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方法文章

通过检测荧光示踪剂在人结肠类器官单层中的跨膜通量测定肠道屏障通透性

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DOI：

10.3791/68857

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2025年10月17日

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

本文内容

摘要

我们介绍一种用于测量肠道屏障完整性的技术，该技术通过已知大小的荧光标记糖类在来源于人体组织的肠道类器官中的转位速率，来反映其通透性。

摘要

肠屏障是管腔抗原与宿主免疫系统之间调控的关键部位，其功能失调与多种胃肠道疾病相关。肠道类器官可作为研究和模拟肠屏障完整性的有效工具。本文介绍一种利用人结肠类器官定量评估功能性肠屏障差异的实验方案，通过检测荧光示踪物穿过类器官单层细胞的通透量来实现。在将单层细胞培养至完全融合后，向顶端腔室加入荧光示踪物（如异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖，FITC-dextran），并随时间检测其向基底外侧腔室的跨膜转运情况。荧光示踪物的转运增加反映了肠上皮屏障通透性升高，即屏障功能减弱。本方案提供了一个可灵活调整的平台，能够并行评估多种条件下功能性肠屏障的差异。通过该方案的多种变体，可评估跨上皮屏障对不同大小、形状和化学结构分子的通透性，也可研究在单独施加处理因素或上皮细胞顶端或基底外侧微环境改变背景下通透性的变化。这有助于深入理解疾病状态下屏障功能破坏的机制及其治疗策略。

引言

肠道黏膜是一种复杂的结构，在调控肠腔内代谢物、抗原和微生物与免疫系统及肠内循环之间的相互作用中发挥重要作用。肠道上皮细胞是该系统的关键组成部分，在健康状态下可形成高度选择性的屏障。物质通过上皮的转运可通过多种机制进行：跨细胞的主动或被动转运，以及由紧密连接和黏附连接调控的细胞旁孔道或渗漏途径。某种分子是否能够利用这些途径穿过上皮，取决于其疏水性、大小和化学结构。一旦穿过上皮层，这些分子便更容易与黏膜免疫细胞相互作用，并进入肠道的血液或淋巴循环1,2。肠道屏障功能的破坏是多种炎症性胃肠道疾病的特征，例如炎症性肠病和乳糜泻1,3,4,5,6,7。这种受损的肠道屏障被认为通过致病性抗原的异常转位，在这些疾病的发生发展过程中发挥作用，进而引发局部或全身性炎症反应。

目前已有多种成熟的方案用于测量肠道屏障功能。体外研究 传统上使用癌细胞系（如 T84 或 Caco-2 细胞）来测定跨上皮电阻（TEER），并定量分析紧密连接和黏附连接的组成成分8。离体条件下，可利用Ussing chamber对活检或切除的肠组织样本测量跨上皮电流9。体内研究通常通过口服惰性示踪剂，随后检测血液或尿液中示踪剂的吸收情况10，11。尽管这些技术在肠道屏障研究中已被证明具有重要价值，但仍存在若干局限性：永生化转化的细胞系本身存在代谢和细胞骨架的改变，这些改变以尚不明确的方式影响肠道屏障功能；获取患者、患者样本或模式生物的途径可能受限；体内研究难以控制混杂因素，也难以在分子水平上得出明确结论。因此，尽管已有多种疾病模型报道了肠道屏障功能受损的证据，但对其缺陷机制的理解仍然有限，我们针对胃肠道疾病中这一方面的靶向治疗能力也依然未能实现。

人肠道类器官为揭示肠道屏障缺陷的病因和治疗方法提供了独特而重要的研究手段。组织来源的人肠道类器官是由位于肠隐窝底部的成体干细胞建立的原代细胞培养模型。12这些细胞可从活检或手术标本中分离，并进行培养，以维持其来源患者所具有的遗传和表观遗传改变13,14,15它们比传统的永生化细胞系更具生理相关性，因为它们不具有癌细胞系的代谢改变，并且可以分化为成熟肠上皮中存在的各种细胞类型。16,17,18此外，由于它们可以被扩增 体外它们在并行研究不同处理方法和生长条件下对细胞的影响时，更具可及性和实用性。尽管肠道类器官模型本身也存在局限性，最显著的是缺乏其他非上皮细胞类型以及整体生物系统的环境背景，但已有研究表明，人类肠道类器官可作为胃肠道疾病多个方面的可靠模型。13.

