进一步优化，用于田间现场检测，以提升防控策略的有效性。类似的方法也可用于设计基于Cas12a的其他植物病原体检测方法。

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方案

1. 植物材料的简化DNA提取

注意：参见图1以了解概览。

  1. 进行DNA提取。
    1. 将每份250 mg的发病假茎组织分别转移至独立的提取袋中（参见材料表）。
    2. 向装有植物材料的提取袋中加入2 mL 0.5 M NaOH-PVP（材料表）。使用研钵等手动研磨器在提取袋中研磨受感染的维管组织。
      注意：如有需要，可额外添加1–2 mL 0.5 M NaOH-PVP，以获得足够的液体提取物。
    3. 向1.5 mL离心管中加入195 µL 100 mM Tris-HCl（pH 8.0）（材料表）。
    4. 用移液器将5 µL提取液从提取袋转移至含有195 µL 100 mM Tris-HCl（pH 8.0）的1.5 mL离心管中，使提取液稀释40倍。
    5. 涡旋振荡离心管15–30秒，随后于-20 °C保存备用。

2. crRNA 合成与质量控制

  1. 进行转录。
    1. 使用RNA转录试剂盒（材料表），向一个0.2 mL的PCR管中加入以下组分：1.5 µL 10x T7反应缓冲液、每种dNTP各1.5 µL、1.5 µL T7 DNA聚合酶混合物、1 µL无核酸酶水，以及10 µL浓度为100 µM的T7模板DNA，总体积为20 µL。
    2. 将PCR管置于37 °C水浴或PCR仪中孵育至少4小时。
    3. 使用分光光度计（材料表）测定转录所得RNA的浓度。用无核酸酶水或TE缓冲液（补充文件1）将RNA稀释至250 ng/µL（共10 µg），终体积为40 µL。
      注：转录后的RNA可保存于-80 °C，待后续进行DNase处理和纯化步骤。
  2. 进行DNase处理及crRNA纯化。
    注：所有步骤均在室温下操作。RNA和DNase I酶需保持在冰上。
    1. 根据RNA纯化试剂盒中提供的DNase I说明书对RNA样品进行处理（材料表）22。
    2. 按照试剂盒说明书中的方案II对RNA样品进行纯化22。
    3. 使用Nanodrop检测纯化后的crRNA浓度与质量 ，用无核酸酶水将RNA稀释至100 ng/µL，并于-80 °C保存备用。
    4. 将crRNA与RNA上样染料（材料表）混合后，在70 °C水浴中加热10分钟，随后在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，以观察合成的crRNA（图2）。

3. 重组酶聚合酶扩增（RPA）-Cas12a 一体化反应管检测 体外 Foc TR4 检测

注意：概述请参见图3。

  1. 准备RPA和Cas12a反应体系。
    注意：确保这些步骤在冰上无DNA污染的环境中进行，所有试剂和材料需预先冷却。实验前用漂白剂和70%乙醇擦拭工作台面和移液器。本研究中使用的所有寡核苷酸信息见表1。
    1. 在另一个0.5 mL离心管（材料表）中配制20 µL Cas12a反应体系，试剂体积如下：2 µL 10x NEBuffer r2.1（50 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，100 µg/mL 重组白蛋白，pH 7.9），0.4 µL 10 µM LbCas12a蛋白，0.6 µL 100 ng/µL crRNA，0.4 µL 10 µM 报告分子，以及16.6 µL 去离子水。
      注意：LbCas12a蛋白、crRNA和报告分子的终浓度均为200 nM。
    2. 在另一个0.5 mL离心管中配制9.5 µL RPA反应体系，试剂体积如下：5 µL 2x反应缓冲液（终浓度为1x，按制造商说明），1.6 µL dNTP混合液（终浓度1.6 mM），1 µL 10x Basic E-Mix（终浓度1x，按制造商说明），0.5 µL 每种RPA引物（10 µM，终浓度各为0.5 µM），0.5 µL 20x Core反应混合液（终浓度1x，按制造商说明），以及0.4 µL 去离子水。
    3. 将一个8联管条插入冰上的离心管架（材料表）中。
    4. 将20 µL Cas12a反应体系加入8联管条的管底。
    5. 将9.5 µL RPA反应体系加入8联管条的管盖中，并向管盖内的RPA反应体系中加入0.5 µL 280 nM MgOAc（终浓度14 nM），通过上下吹打混匀。
    6. 向无模板对照（NTC）管的管盖中加入0.5 µL 去离子水，并小心盖紧，确保RPA与Cas12a反应体系不混合。
      注意：设置无模板对照（NTC）以确保结果的可靠性。
  2. 加入模板DNA并启动反应。
    1. 除NTC外，在含有MgOAc的10 µL RPA反应体系（位于8联管条管盖中）加入0.5 µL 模板DNA；NTC管中以去离子水代替DNA。每次实验均应加入一个已知阳性对照Foc TR4 DNA，以确保检测系统正常工作。通过上下吹打混匀。
    2. 小心盖紧8联管条的管盖，防止RPA与Cas12a反应体系混合。
    3. 打开便携式荧光仪（材料表），为RPA-Cas12a检测创建运行程序（补充文件2）。打开已保存的运行程序，将8联管条放入便携式荧光仪中，在37 °C下孵育30分钟。
      注意：操作8联管条时避免触碰管底，应握住左上和右上外侧边缘。
    4. 30分钟后取出8联管条，翻转6次以混合RPA与Cas12a反应液，然后在小型离心机（见材料表）中离心5秒。
    5. 将8联管条重新放回便携式荧光仪中，使用已保存的运行程序继续在37 °C下孵育30分钟。
  3. 观察结果。
    1. 根据便携式荧光仪测得的平均相对荧光单位（RFUs）进行结果判读（补充文件2及用户手册23）。
    2. 使用蓝光透射仪（补充文件3）在465 nm激发波长的LED蓝光下观察各管荧光，用手机拍摄图像。

