通过检测荧光示踪剂在人结肠类器官单层中的跨膜通量测定肠道屏障通透性

摘要

我们介绍一种用于测量肠道屏障完整性的技术，该技术通过已知大小的荧光标记糖类在来源于人体组织的肠道类器官中的转位速率，来反映其通透性。

摘要

肠屏障是管腔抗原与宿主免疫系统之间调控的关键部位，其功能失调与多种胃肠道疾病相关。肠道类器官可作为研究和模拟肠屏障完整性的有效工具。本文介绍一种利用人结肠类器官定量评估功能性肠屏障差异的实验方案，通过检测荧光示踪物穿过类器官单层细胞的通透量来实现。在将单层细胞培养至完全融合后，向顶端腔室加入荧光示踪物（如异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖，FITC-dextran），并随时间检测其向基底外侧腔室的跨膜转运情况。荧光示踪物的转运增加反映了肠上皮屏障通透性升高，即屏障功能减弱。本方案提供了一个可灵活调整的平台，能够并行评估多种条件下功能性肠屏障的差异。通过该方案的多种变体，可评估跨上皮屏障对不同大小、形状和化学结构分子的通透性，也可研究在单独施加处理因素或上皮细胞顶端或基底外侧微环境改变背景下通透性的变化。这有助于深入理解疾病状态下屏障功能破坏的机制及其治疗策略。

引言

肠道黏膜是一种复杂的结构，在调控肠腔内代谢物、抗原和微生物与免疫系统及肠内循环之间的相互作用中发挥重要作用。肠道上皮细胞是该系统的关键组成部分，在健康状态下可形成高度选择性的屏障。物质通过上皮的转运可通过多种机制进行：跨细胞的主动或被动转运，以及由紧密连接和黏附连接调控的细胞旁孔道或渗漏途径。某种分子是否能够利用这些途径穿过上皮，取决于其疏水性、大小和化学结构。一旦穿过上皮层，这些分子便更容易与黏膜免疫细胞相互作用，并进入肠道的血液或淋巴循环^1,2。肠道屏障功能的破坏是多种炎症性胃肠道疾病的特征，例如炎症性肠病和乳糜泻^1,3,4,5,6,7。这种受损的肠道屏障被认为通过致病性抗原的异常转位，在这些疾病的发生发展过程中发挥作用，进而引发局部或全身性炎症反应。

目前已有多种成熟的方案用于测量肠道屏障功能。体外研究 传统上使用癌细胞系（如 T84 ....

方案

所有样本的采集和使用均遵循科罗拉多大学机构审查委员会（IRB）批准的方案，方案编号为14-2012。

注意：步骤1-3中的所有操作均应在无菌生物安全柜中使用无菌技术进行。本方案的示意图见图1。

1. 从冻存培养物建立人结肠类器官

注意：在解冻细胞前，确保所有材料均已准备好置于生物安全柜中，以尽量减少解冻后的类器官暴露于冻存液中。本实验方案从冷冻保存的组织来源的人结肠类器官开始。人结肠类器官的建立与冷冻保存方案此前已有报道²⁴。

1. 人肠道类器官干细胞培养基的制备
   1. 根据先前描述的方案制备Wnt-3A/Noggin/R-Spondin 3条件培养基（L-WRN）^25,26。
   2. 在L-WRN培养基中添加以下生长因子：表皮生长因子 [50 ng/mL]、烟酰胺 [10 mM]、A83-01 [500 nM]、SB202190 [10 µM]、CHIR99021 [3 µM]、Thiazovivin [4 µM]、SB431542 [4 µM]、胃泌素I [....

结果

采用该方案，分析了在存在或不存在炎症信号的情况下健康人结肠类器官的通透性。既往研究表明，加入一种称为细胞因子混合物（cytomix）的炎症细胞因子混合物（包含 IFNγ、TNFα 和 IL-1β，每种均为 10 ng/ml），可导致肠道上皮细胞模型的肠道屏障功能障碍，该现象可通过跨上皮电阻（TEER）检测进行测量^20,27。本研究旨在确定使用所述的异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）通量检测方法是否能够重现这种屏障功能障碍。

来自单一供体的健康人结肠类器官被扩增（图2A），并按所述方法以单层形式接种（n=6）。在分化培养基中达到平台期的跨上皮电阻（TEER）后（步骤4；图2B），向部分孔的培养基基底外侧室中加入细胞因子混合物（cytomix，含IFNγ、TNFα和IL-1β，每种10 ng/mL）。细胞在含cytomix的培养基中继续.......