在这些模型中，肠道类器官已被证明能够很好地模拟肠道屏障缺陷，在屏障受到损伤时，紧密连接结构和跨上皮电阻（TEER）会表现出预期的变化19,20,21。本文中，我们采用了一种评估人结肠类器官屏障完整性的技术，该方法通过检测荧光标记分子穿过类器官单层膜的通量来实现22。在本实验方案中，类器官在半透膜上生长并成熟为具有极性的二维单层结构。该检测方法是在上皮单层的顶端表面加入荧光示踪剂，并随时间定量其在对侧的出现量。示踪剂通量的增加反映了上皮屏障更“渗漏”或通透性更高。该检测提供了功能性屏障状态的读数，可与紧密连接和黏附连接结构的评估结果相互补充。此外，尽管跨上皮电阻（TEER）测量常用于对屏障完整性进行基础评估，但本文所述的通量检测法可被调整用于检测不同类别、电荷和大小分子的通透性，从而更详细地表征屏障特性。目前已有多种市售的荧光示踪剂可用于此目的。进一步地，通过使用非重叠的荧光光谱，可同时评估多种示踪剂的通透性。此外，该检测所采用的单层结构允许特异性地针对细胞顶端或基底外侧表面施加不同的培养条件，从而评估屏障对此类条件的响应。因此，可实现对治疗干预、微环境变化以及共培养条件影响的可控性评估。

已知肠道屏障缺陷在多种胃肠道疾病的发生发展中起着重要的致病作用，但该术语 "肠漏" 在大众媒体中正被越来越频繁地使用，但缺乏准确性23，且针对肠屏障功能缺陷的干预措施迄今成效有限。这凸显了建立更优模型以评估和表征肠屏障特性的迫切需求。本研究所述系统采用源自人生理组织的肠道类器官单层结构，在可控条件下评估功能性屏障的完整性。

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方案

所有样本的采集和使用均遵循科罗拉多大学机构审查委员会（IRB）批准的方案，方案编号为14-2012。

注意：步骤1-3中的所有操作均应在无菌生物安全柜中使用无菌技术进行。本方案的示意图见图1。

1. 从冻存培养物建立人结肠类器官

注意：在解冻细胞前，确保所有材料均已准备好置于生物安全柜中，以尽量减少解冻后的类器官暴露于冻存液中。本实验方案从冷冻保存的组织来源的人结肠类器官开始。人结肠类器官的建立与冷冻保存方案此前已有报道24。

