全层骨软骨缺损绵羊模型的建立与评估

摘要

本文介绍了一个综合方案，用于生成羊膝骨软骨病变，建立适合骨骼和软骨组织再生研究的实验模型。该方案提出了一种诱导股骨髁全层骨软骨缺损的方法，采用技术以最大限度减少动物福利影响和结果的变异性。

摘要

衰老、创伤、遗传易感性和生活方式都会影响人体软骨的退化。一旦受伤，日常活动中持续的侮辱可能引发诸如骨关节炎等病理性疾病，骨关节炎是全球致残和社会经济损失的主要原因。所有治疗关节软骨损伤的骨科医生的主要目标是从解剖学上减小病灶范围，修复软骨表面，并恢复关节稳定性。动物模型对于治疗药物的开发至关重要，但目前关于软骨缺陷的模型并不令人满意。绵羊骨软骨病变是测试新疗法和生物材料的宝贵模型，有助于人体关节环境中软骨和骨骼的恢复。本研究建立了一种高效的大型动物急性骨软骨缺陷诱导方案。在两侧股骨髁均形成标准化病灶。一侧膝关节随机接受明胶甲基丙烯酰治疗，对侧膝关节作为对照组。手术六个月后，股骨髁区域被切除，切除的膝关节脱钙，嵌入石蜡中，切成切片，并用苏木精和伊苏辛染色。评分用于评估病变。该方法允许在损伤诱导后立即进行宏观观察。此外，该模型有效复制临床软骨缺陷，为研究其病理和开发创新治疗方法提供了宝贵模型。

引言

软骨对于骨骼系统的机械功能保持至关重要，因为它在腹泻关节中提供无摩擦的骨骼间面，从而防止关节^表面侵蚀1。软骨执行这些繁重机械功能的能力，很大程度上依赖于其细胞外基质的独特组成和组织——尤其是其极高的含水量。水在关节软骨的结构和功能中起着关键作用，约占其成分的70%-80%。水是压缩过程中承载的主要元素。组织抵抗压缩力的能力取决于水在基质中的结构和限制。这种组织通过水与软骨的主要大分子（如胶原蛋白和蛋白质聚糖，尤其是透明质酸结合的聚集体）相互作用^实现。这些结构起到控制结构的作用，能够有序并限制水流的流动。这种相互作用不仅赋予组织刚性，还增强了弹性和变形后的恢复能力。游离水、结合水和大分子基质之间的相互作用构成了软骨生物力学行为的核心。

尽管关节软骨（AC）在支撑和分散物理及机械载荷方面具有显著能力，但一旦受伤，由于软骨细胞有丝分裂活动低和组织^{血管发育不良}，其自发修复潜力有限。关节损伤通常与细胞外基质（ECM）分子和蛋白质的逐渐丧失有关，这些分子占组织的95%，并赋予AC³生物力学特征。ECM成分合成与降解失衡，转向分解代谢过程，可能导致骨关节炎（OA），这是全球最常见的退行性关节疾病。骨关节炎影响约10-12%的成年人口，引起疼痛、限制行动能力，并显著降低患者的自主性^4.骨关节炎在老龄人群中更为常见，原因是关节在一生中累积性损伤;然而，与临床疾病的发病有关的多种风险因素，如性别、遗传易感性、肥胖和日常习惯。迄今为止，治疗骨关节炎的治疗方法主要包括临床症状管理和最严重病例的全关节置换。缺乏强健、可重复且可靠的治疗策略来有效治疗骨关节炎，因此正在研究创新方法来理解和解决与关节软骨损伤相关的问题。

