中国台湾地区植物Hippophae rhamnoides subsp. sinensis与Hippophae gyantsensis多糖含量及抗氧化活性的比较研究

摘要

本研究比较了多糖含量 Hippophae rhamnoides 亚种. sinensis 鲁西和 Hippophae gyantsensis (Rousi) Y. S. Lian 通过热水提取法获得，并采用苯酚-硫酸比色法进行定量。我们还研究了 体外 这两种多糖的抗氧化活性 沙棘 通过2,2-二苯基-1-苦基肼自由基清除实验测定物种的抗氧化活性。

摘要

本文报道了一项设计严谨且深入的比较研究，涉及两种多糖的得率、含量及抗氧化活性 沙棘 具有重要研究价值的物种，即 Hippophae rhamnoides 亚种. sinensis Rousi 和 Hippophae gyantsensis (Rousi) Y. S. Lian。总多糖的 H. rhamnoides 亚种 sinensis 和 H. gyantsensis 通过热水提取获得。比较了得率，并采用苯酚-硫酸比色法准确测定多糖含量并进行比较。同时，通过2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）自由基清除法评估多糖的抗氧化活性。结果表明，多糖得率（粗提物占原料的质量百分比） H. rhamnoides 亚种 sinensis (1.18% ± 0.02%) 显著低于 H. gyantsensis (3.12% ± 0.06%) (P < 0.01）。多糖含量（定义为提取物中的纯多糖） H. rhamnoides 亚种 sinensis (352.97±1.07 mg/g) 显著高于 H. gyantsensis (300.21 ± 1.49 mg/g) (P < 0.01）。DPPH自由基清除活性的半抑制浓度 H. rhamnoides 亚种 sinensis 多糖（0.026 ± 0.004 mg/mL）略低于 H. gyantsensis 多糖（0.021 ± 0.004 mg/mL）。然而，两者之间未发现显著差异 沙棘 物种（P > 0.05）。本实验阐明了多糖得率、含量及抗氧化活性之间的差异 H. rhamnoides 亚种 sinensis 和 H. gyantsensis本研究可为沙棘的质量评价及其多糖活性成分的深入开发提供科学依据。

引言

沙棘是胡颓子科植物的干燥成熟果实。它在中国是一种常用的药食两用材料，因其具有健脾消食、止咳化痰、活血化瘀等功效，同时也是印度、俄罗斯、芬兰及其他欧洲国家膳食补充剂和保健品的重要来源¹。沙棘含有丰富的生物活性成分，如黄酮类、酚类化合物、多糖、苷类和有机酸，在传统中医药中已有长期应用历史^2,3。通常认为，黄酮类化合物是沙棘中最重要的生物活性成分。然而，近年来研究发现沙棘多糖也具有优良的生理和药理活性，因而受到科研人员的广泛关注。研究表明，沙棘多糖具有调节免疫系统、保肝、调节脂质代谢紊乱和肠道菌群的作用，同时还具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和降血糖等效应^4,5,6。沙棘多糖可作为天然抗氧化剂，有助于开发新型功能性食品和药物。同时，沙棘多糖也易被胃酸降解，有利于人体对营养物质的吸收与利用^7,8。

热水提取法（HWE）、微波辅助提取法和超声辅助提取法是提取沙棘多糖的常用方法⁹不同提取方法获得的多糖结构存在差异¹⁰单糖组成、分子量（Mw）、支化度、糖醛酸含量、糖苷键类型及三螺旋构象^11,12通常，高分子量多糖溶液具有较高的黏度和较低的溶解度，这可能影响其生物活性及应用¹³HWE 是实验室和工业环境中最常用的多糖提取技术，因其具有操作简便的优势。^14,15此外，它也是提取沙棘多糖最常用的方法之一。⁹因此，在本研究中，采用热水提取法提取多糖。测定多糖含量的主要方法包括苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。^16,17,18,19苯酚-硫酸法因其检测步骤简单、稳定性好且灵敏度高而被广泛应用²⁰文等人通过苯酚-硫酸法测定从沙棘中提取的多糖含量²¹因此，在本实验中采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。苯酚-硫酸反应生成的橙色化合物溶液的深浅与多糖含量成正比，可在490 nm波长处进行测定。²².

天然多糖具有显著的抗氧化活性 体内 和 体外. 树莓多糖可能通过调节肠道菌群缓解高脂饮食模型中的氧化应激²³多糖是主要的活性成分 Pueraria lobata 并表现出多种生物活性，包括抗氧化作用²⁴. Dou 等人发现，黑莓多糖具有抗氧化等生理功能²⁵多糖的抗氧化活性通常根据其清除多种自由基的能力进行评估，包括2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、羟基和超氧阴离子自由基，以及其对ABTS自由基阳离子的清除能力。²⁶DPPH分析被广泛应用，因为它通过氢原子转移反应，检测抗氧化剂将紫色的DPPH自由基还原为淡黄色稳定分子的能力。²⁷剩余的紫色DPPH自由基通过紫外-可见（UV-Vis）分光光度计在约515–520 nm处进行定量，以测定抗氧化活性^28,29.