  1. 人肠道类器官干细胞培养基的制备
    1. 根据先前描述的方案制备Wnt-3A/Noggin/R-Spondin 3条件培养基（L-WRN）25,26。
    2. 在L-WRN培养基中添加以下生长因子：表皮生长因子 [50 ng/mL]、烟酰胺 [10 mM]、A83-01 [500 nM]、SB202190 [10 µM]、CHIR99021 [3 µM]、Thiazovivin [4 µM]、SB431542 [4 µM]、胃泌素I [10 nM]。
    3. 将添加了生长因子的L-WRN培养基与商用肠道类器官培养基按1:1比例混合。
    4. 使用前立即加入Y-27632 [10 µM]。
      注：最佳肠道类器官干细胞培养基组成可能因实验室和结肠类器官细胞系而异。单独使用添加生长因子的L-WRN培养基或单独使用商用肠道类器官培养基也可能可行。本方案采用等体积的L-WRN条件培养基与商用培养基混合，相较于单独使用条件培养基更能耐受批次间差异，相较于单独使用商用培养基更具成本效益。
  2. 分化培养基的制备
    1. 在DMEM/F12培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素和2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。
    2. 将添加了成分的DMEM/F12培养基与步骤1.1中的肠道类器官干细胞培养基按1:1比例混合。
  3. 细胞外基质（ECM）的制备
    1. 将ECM在冰上过夜解冻，然后分装为每份100 µL。
      注：分装后的ECM可在-20 °C重新冷冻。具体操作请参见制造商说明书。
    2. 将分装的ECM置于冰上，直至细胞铺板时使用。
  4. 类器官的解冻与铺板
    1. 将冻存管在37 °C水浴中解冻，确保管体浸没于水中但管盖高于水面，直至刚刚完全解冻。
    2. 将冻存管内容物转移至含有13 mL冰上预冷的添加成分DMEM/F12培养基（来自步骤1.2.1）的15 mL锥形离心管中。
    3. 在4 °C下以200 × g离心5分钟。
    4. 吸除上清液，保留约1 mL液体覆盖在细胞沉淀上方。
    5. 将离心管置于冰上，加入1 mL冰上预冷的添加成分DMEM/F12培养基（来自步骤1.2.1），用移液器吹打10–15次以充分重悬细胞沉淀。
    6. 在4 °C下以200 × g离心5分钟。
    7. 用移液器吸除上清液，尽可能减少残留在细胞沉淀上的洗涤液。
    8. 向细胞沉淀中加入100 µL已解冻的ECM，充分重悬，确保类器官均匀分散且无团块。缓慢吹打以避免引入气泡。
    9. 用移液器将约10个ECM半球形液滴（每个约10 µL）铺于6孔板的一个孔中。
    10. 迅速将培养板倒置，在37 °C孵育5–10分钟，直至液滴凝固。
    11. 待液滴凝固后，向孔中加入2 mL肠道类器官干细胞培养基（来自步骤1.1）。
    12. 在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育，每2天更换一次培养基。
    13. 当类器官占据ECM半球面积超过约75%，或中心出现明显碎片积聚时，进入步骤2。

2. 人结肠类器官的传代与扩增

  1. 每个孔中，吸出培养基，注意不要破坏 ECM 圆顶结构。
  2. 用 1 mL 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻清洗圆顶结构，然后吸除 PBS。
  3. 向每孔加入 1 mL 冰冷的胰蛋白酶溶液。使用移液器反复吹打以破碎 ECM 圆顶结构，上下吹打 10–15 次，充分解离 ECM。
  4. 将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 3–5 分钟。
  5. 向孔中加入 1 mL 冰冷的添加补充物的 DMEM/F12 培养基（来自步骤 1.2.1），以中和胰蛋白酶。剧烈吹打混合液 20–30 次，直至细胞解离成每簇 2–3 个细胞的细胞团。
  6. 将细胞悬液转移至 15 mL 锥形离心管中。
  7. 用额外的 1 mL 添加补充物的 DMEM/F12 培养基（来自步骤 1.2.1）冲洗孔壁，并将冲洗液一并加入 15 mL 锥形离心管中。
  8. 加入添加补充物的 DMEM/F12 培养基（来自步骤 1.2.1），使 15 mL 锥形离心管中总体积达到 13 mL。
  9. 使用适量 ECM，按照步骤 1 中的步骤 1.4.3–1.4.12 进行操作，将细胞接种至更多孔中进行扩增。
    注意：100 µL ECM 中汇合的类器官通常可传代至 2–3 个新孔（含 200–300 µL ECM）。一个汇合孔的类器官大约可满足步骤 3 中 3–6 个单层培养的需求。