为了修复、再生和增强关节关节运动，再生医学的进展成为恢复受损AC ^6,7的新希望。自身软骨细胞结合ECM植入和干细胞关节内注射，是该领域当前的前沿 ^8,9,10。这些方法的主要挑战是确保植入细胞能够适当分化和功能性ECM合成。自体软骨细胞倾向于形成纤维软骨或进展为肥大状态，形成新的功能失调组织，无法重现AC的生理特征，导致恢复不完全，且常常晚期退化¹¹。生物材料可用于指导细胞在组织再生过程中的行为，为细胞附着和合成新的、天然且功能性的细胞外基质提供临时支架^12,13,14。软骨工程的理想生物材料必须确保与周围组织，尤其是软骨下骨的牢固整合，因为该界面失效会影响长期修复。然而，骨软骨支架软骨与骨层间的结合较弱以及与宿主组织的整合不良仍是主要挑战¹⁵。尽管支架试图模仿原生骨软骨结构，但复制复杂的界面微观结构仍然困难。这进一步强调了研发具有生物学特性的支架的重要性，这些支架能够同时支持软骨和骨骼再生，同时保持界面稳定性¹⁶。明胶源自胶原蛋白——软骨组织的关键成分——具有细胞结合基序和生物降解性等特性，表明其结合再生因子治疗骨软骨病变时具有作为支持生物材料的潜力。当用甲丙烯酸酐进行化学修饰形成明胶甲基丙烯酰（GelMA）时，它变得可光交联，从而实现注射和原位光聚合，从而提升了再生医学应用中的机械稳定性¹⁷。

骨软骨病变的再生能力有限，这在临床上是一个挑战。采用膝关节损伤大型动物模型进行的临床前研究对于转化研究至关重要，因为它们能够系统评估影响疾病机制和治疗结果的变量。常用的物种包括猪、山羊、狗、马和绵羊，每种物种都有特定的优势和限制，必须在实验设计中加以考虑。此外，所有这些物种在人类中观察到的软骨和骨软骨缺陷的内源性修复有限，¹⁸。为确保这些模型能够预测人类结果，它们必须重现解剖学、生理学和生物力学特性等相关参数¹⁸。作为对比，股骨髁人体关节软骨厚度范围为1.8至2毫米¹⁹毫米，通常需要治疗的软骨病变直径为10毫米或^大于20毫米。

猪模型在软骨和骨软骨再生研究中具有优势，因为关节大小、软骨厚度和负重需求与人类观察到的非常相似¹⁸。一些迷你猪品种，如哥廷根迷你猪，易于操作，骨骼成熟年龄在²¹岁18至22个月之间。软骨厚度范围为1至2毫米，缺损可达6至8毫米，可达¹⁸毫米。骨骼特征，包括小梁厚度、骨增位速率和胶原纤维组织，与人类相似²²。然而，猪模型也有局限性：即使在微型品种中，膝关节（膝关节）也比人类小，限制了大型实验缺陷的产生。此外，大多数研究使用骨骼尚未成熟的动物，因为相关的维护成本可能高估了修复潜力²³。

山羊的关节解剖结构、生物力学和软骨厚度与人类相似²⁴。它们不需要专业设施，易于操作，价格相对^便宜。山羊软骨厚度范围为0.8至2.0毫米，报告的最严重缺陷尺寸为6毫米²⁶毫米。然而，不同品种、体型和性别间软骨厚度存在显著差异，可能导致结果不一致²⁷。软骨与软骨下骨的比例和小梁骨结构也与人类相当²⁸。骨骼成熟相对较晚，介于²⁹岁24至36个月之间。从生物力学角度看，山羊膝关节承受关节压力和周期负荷，类似人类²⁵，尽管步态时膝盖屈曲更大（山羊为50°-70°，人类为<30°），导致接触面积明显³⁰。这种差异，加上更高的峰值压力，可能导致软骨修复效率降低³⁰。

在大型动物模型中，狗因其耐受康复方案、关节固定以及跑步机行走、游泳和受控负重运动训练的能力而^突出。关节软骨厚度范围为0.9至1.3毫米，临界缺损约为4毫米，限制了与^{人体模型的}直接比较。骨骼成熟期在³¹岁的8.5个月到13.7个月之间。在解剖学上，犬膝与人类膝盖不同，不同犬种在生物力学、负荷模式和成熟度上的差异^使得结果的推断更加复杂。尽管解剖结构存在这些差异且缺损较小，犬类模型在康复方案或类似人类的自发软骨病理等研究中依然具有重要价值。然而，其实验性使用受到伦理考虑的限制²⁹。