先前的研究已探讨了沙棘多糖的成分及其抗氧化活性²¹然而，绝大多数这些研究仅局限于 Hippophae rhamnoides 亚种 sinensis. 它是最常使用且分布最广的 沙棘属 中国记录的物种，并被正式收录于 中国药典. 关于 中国台湾沙棘，一种中国西藏特有的物种，常用于藏药，并在文献中有所记载 四川省藏药材目录，鲜有报道。此外，尚无研究比较过不同来源多糖的成分及其抗氧化活性 沙棘 物种，即， H. rhamnoides 亚种 sinensis 和 H. gyantsensis因此，本研究首先比较了多糖含量 H. rhamnoides 亚种. sinensis 和 H. gyantsensis 通过热水提取法提取，并采用苯酚-硫酸比色法进行定量。这两种多糖的抗氧化活性 沙棘 通过DPPH自由基清除实验进一步研究了这些物种。本研究有望为上述两种物种活性多糖组分的质量评价及深入开发提供科学依据 沙棘 物种

方案

1. 样品与材料

1. 从青藏高原采集不同种Hippophae的沙棘样品。
   注：样品由成都中医药大学副教授Yue Liu鉴定。凭证标本保存于成都中医药大学民族医药学院。采样信息见表1。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。
2. 将样品置于40 °C烘箱中干燥72 h。
3. 将每种沙棘样品各取20 g研磨成粉末，过3号筛。每份样品设三个平行重复。对未能通过筛网的样品继续粉碎，再行过筛，直至全部通过。
4. 将样品于−20 °C保存，用于后续研究。

2. 沙棘多糖的提取

注意：本研究采用先前已建立的沙棘多糖提取方法，并稍作修改以获取多糖³⁰。

1. 称取5.0 g沙棘样品粉末，置于250 mL圆底烧瓶中。加入50 mL无水乙醇至粉末中，在室温（RT；25 °C）下浸泡24 h，以去除脂溶性成分。每个样品设置三个平行重复。
2. 使用布氏漏斗过滤已浸泡过夜的样品粉末，弃去滤液，收集滤渣。用50 mL去离子水洗涤滤渣三次，并在40 °C下干燥至恒重。
3. 将脱脂后的滤渣转移至已干燥的250 mL圆底烧瓶中，按固液比1:30（g/mL）加入150 mL去离子水，在80 °C水浴中回流提取两次，每次2 h。分离滤液，得到粗沙棘多糖溶液。
4. 使用旋转蒸发仪在50 °C下浓缩提取液1.5 h。将浓缩后的溶液于4 °C冰箱中保存备用。
5. 按Sevage试剂与粗多糖溶液体积比1:4的比例，向粗多糖溶液中加入Sevage试剂（CHCl₃:C₄H₉OH = 4:1, v:v），在转速为1050 rpm的磁力搅拌器上搅拌20 min。
6. 将液体转移至50 mL离心管中，在4000 × g下离心15 min，收集上清液。重复上述操作三次，直至两相界面处不再出现白色絮状沉淀为止。
7. 对去除蛋白后的沙棘多糖提取液进行浓缩，按1:3的体积比加入无水乙醇进行醇沉，并于4 °C下静置过夜。
8. 弃去上层无水乙醇，将混合物转移至50 mL离心管中，在4000 × g下离心15 min，收集沉淀。将沉淀冷冻干燥，得到总多糖。
9. 使用下方公式（1）计算总多糖得率：
   