   

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结果

使用简化的DNA提取方法，结合RPA-Cas12a检测体系，在Genie III便携式荧光仪中成功检测到感病植物材料中的Foc TR4，结果如图4A所示。阳性样本显示可见荧光（第6-8泳道），而阴性样本终点荧光信号较低（第1-5泳道）。当在LED蓝光下观察样本管时，感染Foc TR4的样本也表现出可见荧光（图4B）。相比之下，未感染Foc TR4的植物组织DNA未产生可见荧光。

香蕉假茎DNA提取过程示意图；包括BIORBEBA袋、NaOH+PVP、涡旋振荡。
图1

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讨论

常规监测是有效预防和控制Foc TR4及其他重要外来有害生物的重要策略。能够在田间应用并快速、准确识别病原体的检测方法，可加快决策进程，并降低监测工作的相关成本。为此，本文介绍的方案结合了简化的DNA提取步骤，直接对采集的植物样品进行处理，随后将提取物用于单管检测体系，整合RPA与Cas12a反应，实现对Foc TR4的快速、高灵敏度检测21。

本文所介绍的RPA-Cas12a联合检测方法最重要的优势之一是其双重特异性。在扩增步骤中，该方法依赖于特异性的RPA引物，随后Cas12a的crRNA对目标序列的识别已被证明具有单核苷酸特异性12。在Cas12a检测方法的初步优化过程中，crRNA的转录最初基于Li等人发表的方案24。由于CRISPR反应效率出现了一些问题，后续改用一种已预先退火T7正向引物和Foc TR4 T7反向引物的合成T7模板进行转录。必须确保该模板经过充分的DNase处理，以彻底去除所有双链DNA，因为该模板含有目标序列，...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务或智力利益。

致谢

我们感谢南非国家研究基金会（项目编号：138109）在非评级研究人员竞争性支持计划下提供的资助。同时，我们感谢欧盟“地平线2020”研究与创新计划玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里学者基金在INDICANTS项目（项目编号：890856）下提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EnGen Lba Cas12a (Cfp1) 蛋白New England BiolabsM0653T
EnGen Lba Cas12a 稀释液New England BiolabsB0653A
Eppendorf PCR 管MerckEP0030124332
Eppendorf Safe-Lock 微量离心管MerckEP0030121708
通用提取袋BIOREBA430100
GeneRuler 100 bp DNA 标准分子量标记Thermo Fischer ScientificSM0241 / SM0242
Genie Centrifuge Mini-6KO 离心机OptiGeneOP-FUGE
Genie IIIOptiGenehttps://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ 
Genie 条带支架OptiGeneGBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03
Genie 条带OptiGeneOP-0008-50 / OP-0008-500
HiScribe T7 高产率 RNA 合成试剂盒New England BiolabsE2040S
NanoDrop ND-1000 紫外/可见光分光光度计Thermo Fischer Scientifichttps://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253
NEBuffer 3New England BiolabsB7003S
NEBuffer r2.1New England BiolabsB6002S
聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 粉末Sigma-Aldrich9003-39-8
RNA 纯化与浓缩-5 试剂盒Zymo ResearchR1013
RNA 上样染料Thermo Fischer ScientificR0641
SmartBlue 蓝光透射仪Accuris InstrumentsE4000-E
氢氧化钠 (NaOH) 颗粒Merck, EMPARTAK277
三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)Merck77-86-1
TwistAmp 液体基础试剂盒TwistDxTALQBAS01

参考文献

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