马模型是目前最大的软骨修复研究动物模型，自然发展出与年龄或创伤相关的软骨病变和骨关节炎，类似于人类³³。马匹表现出与人类相当的解剖和生物力学特征，如直立膝关节、较大关节、软骨厚度在2至3毫米之间接近人类软骨——步态时膝盖完全伸展，以及骨密度^相当。骨骼成熟期在24至48个月之间，常被研究的缺损大小范围为6至20毫米^32,33。限制包括运动时马匹颈关节承受较高的垂直载荷，使植入物承受比人类更大的力量，并阻碍长期愈合³⁵。此外，采购和维护成本高昂，且需要专业设施^。

绵羊因其易得性、性格温顺、对关节手术的耐受性良好以及^{易于操作而}被广泛用作软骨修复研究的模型。绵羊的骨骼成熟通常在²⁵岁左右达到2-3岁。此外，母羊膝在解剖学和生物力学上与人类膝关节相似³⁸。股内侧髁软骨厚度范围为0.7至1.7毫米，骨密度和接触压力也相当，尽管³⁹只羊的骨体积分数更高。由于软骨厚度减小，诱发缺陷常延伸至软骨下骨，使该模型更适合骨软骨缺损研究³²。直径6至8毫米的病变通常发生在股骨髁和滑车³²等部位。此外，羊科模型在双边研究方面具有优势，允许在同一动物内比较处理和对照位点，从而减少宿主相关变异，提高一致性和重复性，并最大限度地减少所需⁴⁰只动物数量。每个模型在与人体生理和生物力学的相似度上各有不同程度。因此，模型选择应在生物学相关性、实际可行性和伦理考量之间取得平衡。本研究纳入了12个月龄的未生育雌羊，评估时间为季节性停息期。

本研究旨在设计一种有效的治疗方案，用于在大型动物中产生急性骨软骨缺损。该方案涉及构建全层骨软骨病灶，以建立适合再生医学研究的模型。此外，GelMA水凝胶的应用被探讨为组织愈合的指导，并作为递送再生分子和细胞的前瞻性方法。该方案概述了在羊膝关节软骨中制造骨软骨病变的手术程序。它适用于多种组织工程应用，包括在其他大型动物模型中诱导类似损伤的再生医学。

方案

该研究获得了伦理委员会的研究批准，并获得了编号为2023年6092250823的伦理展示证书。本研究选中了九只12个月大的白萨福克母羊。该缺损发生在每只动物的两侧股骨内侧髁。空缺陷被用作对照。每只动物一只膝盖随机接受GelMA治疗，另一只作为对照组。这一策略使我们能够评估自然再生能力，并减少遗传因素和骨骼成熟度等个体变异的影响。这些动物被跟踪6个月，以评估透明软骨的形成。

1. 麻醉手术

1. 在手术前，剥夺动物约24小时的食物和水。
2. 在动物预药时，先用肌肉注射美佩利定4毫克/公斤，配合咪达唑仑0.3毫克/公斤。
3. 使用前一天，在房间空的情况下加满麻醉蒸发器，并戴上防护手套，以降低职业暴露风险。
4. 每次手术前检查麻醉回路是否有泄漏，并在通风良好的环境中进行所有操作，遵循机构生物安全指南。
5. 15分钟后，用18克导管给动物穿刺，并以10 mL∙^kg-1∙^h-1剂量给出乳酸林格溶液。
6. 静脉注射麻醉，剂量为4 mg/kg，剂量为1% 丙泊酚。
7. 用7.5-8.0毫米的带袖带气管管插管，并使用半闭式环形呼吸系统维持其自发通气，供氧FiO₂为1.0，流量为50 mL/kg。
8. 采用部分静脉麻醉（PIVA）技术，维持丙泊酚连续输注，剂量为0.1 mg∙^{kg-1 min-1}，仅调整异氟醚浓度以达到适当的手术麻醉水平。在整个手术过程中监控麻醉深度。
9. 在神经定位器引导下，进行股神经和坐骨神经的神经周阻滞。每次阻断注射0.2 mL/kg的2%利多卡因。
   注意：手术应在确认动物处于手术麻醉状态后开始（对蹄部用力捏无反应且无下颌张力）。

