基于 MTT 的甘油释放正常化，用于准确定量原代大鼠附睾脂肪细胞中的脂肪分解

Summary

实验伪影，包括细胞活力的波动和测定干扰，阻碍了富含脂质的原代脂肪细胞中甘油释放的准确定量。为了缓解这些挑战，使用基于 MTT 的归一化策略来调整细胞代谢活性的甘油测量值，从而提高脂肪分解定量的可靠性。

Abstract

脂肪分解是一种关键的代谢途径，涉及将储存的甘油三酯水解成游离脂肪酸和甘油。然而，富含脂质的原代脂肪细胞中甘油输出的准确定量经常受到实验伪影的混淆，例如细胞活力的变异性和测定干扰。为了解决这些局限性，建立了一种简单的方法，使用基于 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物 （MTT） 的细胞活力测定对甘油释放测量值进行标准化。该协议利用脂肪细胞和水溶液之间的比重差异，能够同时量化脂肪分解输出和细胞活力。在药物筛选实验中，普伐他汀和辛伐他汀显着增强了腹部脂肪细胞中甘油的释放，而阿托伐他汀和洛伐他汀没有显着改变甘油输出。这些发现表明，基于MTT的归一化为准确量化脂肪分解提供了一种稳健而便捷的方法，在针对肥胖和代谢综合征的药物发现中具有潜在的应用。这项研究强调需要重新评估传统的脂肪分解测定，以区分真正的代谢反应和非特异性膜渗漏。

Introduction

脂肪组织可分为白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）¹。WAT以甘油三酯的形式发挥过量能量储存的功能，而BAT则具有发热维持体温的功能，在寒冷^的刺激下将化学能转化为热能1。脂肪组织还具有内分泌功能².它可以分泌多种激素、细胞因子和代谢物（统称为脂肪因子），通过调节来自中枢神经系统的求食行为和^{周围组织的}代谢活动来控制身体的能量平衡2。

脂肪分解是在一系列脂肪分解酶的作用下细胞内脂质的逐步水解过程^3,4。在脂肪细胞中，脂质主要以甘油三酯的形式储存在脂滴中⁵。脂滴覆盖有脂滴相关蛋白外利脂家族，可防止脂肪分解酶^水解甘油三酯^6,7。然而，当脂肪分解信号增强时，脂肪细胞中外利脂家族的表达水平降低，脂肪分解酶进入脂滴^3,4。因此，甘油三酯分解成甘油和游离脂肪酸^3,4,5。

脂肪分解，即将储存的甘油三酯分解成甘油和游离脂肪酸，是脂肪细胞代谢的基本过程⁸。虽然直接测量甘油等脂肪分解产物提供了有价值的见解，但准确定量一直具有挑战性，特别是在悬浮的原代脂肪细胞中，由于实验组之间细胞数量差异引起的作错误。本研究旨在通过采用细胞活力测定来正常化原代大鼠腹部脂肪细胞中甘油释放的量化来应对这一挑战。通过标准化测量方法，标准化甘油释放测定被应用为靶向脂肪细胞肥胖和代谢综合征的药物发现的潜在工具。

Protocol

该协议利用脂肪细胞和水溶液之间的比重差异，能够同时测量甘油释放（作为脂肪分解的指标）和 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物 （MTT） 细胞活力在 96 孔板的同一孔中，从而简化实验工作流程并提高效率。

所有动物程序均符合 ARRIVE 指南，并按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南（NIH 出版物第 8023 号，1978 年修订）进行。该研究方案已获得机构动物护理和使用委员会的批准（批准号202112,2021 年 5 月 5 日批准）。本研究中使用的雄性 Wistar 大鼠至少 8 周龄，在标准饲养条件下体重为 ≥200 g。收集附睾白色脂肪组织，典型产量为每只大鼠0.6-0.8 g。值得注意的是，老年大鼠或喂食高脂肪饮食的大鼠表现出显着增加的白色脂肪组织质量（通常为 1.5-3 g），需要按比例调整消化酶（例如胶原酶）浓度以保持一致的组织解离效率。仅使用雄性大鼠避免了雌性发情周期激素波动的潜在混杂效应。菌株选择（例如，Sprague-Dawley、Wistar 或 Long-Evans）在实验中保持一致，以确保脂肪组织反应的遗传均匀性。所使用的试剂和设备列在 材料表中。