讨论

本方案旨在利用生理学上具有代表性的类人结肠类器官单层模型评估肠道屏障功能。此处所述的荧光示踪剂通量检测方法，能够提供关于屏障功能完整性的信息，其信息量超越其他类型的屏障检测方法，如跨上皮电阻（TEER）、尤斯 chamber 测量或紧密连接蛋白表达水平的评估。此外，采用患者来源的肠道类器官模型，有助于重现复杂的人体生理特征^13,19 优于永生化细胞系，包括非转化细胞的代谢特征以及源自结肠类器官所来源的肠道区域特异性变化，且相较于 体内 研究。

该方案有多种适应性调整方式，可根据特定目的灵活应用其原理。使用多种具有不同电荷、大小或结构且激发/发射光谱不重叠的荧光示踪剂，可对跨细胞和旁细胞转运途径进行详细分析。例如，可同时使用小分子示踪剂（如荧光黄），用于反映旁细胞孔道途径；中等大小示踪剂（如4 kDa葡聚糖），用于旁细胞渗漏途径；以及大分子示踪剂（如40–70 kDa葡聚糖），用于旁细胞非限制性途径，这已在先前的体内研究中得到验证.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥形离心管	Celltreat	229411
2 mL 内螺纹冻存管	Corning	430488
50 mL 圆锥形离心管	Celltreat	229421
6 孔板，组织培养处理	Celltreat	229106
70 μm 细胞筛网	Falcon	352350
96 孔黑/透明底板	Thermo Scientific	165305
A83-01	R&D	2939
BioTek Synergy 酶标仪	Agilent	Synergy H1
Cellometer Auto T4 明场细胞计数仪	Nexcelcom	CMT-AT4P
Cellometer 细胞计数板	Nexcelcom	NC1531583
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046-5MG
胶原蛋白包被溶液	Cell Applications	125-50
DMEM/F-12	Gibco	11330057
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650-100ML
乙醇 100%	Fisher Scientific	A4094
EVOM2 伏特欧姆计配 Stx2 电极	World Precision Instruments	NC9792051
胎牛血清 (FBS)	Cytiva	SH30396.03HI
滤芯吸头	Fisher Scientific	02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
异硫氰酸荧光素 (FITC)-葡聚糖，4 kDa	Sigma-Aldrich	46944
胃泌素 I（人源）	R&D	3006
GlutaMAX	Fisher Scientific	35050061	200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽
Hanks 平衡盐溶液 10x	Thermo Scientific	14065056
HEPES 1 M	Thermo Scientific	15630080
重组人干扰素 γ	BioLegend	575308
重组人白细胞介素 1β	Thermo scientific	200-01B-500UG
IntestiCult 肠类器官生长培养基（人源）	STEMCELL Technologies	06010	商业化肠类器官培养基
活细胞倒置显微镜	Olympus	IX85
Matrigel	Corning	354234	细胞外基质 (ECM)
微生物培养箱	Fisher Scientific	151030515
多孔悬浮培养板，24 孔	Greiner Bio-one	662102
烟酰胺	R&D	4106
Parafilm	Millipore Sigma	HS234526B	封口膜
巴斯德吸管（硼硅酸盐玻璃）	Fisher Scientific	13-678-20B
PBS	Gibco	10010-023
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122
重组小鼠表皮生长因子	R&D	2028-EG
冷冻离心机	Beckman Coulter	BE-AX15R
SB202190	R&D	1264
Thiazovivin	R&D	3845
ThinCert 细胞培养插件，用于 24 孔板，0.4 μm	Greiner Bio-one	662641
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)	Fisher Scientific	25200114
重组人肿瘤坏死因子 α	R&D	10291-TA-100
Y-27632 二盐酸盐	Tocris	TB1254-GMP