2. 体内外科手术

1. 用外用消毒氯己定葡萄糖酸盐消毒剃净膝盖，并将动物置于手术室的背侧仰卧姿势。
2. 通过触摸动物的膝盖来确定关节腔，确定切口的准确位置。做一个双弯曲的皮肤切口（从股骨外侧上髁远端开始，内侧结束于胫骨结节位置）。
3. 识别髌腱、髌骨、髌韧带以及关节囊的内侧部分。切开囊膜，露出内侧股骨髁。膝关节过度屈曲以观察髁关节软骨最远端的区域。
4. 在动物髁区域做一个约3-5厘米的外科切口。去除皮肤下的组织层以接触髁突，并保持切口区域清洁以防止污染。
5. 使用注射器和针头收集滑液。将部分样本转移到EDTA管进行分析，剩余材料用于制备涂片切片。
6. 将牵开器摆放到髁突表面完全暴露的位置。髁暴露得越多，下一步更容易诱发损伤。
   注意：此时请注意动物的爪子。膝盖屈曲或伸展可以帮助暴露髁突。
7. 使用装有8毫米开颅钻头的骨科钻头，在股骨髁中央钻孔直径8毫米、深5毫米的缺损，确保正确对齐以避免误差的尺寸或形状，并保持与关节软骨最远端区域的0°角。
   注意：以最低速度进行开颅，轻柔操作钻头控制，仅用足够旋转切断软骨和软骨下骨，同时在室温下以0.9%氯化钠进行局部冷却，即使速度较低。
8. 使用骨科锤和截骨器进行骨软骨栓的外科拔除手术。
9. 用无菌纱布清洁伤口延伸部分，确保病变内部没有血液和组织碎片。
10. 将200微升液体20%（w/v）GelMA配方（含0.25%锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸盐，LAP）作为光启动剂，涂抹于伤口内部直到表面。
11. 在距离样品约5厘米的位置，将GelMA水凝胶置于395-405纳米（总功率9瓦）下，持续180秒。在这些条件下，估算表面的辐照度为~10 mW/cm²，总曝光能量约为1.8 J/cm²。
    注意：使用紫外线时请佩戴防护眼镜。
12. 小心拆除卷开器。
13. 用不同组织层的独立缝线闭合病灶，以防止浆液瘤形成。所需的缝合数量取决于手术切口的范围。
14. 在缝线上贴上无菌绷带以防止感染。

3. 术后护理

1. 在麻醉恢复期间监测动物，包括生命体征，如心率（70-90次/分钟）、呼吸频率（12-20次呼吸/分钟）、体温（39°C至40.5°C）以及毛细血管充盈时间为1-2秒的正常黏膜。定期触诊面部和股动脉，检查脉搏是否清晰可感知。
   注意：麻醉恢复应在安静、干净、温暖且有软垫的环境中进行，光线最少，噪音也很低。
2. 每天一次，使用局部青霉素（苯扎汀青霉素G：1,250,000 IU;普鲁卡因青霉素G：1,250,000 IU;硫酸二氢链霉素：1.25克;尿素：2.50 克）进行外科部位敷料，持续10天。
3. 确保动物在麻醉醒来后立即保持四足姿势，将重量放在手术肢体上，且无不适迹象。
4. 术后镇痛包括美洛昔康（每24小时0.4毫克/公斤）和曲马多（每12小时2毫克/公斤），持续5天。当使用绵羊皱眉量表⁴¹识别出与疼痛相关的面部表情时，额外给予了一剂救急性曲马多。该量表是基于特定面部动作单元（包括眼窝紧缩、肉面反应、耳朵位置和头部位置）的验证工具，用于评估羊的术后疼痛和困扰。