   注：公式（1）中，m表示沙棘多糖的质量（g），M表示沙棘样品的质量（g）。

3. 多糖含量测定

1. 溶液制备
   1. 苯酚试剂溶液的制备
      1. 准确称取3 g苯酚，转移至棕色容量瓶中。加入50 mL去离子水溶解苯酚。
      2. 充分振荡混合物至均匀。标记容量瓶并保存备用。
   2. 葡萄糖标准溶液的制备
      1. 准确称取10 mg无水葡萄糖，转移至10 mL容量瓶中。加入去离子水溶解葡萄糖，并充分振荡混合。
      2. 用去离子水稀释至刻度，得到葡萄糖标准溶液。
   3. 待测样品溶液的制备
      1. 准确称取5 mg冻干沙棘多糖（ZG1-ZG5和JZ1-JZ5）至容量瓶中（n = 10）。向每个容量瓶中加入去离子水，定容至50 mL。
      2. 超声处理20分钟，直至多糖完全溶解。每个样品设置三个平行重复。
2. 标准曲线的绘制
   注意：在苯酚-硫酸法中，多糖与浓硫酸反应生成糠醛类衍生物，后者与苯酚缩合形成橙黄色化合物。该化合物的最大吸收波长约为490 nm。因此，本实验的检测波长设定为490 nm²²。
   1. 用去离子水将葡萄糖标准溶液稀释至0.1 mg/mL。使用微量移液器，分别准确移取200、300、400、500、600和700 µL葡萄糖标准溶液至六个洁净的试管中。用纯水补足至总体积1.0 mL，轻轻混匀，确保稀释均匀。
   2. 向上述试管中各加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL硫酸。充分混匀，冷却后于室温（RT）静置30分钟。
      注意：苯酚为有毒化学品，浓硫酸具有强腐蚀性。配制苯酚和硫酸溶液时应佩戴手套，并在通风橱内操作。
   3. 将上述样品转移至比色皿中，以纯水作为空白对照（代替样品），使用紫外-可见分光光度计在490 nm处测定吸光度，每个样品测定三次。
   4. 以葡萄糖浓度为横坐标（x轴），吸光度值为纵坐标（y轴）绘制标准曲线。获得回归方程并计算相关系数（R²）。
      注意：紫外-可见分光光度计必须提前预热半小时。本步骤测定时，吸光度值应控制在0.2～0.8之间，因此需对样品浓度进行定量调整。
3. 方法学研究
   1. 精密度试验：
      1. 取JZ2，按照步骤3.1.3所述方法制备供试品溶液。按照步骤3.2.2所述方法进行苯酚-硫酸比色法操作。
      2. 随后，按照步骤3.2.3所述程序测定吸光度，重复操作六次，计算相对标准偏差（RSD）。
   2. 稳定性试验：
      1. 按照步骤3.1.3所述方法制备JZ2样品溶液。在样品制备后0、2、4、6、8和10小时，按照步骤3.2.2规定的方法进行苯酚-硫酸比色法操作。
      2. 然后，按照步骤3.2.3所述程序测定吸光度，并计算RSD。
   3. 重复性试验：
      1. 按照步骤3.1.3所述方法制备JZ2样品溶液，平行制备六份。按照步骤3.2.2规定的方法进行苯酚-硫酸比色法操作。
      2. 之后，按照步骤3.2.3所述程序测定吸光度，并计算RSD。
   4. 加样回收率试验：
      1. 取JZ2，按照步骤3.1.3所述方法制备供试品溶液，平行制备九份。分别加入相当于样品中总多糖含量80%、100%和120%的对照品溶液，每种浓度制备三个平行样品。
      2. 按照步骤3.2.2规定的方法进行苯酚-硫酸比色法操作。随后，按照步骤3.2.3所述程序测定吸光度，并利用公式（2）计算回收率。
         
         注意：在公式（2）中，A 表示沙棘样品溶液中葡萄糖的含量，B 表示加入的葡萄糖量，C 表示含有葡萄糖和沙棘样品溶液的实测值。
4. 含量测定
   1. 按照步骤3.1.3所述方法制备样品溶液，并按照步骤3.2.2规定的方法进行苯酚-硫酸比色法操作。
   2. 按照步骤3.2.3所述程序测定吸光度，利用标准曲线法计算多糖含量。每个样品平行操作三次。

4. DPPH自由基清除活性^31,32

1. 准确称取2.7 mg DPPH至一个空的50 mL容量瓶中，加入50 mL无水乙醇溶解，配制成浓度为0.054 mg/mL的DPPH储备液，并获得DPPH工作液。
   注意：DPPH溶液应避光保存。
2. 准确称取5 mg维生素C（Vc）至一个空的10 mL容量瓶中，用10 mL去离子水溶解，配制成浓度为0.5 mg/mL的Vc溶液。依次稀释，得到浓度分别为0.5、0.125、0.03125、0.0078125和0.001953 mg/mL的Vc测试溶液。
3. 准确称取每种沙棘多糖（ZG1-ZG5和JZ1-JZ5）各5 mg，分别溶于10 mL去离子水中，配制成浓度为0.5 mg/mL的沙棘多糖样品溶液。将上述溶液依次稀释，得到浓度分别为0.5、0.125、0.03125、0.0078125和0.001953 mg/mL的沙棘多糖测试溶液。
4. 以DPPH溶液作为底物，在96孔板中设置以下组别：阴性对照组A₀（150 µL水 + 50 µL DPPH溶液）、样品组A₁（150 µL样品或Vc溶液 + 50 µL DPPH溶液）和样品对照组A₂（150 µL样品 + 50 µL无水乙醇）。每组实验设三个重复。
5. 在避光条件下反应30分钟，随后在517 nm处测定吸光度。重复实验三次，使用公式（3）计算DPPH自由基清除率。
   注意：DPPH溶液的吸光度应维持在0.7 ± 0.02范围内。过高或过低的浓度会导致吸光度读数不准确，从而影响最终实验结果。
   
