本文介绍了一种在绵羊膝关节中制备可控性骨软骨缺损的整合性实验方案，旨在建立适用于骨与软骨组织再生研究的实验模型。该方案详细阐述了在股骨髁上诱导全层骨软骨缺损的方法，采用的技术可最大限度减少对动物福利的影响，并降低实验结果的变异性。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
衰老、创伤、遗传易感性和生活方式均会影响人体软骨的退化。一旦受损，日常活动带来的持续性损伤可能引发病理性状况，例如骨关节炎，后者是全球范围内导致残疾和社会经济损失的主要原因。所有治疗关节软骨损伤的骨科医生的主要目标一直是解剖学上减小病变范围、修复软骨表面并重建关节稳定性。动物模型对于治疗药物的开发至关重要，但目前用于软骨缺损的模型仍不理想。绵羊的骨软骨缺损是测试新型疗法和生物材料的宝贵模型，有助于在人体关节环境中实现软骨和骨组织的修复。本研究建立了一种在大型动物中诱导急性骨软骨缺损的高效方案。在双侧股骨内侧髁上创建标准化的缺损。一只膝关节被随机分配接受明胶甲基丙烯酰胺（gelatin-methacryloyl）治疗，而对侧膝关节作为对照。手术后六个月，切除股骨髁区域，将解剖出的膝关节脱钙、石蜡包埋并切片，随后进行苏木精-伊红染色。采用评分系统对病变进行评估。该方法可在损伤诱导后立即进行大体观察。此外，该模型能有效模拟临床软骨缺损，为研究其病理机制及开发创新治疗策略提供了有价值的模型。
引言
软骨通过在双轴关节中提供骨与骨之间的无摩擦表面，防止关节面磨损，对维持骨骼系统的力学功能至关重要1。软骨实现这些高要求力学功能的能力，在很大程度上依赖于其细胞外基质独特的组成和结构，尤其是其极高的含水量。水在关节软骨的结构与功能中起着关键作用，约占其总组成的70–80%。水是软骨在受压时承担负荷的主要成分。该组织抵抗压缩力的能力，取决于水在基质中的结构化程度及其运动受限情况。这种结构的形成依赖于水与软骨主要大分子（如胶原和蛋白聚糖，尤其是与透明质酸结合的聚集体）之间的相互作用1。这些大分子起到限制性结构的作用，有序地约束水的运动。这种相互作用不仅赋予组织刚度，还提供弹性和变形后恢复的能力。自由水、结合水与大分子基质之间的相互作用构成了软骨生物力学行为的核心2。
尽管关节软骨（AC）具有卓越的承受和分散传递至关节的物理与机械负荷的能力，但一旦受损，由于软骨细胞有丝分裂活性低且组织血管化程度差，其自我修复能力十分有限2。关节损伤通常伴随着细胞外基质（ECM）分子和蛋白质的进行性丢失，这些成分占组织总量的95%，并赋予关节软骨生物力学特性3。当ECM组分的合成与降解之间出现失衡，并向分解代谢过程偏移时，可能导致骨关节炎（OA），这是全球最常见的退....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究获得了研究伦理委员会的批准，并获得了编号为6092250823/2023的伦理审查合格证书。在本研究中，选取了九只12月龄的白萨福克雌性绵羊。在每只动物的两个股骨内侧髁上均制造了缺损。空缺损作为对照。每只动物的一侧膝关节随机分配接受GelMA治疗，另一侧作为对照。该策略使我们能够评估天然再生能力，并减少个体差异（如遗传因素和骨骼成熟度）的影响。动物被随访6个月以评估透明软骨的形成情况。
1. 麻醉程序
- 在手术前约 24 小时，使动物禁食禁水。
- 术前通过肌肉注射给予动物哌替啶 4 mg/kg 与咪达唑仑 0.3 mg/kg 进行预处理。
- 使用前一天，在无人的房间内佩戴防护手套填充麻醉蒸发器，以尽量减少职业暴露风险。
- 每次操作前检查麻醉回路是否漏气，并在通风良好的区域进行所有操作，遵循机构的生物安全指南。
- 15 分钟后，使用 18 G 导管对动物进行插管，并以 10 mL∙kg-1∙h-1 的速率输注乳酸林格氏液。
- 采用 1% 丙泊酚静脉麻醉，剂量为 4 mg/kg。
- 使用 7.5–8.0 mm 带套囊的气管导管对动物进行气管插管，并通过半闭合循环呼吸系统维持自主呼吸，氧气输送浓度（FiO₂）为 1.0，流速为 50 mL/kg。
- 采用部分静脉麻醉（PIVA）技术，以 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
骨软骨缺损诱导