4. 组织学分析

1. 手术后六个月，执行安乐死。为了在施用安乐死药物前实现深度镇静，先用静脉注射酮胺（10 mg/kg）和木拉嗪（1 mg/kg）给动物用药，剂量故意高于临床程序通常推荐的剂量，以确保深度镇静迅速起效，这符合公认的安乐死方案。随后，给予异丙酚诱导麻醉昏迷。然后，静脉注射氯化钾2 mEq/kg，直到呼吸和心血管停止且所有保护反射消失。
2. 切开远端股骨骨骺，切除髁部区域。将剥离后的膝关节用10%中性缓冲福马林固定，并在34°C下用5%乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙，每3天更换一次EDTA溶液。
3. 将材料嵌入石蜡中，切成4微米的切段。将玻片中的石蜡浸泡在65°C的木烯中，浸泡3 x 5分钟。用乙醇浸泡10-20次（99%、95%、70%），然后用去离子水浸泡5分钟⁴²分钟。
4. 对于赤木精和伊苏素（H&E）染色，切片用哈里斯红素染色，用伊苏木素反染，使用自动载玻片扫描显微镜以20×倍扫描，并使用链接的软件进行分析。
5. 根据国际骨关节炎研究学会（OARSI）组织病理学计划⁴³评估病灶：得分0表示软骨正常;得分1表示表层颤动但无软骨丧失;分数为2对应垂直裂缝，直达浅层下方层，伴有部分表面层板丧失;得分为3表示垂直裂缝或侵蚀延伸至钙化软骨，影响关节面不足25%;得分4、5和6代表垂直裂隙或侵蚀，触及钙化软骨，分别涉及关节表面的25-50%、50-75%及超过75%。
   注：本研究中，具有垂直裂隙或侵蚀且延伸至钙化软骨且涉及关节面超过25%的病变，评分为4分。

结果

骨软骨缺陷诱导

本研究旨在开发一种高效的急性骨软骨缺陷诱导大型动物方案。这些损伤是在手术过程中机械性造成的，导致病灶直径约8毫米，深度约5毫米（见图1）。结合国际软骨再生与关节保护协会的评分，这种损伤属于4级病变，定义为软骨损伤延伸至软骨下骨。

正确的开孔管对准和精确的深度控制是模型可重复性的关键步骤。本研究中，所有穿孔均以0°（直角）进行，降低了软骨不对称和软骨下骨切除的风险。选择股骨髁最远端、与解剖中心对齐的区域，可以减少缺陷位置的变异，促进动物间更好的标准化。此外，这些刺骨机采用了环向深度标记，能够精确监测穿孔时达到的深度，并确保缺陷特性的一致性。

...

讨论

为克服软骨治疗中的挑战，如软骨分化和ECM成熟不足，非临床研究仍是评估治疗策略的关键。此前已有^{多种技术报道}了非临床损伤软骨组织模型的方法。然而，文献中仍缺乏详细报告和标准化程序，导致大型动物膝关节急性骨软骨损伤的案例，导致各研究存在较大差异。本方案描述了一种可重复且可靠的方法，用于在大型动物骨软骨组织中诱导局部损伤。