1.原代大鼠腹部脂肪细胞的分离

1. 腹腔注射7%水合氯醛（溶解在蒸馏H₂O中）麻醉雄性成年Wistar大鼠（遵循机构批准的方案）。
2. 通过检查是否没有反射反应来确认完全麻醉，然后使用无菌手术剪刀做一个腹部中线切口。
3. 小心地去除附睾脂肪垫左右两侧的内脏脂肪组织。
   注意：附睾脂肪细胞相对较大且有浮力，便于分离和分析。
4. 将收集的组织转移到磷酸盐缓冲盐水（PBS; 图1A）。
5. 用PBS洗涤组织两次，去除杂质，包括粘附的血管和血栓。
6. 将洗净的纸巾切成小块。

2.原代大鼠腹部脂肪细胞的纯化

1. 将解剖的脂肪组织与胰蛋白酶和II型胶原酶（10mg在10mL胰蛋白酶溶液中）在37°C下摇动孵育2小时。
2. 通过细胞过滤器过滤消化的脂肪组织（图1A）。
3. 在室温下以 120 × g 离心滤液 3 分钟，以去除残留的酶活性。
4. 将悬浮的脂肪细胞（上部白色层）转移到干净的管中并用PBS洗涤。
5. 在室温下以 120 × g 离心滤液 3 分钟以除去 PBS。
6. 将过滤后的脂肪细胞（上白色层）在补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素 - 链霉素溶液的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中孵育不超过 30 分钟。

3. 甘油释放分析

1. 将过滤后的脂肪细胞（每孔 10^{个 4-10 个 5} 个细胞;200 μL）接种在 96 孔细胞培养板中。
   注意：使用标准血细胞计数器定量脂肪细胞。由于脂肪细胞大小变化较大，一些较大的细胞无法准确计数。因此，细胞计数可能无法准确反映脂肪细胞的实际数量。主要目标是实现细胞在孔中的均匀分布，而不是精确定量。
2. 用0.05%二甲基亚砜（DMSO;作为对照组）和50μM阿托伐他汀，普伐他汀，洛伐他汀和辛伐他汀在37°C下轻轻摇动4小时处理脂肪细胞。
   注意：这些治疗条件仅供参考，可根据实验的具体目标和设计根据需要进行调整。
3. 收集细胞培养基（下红色层）以分析甘油释放，这表明脂肪分解的开始（图1B）。
4. 使用商业甘油释放测定试剂盒评估脂肪细胞脂肪分解对不同治疗的反应。
5. 使用酶标仪测量 570 nm 处的吸光度。

4. 细胞活力分析

1. 将浓度为5mg/mL的MTT粉末溶解在蒸馏H₂O中，使用前通过0.22μm过滤器灭菌。
2. 甘油释放分析后，将MTT溶液（至最终0.5mg / mL）加入细胞中，并在37°C下孵育2小时。
3. 将悬浮的脂肪细胞（上部紫色层）转移到含有DMSO的干净管中，以分析细胞活力（图1B）。
4. 短暂涡旋溶解形成的紫色甲臜晶体。
5. 使用酶标仪测量 570 nm 处的吸光度。

5. 归一化计算

1. 一式三份进行所有实验并重复四次（n = 4）。
   注意：对于每个独立实验（n = 4），从三只大鼠中分离脂肪细胞，并且每个治疗条件一式三份进行。
2. 对于每个治疗组，将甘油释放吸光度值除以相应的细胞活力吸光度值。
3. 将数据表示为平均值±标准差 （SD）。
   注意：使用函数 = AVERAGE（range） 和 =STDEV 的 Microsoft Excel 计算平均值和 SD。S（范围）。对于组比较，使用 GraphPad Prism 6 和比较均值的函数 t 检验进行未配对双尾 t 检验 。
4. 使用学生 t 检验确定组间差异的统计显着性， P 值小于 0.05 被认为是具有统计学意义的。