本研究旨在建立一种在大型动物中诱导急性骨软骨缺损的高效方案。损伤通过外科手术期间的机械方法产生，形成直径约8 mm、深度5 mm的病灶（图1）。根据国际软骨再生与关节 preservation 学会（International Cartilage Regeneration & Joint Preservation Society）制定的评分标准，此类损伤属于4级损伤，其特征为软骨损伤已累及软骨下骨。
正确的骨钻对齐和精确的深度控制是确保模型可重复性的关键步骤。本研究中，所有穿孔均以0°（直角）进行，以降低软骨和软骨下骨非对称性切除的风险。选择股骨髁最远端区域，并与解剖中心对齐，可减少缺损位置的变异，提高动物间实验的标准化程度。此外，所使用的骨钻带有环形深度标记，能够精确监测穿孔过程中达到的深度，确保缺损特征的一致性。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
为了克服软骨治疗中的挑战，例如软骨细胞分化不足和细胞外基质（ECM）成熟不充分，非临床研究对于评估治疗策略仍然至关重要。既往已有研究报道了采用多种技术建立损伤软骨组织的非临床模型的方法45。然而，目前文献中仍缺乏关于在大型动物膝关节中诱导急性骨软骨损伤的详细报告和标准化操作流程，导致不同研究之间存在较大差异。本文所述方案提供了一种可重复且可靠的方法，用于在大型动物的骨软骨组织中诱导局灶性损伤。
根据巴西卫生监管局（ANVISA）关于先进治疗药物产品（N° 506/2021）的规定，为将创新疗法引入临床实践，非临床研究至关重要。这些研究必须依照GMP标准进行，并有助于评估安全性、生物分布、药代动力学、药效学以及对转化研究至关重要的其他参数45。对于旨在开发治疗受损关节软骨工具的非临床研究而言，动物模型的选择是关键因素之一43。动物体型对应关节大小和软骨厚度，这两个因素对于判断其在人类疾病建模中的适用性至关重要
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由Araucaria基金会（资助编号：PDT2020221000005）提供支持。我们感谢卡洛斯·查加斯研究所和健康工具技术发展计划—RPT-FIOCRUZ的所有工作人员，感谢他们提供FIOCRUZ/PR、细胞技术核心实验室以及巴拉那天主教大学实验农场的显微镜设施。 作者感谢卡洛斯·查加斯研究所—Fiocruz巴拉那研究激励计划提供的经费支持。我们还感谢卡洛斯·查加斯研究所传播办公室的Wagner Nagib在视听制作方面的贡献。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 25号聚甘醇酸缝合线，2-0规格 | Ethicon | 用于一般软组织缝合的缝合线，用于缝合关节囊和皮下疏松结缔组织。 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Invitrogen | PA516863 | 针对β-微管蛋白的抗体，该蛋白与α/β两个亚基共同构成细胞骨架中的微管结构 |
| 麻醉设备 | HB hospitalar | 吸入式麻醉装置 | |
| Axio Scan Z1 | Zeiss, Munich, Germany | 显微镜 | |
| 苄星青霉素G | Ourofino | 抗生素 | |
| 18 G静脉导管 | Solidor | 静脉穿刺导管 | |
| 头孢氨苄 | Virbac | 抗菌治疗药物 | |
| 葡萄糖酸氯己定水溶液 | RIOQUÍMICA | 用于皮肤消毒的抗菌剂 | |
| 带套囊气管插管 7.5–8.0 mm | Solidor | 带套囊气管插管 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 荧光染料 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Gibco | 12100-046 | 细胞培养基 |
| 硫酸二氢链霉素 | Ourofino | 抗生素 | |
| EDTA采血管 | Becton Dickinson | 362788 | 采血管 |
| 伊红 | Neon | 1795 | 用于观察细胞形态的染料，可对细胞质进行染色 。 |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma | E5134 | 促进骨组织的逐步脱矿 |