   在公式（3）中，A₀为去离子水与DPPH溶液的吸光度，A₁为样品或Vc与DPPH溶液的吸光度，A₂为样品与无水乙醇的吸光度。
6. 半抑制浓度（IC₅₀）的计算
   1. 建立一个条理清晰的数据表格，展示反应测试化合物浓度（0.5、0.125、0.03125、0.0078125和0.001953 mg/mL）与其对应反应百分率之间的相关性。
   2. 采用非线性曲线拟合（使用GraphPad Prism软件）确定IC₅₀值及其标准误差。

结果

粗多糖的得率
采用热水提取法（HWE）提取多糖。水浴回流过程如补充图1所示。多糖提取液的浓缩情况见补充图2。脱蛋白后离心分层效果见补充图3。五个批次的H. rhamnoides subsp. sinensis多糖得率分别为0.89% ± 0.01%、0.78% ± 0.02%、1.63% ± 0.03%、1.50% ± 0.01%、1.12% ± 0.03%，平均得率为1.18% ± 0.02%（表2）。在步骤2.5中，五个批次的H. gyantsensis多糖得率分别为2.65% ± 0.07%、3.94% ± 0.06%、3.53% ± 0.05%、2.63% ± 0.08%和2.83% ± 0.05%，平均得率为3.12% ± 0.06%（表2）。t检验结果显示，两个物种间的多糖得率差异具有统计学显著性（P < 0.01）。本研究结果表明，H. gyant...

讨论

沙棘是一种传统藏药。多糖是沙棘的重要组成成分。目前已有大量关于沙棘多糖含量测定及其抗氧化活性的研究。²¹然而，仅有少数研究对不同多糖的含量及其抗氧化活性进行了比较 沙棘 物种，例如药用物种 H. rhamnoides 亚种 sinensis 和 H. gyantsensis因此，本研究测定了两种多糖的含量 Hippophae 通过苯酚-硫酸比色法测定多糖含量，并采用DPPH自由基清除实验评估其抗氧化活性。

本实验的关键步骤如下：首先，在使用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量时，试剂的添加顺序不可颠倒。应先加入样品，然后加入苯酚，最后再加入浓硫酸。此外，采用 DPPH 法测定多糖的抗氧化活性时，新配制的 DPPH 溶液应立即用铝箔包裹或置于棕色瓶中，以防止光降解。最后，由于苯酚具有毒性，浓硫酸具有强腐蚀性，配制苯酚和硫酸溶液时应佩戴手套，并在通风橱内进行操作。

结果表明，多糖含量 H. rh...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分析天平（精度为 0.0001 g）	Sartorius Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd.	BSA224S-CW
分析天平（精度为 0.00001 g）	Sartorius Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd.	CPA225D
台式低速离心机	上海智贵仪器有限公司	TD4K-Z
DPPH	上海源叶生物科技有限公司	CAS 1898-66-4
乙醇	成都科龙化工试剂有限公司	CAS 64-17-5
EP 管	湖南百康控股有限公司	BS-20-M	2 mL
冷冻干燥机	Labconco Corporation	LABCONCO
无水葡萄糖	成都科龙化工试剂有限公司	CAS 50-99-7	对照标准品
GraphPad  Prim 9.5.0	GraphPad Software	N/A	用于测定 IC50 值和 P 值。
热风循环干燥箱	上海一恒科技仪器有限公司	NB-DGG-9070A
L-抗坏血酸	北京莱博工科科技有限公司	CAS 50-81-7	阳性对照药物
酶标仪	上海山浦生物科技有限公司	Read Max 1500
96 孔板	北京莱博工科科技有限公司	11512
OriginPro 2025	OriginLab	N/A	绘制清除率折线图
移液器吸头	北京莱博工科科技有限公司	BS-200-T	200 μL
移液器吸头	北京莱博工科科技有限公司	T-1000-B	1000 μL
苯酚	成都科龙化工试剂有限公司	CAS 108-95-2
旋转蒸发仪	BUCHI 实验室设备贸易（上海）有限公司	Buchi R-100
标准试剂型纯水系统	青岛弗隆科技有限公司	FBZ2001-up-p
恒温数显水浴锅	冠安科学仪器（浙江）有限公司	WB100-6F
紫外-可见分光光度计	上海元析仪器有限公司	V-1100D
超声波清洗器	盛政超洁工业有限公司	CJ-060SD	超声波清洗器 360 W 50 Hz