Results

经初步药物筛选后，采用降脂药物他汀类药物，通过归一化甘油释放法⁹研究脂肪细胞的脂肪分解作用。

他汀类药物对原代大鼠腹部脂肪细胞甘油释放的影响
通过用50μM普伐他汀，辛伐他汀，阿托伐他汀，洛伐他汀和0.5%DMSO处理细胞4小时，评估他汀类药物对原代大鼠腹部脂肪细胞脂肪分解的影响。甘油释放分析表明，与对照组相比，普伐他汀和辛伐他汀治疗诱导了脂肪分解作用（图2）。然而，仅在普伐他汀治疗下观察到脂肪分解的显着诱导（P < 0.05），而辛伐他汀治疗时未观察到脂肪分解的显着诱导（图2）。

他汀类药物对原代大鼠腹部脂肪细胞正常化甘油释放的影响
为了提高精度并减少处理错误，MTT细胞活力测定用于定量原代大鼠腹部脂肪细胞释放甘油的标准化。MTT测定结果显示，与对照组相比，...

Discussion

这项研究提供了一种更准确的方法来测量富含脂质的原代脂肪细胞的脂肪分解。研究发现，普伐他汀和辛伐他汀可诱导大鼠附睾脂肪细胞释放甘油并降低活力，而阿托伐他汀和洛伐他汀则没有显示出显着作用。辛伐他汀的给药导致脂肪细胞中甘油释放的增加最小。为了解决这个问题，采用MTT测定来标准化脂肪分解的测量。这种方法揭示了在评估普伐他汀和辛伐他汀诱导的脂肪分解作用方面显着增强，这可能归因于它们对细胞活力的影响。

脂肪分解评估的方法学进步
这项研究强调了利用 MTT 测定来评估富含脂质的原代脂肪细胞脂肪分解的重要性和益处。通过整合该方法，脂肪分解测量成功归一化，特别是在脂肪细胞活力可能受到实验条件或测试化合物影响的情况下。这种标准化过程可以更清楚地评估普伐他汀和辛伐他汀诱导的脂肪分解作用，而这些作用可能会被细胞活力的变化所掩盖。因此，这种方法提供了一种更精确、更可靠的方法来评估原代脂肪细胞的脂肪分解，提高脂肪分解研究的准确性，并促进旨在调节脂肪细胞功能的药物开发工作。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-&微;M 过滤器	山工生物科技有限公司 （Sangon Biotech Co.， Ltd.）	F513165-0001	注射器过滤器，水疗系统，无菌
3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物	山工生物科技有限公司 （Sangon Biotech Co.， Ltd.）	A600799-0001	1 克
96孔细胞培养板 	山工生物科技有限公司 （Sangon Biotech Co.， Ltd.）	F603204-0001	无菌的
阿托伐他汀钙盐	开曼化学	10493-5	5 毫克
细胞过滤器	山工生物科技有限公司 （Sangon Biotech Co.， Ltd.）	F513450-0001	80筛网
水合氯醛	山工生物科技有限公司 （Sangon Biotech Co.， Ltd.）	A500288-0250	250 克
二甲基亚砜	山工生物科技有限公司 （Sangon Biotech Co.， Ltd.）	A460700-0100	100 毫升
Dulbecco's 改良鹰培养基	山工生物科技有限公司 （Sangon Biotech Co.， Ltd.）	E600003	500 mL，高葡萄糖，无菌
胎牛血清	山工生物科技有限公司 （Sangon Biotech Co.， Ltd.）	E600001	100 毫升，无菌
甘油比色检测试剂盒	开曼化学	10010755-96	96 孔
洛伐他汀	开曼化学	10010338-5	5 毫克
雄性成年大鼠	莆田大学	威星	大约 10-12 周
青霉素-链霉素溶液	山工生物科技有限公司 （Sangon Biotech Co.， Ltd.）	B540732-0010	10 mL，无菌
磷酸盐缓冲盐水	山工生物科技有限公司 （Sangon Biotech Co.， Ltd.）	E607009-0500	500 mL，无菌，不含钙或镁
普伐他汀钠盐	开曼化学	10010343-5	5 毫克
辛伐他汀	开曼化学	10010344-5	5 毫克
胰蛋白酶溶液	山工生物科技有限公司 （Sangon Biotech Co.， Ltd.）	E607003-0100	100 mL，不含 EDTA 和酚红，无菌
II型胶原酶	山工生物科技有限公司 （Sangon Biotech Co.， Ltd.）	A004174-0100	100 毫克