| 胎牛血清 | Gibco | 12657-029 | 含生长因子的细胞培养添加剂 |
| 福尔马林 | Sigma-Aldrich | 47608 | 用于保存组织形态 |
| 冻干GelMA | TissueLabs | GLMA-LYO-1 | 光交联水凝胶 |
| 哈里斯苏木精染液 | Laborclin | 620503 | 用于观察细胞形态的染料，可对细胞核进行染色。 |
| 异氟烷 | Cristália | 麻醉维持用药 | |
| 10%氯胺酮 | VETNIL | 安乐死操作用药 | |
| 乳酸林格氏液 | Fresenius Kabi | 液体疗法 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM | Gibco | 25030-081 | 细胞培养必需氨基酸 |
| 盐酸利多卡因 | Cristália | 局部麻醉药 | |
| LIVE/DEAD 细胞活性/细胞毒性检测试剂盒 | Invitrogen | L3224 | 用于评估细胞活性的荧光检测试剂盒 |
| 美洛昔康 | Ouro fino | 术后抗炎镇痛药 | |
| 盐酸咪达唑仑 | Cristália | 麻醉前用药 | |
| 单股尼龙缝合线，3-0规格 | Ethicon | 用于皮肤缝合的缝线 | |
| 0.9%氯化钠溶液 | Cristalia | 生理盐水 | |
| 神经定位仪 | Neurolocalizador DL 250 DeltaLife | 通过神经定位仪和外周神经电刺激器引导实施局部麻醉。 | |
| 骨科钻 | 空心微型骨科钻（精细型）- 铬合金钻杆 - Makita品牌 | 用于骨科手术。 | |
| 骨科锤 | Edlo | Neufield锤（10-3155） | 基本参数：长度20 cm，重量560 g；材质：优质不锈钢；用途：适用于需要精确冲击力的创伤科和骨科手术。认证信息：产品通过ISO（国际标准化组织）13485:2016质量认证，符合欧洲标准及良好生产规范。 |
| Lambotte骨凿 | Edlo | Lambotte骨凿（10-0749） | Lambotte骨凿（6 mm × 17 cm / 6 3/4"）是一种高精度外科器械，主要用于涉及骨组织操作的骨科手术和神经外科手术。 其尖端宽6 mm，适用于精细切割、修整以及致密软骨和软骨下骨的去除。 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | 广谱抗生素，广泛用于细胞培养 |
| 盐酸哌替啶 | Cristália | 麻醉前用药 | |
| 19.1%氯化钾 | Samtec | 安乐死操作用药 | |
| 普鲁卡因青霉素G | Ourofino | 抗生素 | |
| 丙泊酚 | Cristália | 麻醉诱导与维持用药 | |
| 乳酸钠林格液 | Cristália | 液体疗法 | |
| 半闭合循环呼吸系统 | HB hospitalar | 麻醉用呼吸回路 | |
| 无菌弹力绷带 | Cremer | 无菌弹力绷带，用于覆盖手术肢体的远端。 | |
| Stimuplex D型，22 G × 2 英寸（50 mm）带延长管的绝缘针，30°斜面（STIMD2250/30） | BBRAUN | 神经周围局部麻醉 | |
| 盐酸曲马多 | Cristália | 术后镇痛药 | |
| 环钻 | 骨用环钻，直径–型号：反角式，品牌：外科WF | 8.0 mm骨采集环钻；由外科级不锈钢制成；用于骨移植手术；可用于获取骨块以进行组织学分析或自体移植。 | |
| 10%赛拉嗪 | VETNIL | 安乐死操作用药 |
参考文献
- Wang, Q., et al. An ultrasound study of altered hydration behaviour of proteoglycan-degraded articular cartilage. BMC Musculoskelet Disord. 14, 289(2013).
- Cederlund, A. A., Aspden, R. M.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