根据巴西卫生监管局（ANVISA）的说法，为了将创新疗法引入临床实践，非临床研究对于先进治疗药物产品的开发至关重要（编号506/2021）。这些研究必须按照GMP标准进行，并有助于评估安全性、生物分布、药代动力学、药效动力学及其他对转化研究至关重要的参数⁴⁵。对于旨在开发治疗受损关节软骨工具的非临床研究，动物模型是一个重要的考虑因素⁴³。动物体型对应关节大小和软骨厚度，这两个因素对于在人类疾病模型应用中确定实用性至关重要^43...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25号波利卡普罗内缝线，编号2-0	埃西孔		用于一般软组织闭合的缝线线，用于缝合关节囊和皮下细胞组织。
抗体抗β-β--微管蛋白	Invitrogen	PA516863	针对 &β;-微管蛋白的抗体，这两个亚基（α/&β;），构成细胞骨架微管
麻醉装置	圣医院		吸入麻醉设备
Axio 扫描 Z1	德国慕尼黑蔡司		显微镜
苯扎汀青霉素G	乌罗菲诺		抗生素
导尿管18 G	索利多尔		静脉导管
头孢氨苄	维尔巴克		抗菌治疗
氯己定二格鲁康酸水溶液	里奥库和雅库特;米卡		用于皮肤消毒的抗菌剂
带管内管插管7.5–8.0毫米	索利多尔		带管内管插管
达皮	西格玛	D9542	荧光染料
杜尔贝科改良鹰型中型	吉布科	12100-046	细胞培养基
二氢链霉素硫酸盐	乌罗菲诺		抗生素
EDTA管	贝克顿·迪金森	362788	收集管
伊欧辛	霓虹灯	1795	一种用于观察细胞形态的染料，染色等;细胞质。
乙二胺四乙酸	西格玛	E5134	促进骨骼组织的逐渐脱矿
胎牛血清	吉布科	12657-029	细胞培养补充剂，含生长因子
福马林	西格玛-奥尔德里奇	47608	保留组织形态
GelMA液溶脂	组织实验室	GLMA-LYO-1	光交联水凝胶
哈里斯赫马木林	Laborclin	620503	一种用于观察细胞形态、染色细胞核的染料。
异氟拉诺	克里斯特与阿卡特;莉娅		麻醉维持
氯胺酮 10%	维特尼尔		安乐死程序
乳酸林格溶液	弗雷森尼乌斯·卡比		液体疗法
L-谷氨酰胺 200 mM	吉布科	25030-081	细胞培养中的必需氨基酸
盐酸利多卡因	克里斯特与阿卡特;莉娅		局部麻醉
活/死存活/肝中毒套件	Invitrogen	L3224	用于评估细胞存活能力的荧光检测套件
美洛昔康	Ouro fino		术后期间的抗炎和镇痛药
盐酸咪达唑仑	克里斯特与阿卡特;莉娅		麻醉前药物
单硝基缝线，编号3-0	埃西孔		用于皮肤闭合的缝线
氯化钠 0.9%	克里斯塔利亚		生理盐水溶液
神经定位器	神经定位器 DL 250 DeltaLife		局部麻醉由神经定位器和周围神经电刺激器引导。
骨科钻头	插管迷你骨科钻（精致）- 镀铬芯棒 - Makita 品牌		用于骨科手术。
骨科锤及nbsp;	埃德洛	哈默·诺伊菲尔德（10-3155）	一般特征：长20厘米，重量560格令;材料：高品质不锈钢;用途：适用于需要受控冲击的创伤和骨科手术。认证：产品拥有如国际标准化组织（ISO）13485：2016等质量认证，符合欧洲合规性和良好生产规范标准。
兰博特截骨器	埃德洛	兰博特骨节（10-0749）	兰博特截骨器（6毫米 x 17厘米 / 6 3/4英寸）是一种高精度手术器械，主要用于骨科手术和涉及骨骼操作的神经外科手术。 其尖端宽6毫米，非常适合精细切割、重塑和移除紧密软骨和软骨下骨。
青霉素链霉素	吉布科	15140-122	广泛用于细胞培养的广谱抗生素
盐酸哌啶	克里斯特与阿卡特;莉娅		麻醉前药物
氯化钾 19.1%	Samtec		安乐死程序
普鲁卡因青霉素G	乌罗菲诺		抗生素
丙泊酚	克里斯特与阿卡特;莉娅		麻醉感应与维持
乳酸林格	克里斯特与阿卡特;莉娅		液体疗法
半闭环呼吸系统	圣医院		麻醉用呼吸回路
无菌绉纱绷带	克雷默		无菌的可皱绷带，用于覆盖被手术肢体远端。
Stimuplex D，22 Ga. x 2英寸。（50毫米）绝缘针带延长针组，30°斜角（STIMD2250/30）	布劳恩		神经周围局部麻醉
曲马多盐酸盐	克里斯特与阿卡特;莉娅		术后镇痛
钻头	骨头钻，毫米直径及无误;型号：Contra-Angle，品牌：外科手术WF		8.0毫米骨收集钻头;生产外科钢;用于骨移植手术;用于组织学分析或自体移植时移除骨块。
木苯胺 10%	维特尼尔		安乐死程序