3. 人结肠类器官单层的生成

  1. 胶原蛋白包被细胞培养小室
    1. 将聚苯乙烯细胞培养小室（0.4 µm 孔径）放入 24 孔板中，并向每个小室的顶腔加入 100 µL 胶原蛋白包被溶液。
    2. 用封口膜密封板子以防止蒸发。
    3. 在 4 °C 下孵育 4–24 小时。
      注意：在此孵育时间内结果无显著差异，可根据实验安排选择较短或较长的孵育时间以方便操作暂停。
  2. 铺板类器官单层
    1. 按照步骤 2.1–2.5 操作解离类器官。
    2. 将细胞悬液通过 70 µm 细胞筛过滤至 50 mL 圆底离心管中。
    3. 用 1 mL 补充型 DMEM/F12 培养基（来自步骤 1.2.1）冲洗各孔，收集冲洗液并将其通过细胞筛过滤。
    4. 用补充型 DMEM/F12 培养基（来自步骤 1.2.1）冲洗细胞筛，直至 50 mL 圆底离心管中的总体积达到 15 mL。
    5. 将滤液转移至 15 mL 圆底离心管中。
    6. 在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟。
    7. 吸除上清液，保留约 1 mL 液体覆盖在细胞沉淀上方。
    8. 再加入 1 mL 补充型 DMEM/F12 培养基（来自步骤 1.2.1），重悬细胞。
    9. 在显微镜下观察细胞悬液，确认解离完全。如有需要，用力吹打细胞直至大部分为单细胞状态。
    10. 在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟，用移液器吸除上清液，尽可能减少残留的洗涤培养基。
    11. 用少量体积（200–1000 µL）的肠道类器官干细胞培养基（来自步骤 1.1）重悬细胞，置于冰上保存。
    12. 取部分细胞悬液，采用首选方法计数活细胞数。根据活细胞浓度确定每孔小室接种 100,000 个活细胞所需的细胞悬液体积。
    13. 吸除每个小室中的胶原蛋白包被溶液，避免接触小室膜。
    14. 向每个小室的顶腔加入适量体积的肠道类器官干细胞培养基（来自步骤 1.1），使加入细胞悬液后终体积为 200 µL。
      注意：如需要，可将步骤 3.2.12 中的细胞悬液调整至终浓度为 100,000 个细胞/200 µL，然后直接接种 200 µL 至顶腔。但若未使用全部细胞悬液进行单层铺板，可能导致培养基浪费。
    15. 向顶腔加入适当体积的细胞悬液。
    16. 向基底外侧腔加入 500–1000 µL 肠道类器官干细胞培养基。
      注意：对于典型的结肠类器官，500 µL 已足够。若细胞代谢活性较高或对代谢废物积累较为敏感，可在基底外侧腔使用更大体积以利于维持生长。
    17. 对所有小室/孔重复上述操作。
    18. 在 37 °C、含 5% CO2 的湿润化培养箱中孵育。
    19. 每周更换一次培养基。
      注意：可在铺板前或铺板后任意时间向小室的顶腔和/或基底外侧腔施加感兴趣的处理因素。

4. 测量跨上皮电阻（TEER）和单层细胞成熟度

  1. 测量电阻
    1. 使用上皮细胞伏特/欧姆计，设置为欧姆档。用浸有70%乙醇的任务擦拭巾擦拭探头以清洁。将电极的长臂置于插入物的基底外侧室，短臂置于顶侧室。记录测量值。
      注意：如果跨上皮电阻（TEER）测量也是关注的终点指标，则还需测量一个无细胞的胶原包被插入物的电阻作为背景值。然后，TEER计算公式为（测量电阻 - 背景插入物电阻）× 插入物表面积。本方案中插入物的表面积为0.33 cm2。该计算结果的单位为 ohm·cm2。如果使用的上皮细胞伏特/欧姆计与材料表中所列型号不同，请遵循制造商提供的使用说明进行电阻测量。
    2. 每日重复测量，直至电阻值达到平台期。
      注意：平台期通常在2至3周后出现，TEER值大于200 ohm·cm2，但具体时间与数值因结肠类器官细胞系及培养条件而异。
  2. 当电阻值达到平台期后，通过将干细胞培养基更换为分化培养基（来自步骤1.2）来启动类器官成熟过程。
  3. 继续每日进行TEER测量。预期TEER值将上升并达到第二个平台期。
    注意：第二个平台期通常在约7天时出现，TEER值为1500–2500 ohm·cm2，但具体数值因结肠类器官细胞系及生长条件而异。
  4. 当TEER值第二次达到平台期后，进入步骤5。

5. FITC-葡聚糖通量检测

注意：本方案使用 FITC-葡聚糖 4 kDa（斯托克斯半径 14 Å）。然而，根据实验需求，也可选用不同大小、电荷和荧光团的荧光示踪剂22。也可同时使用多种示踪剂，此时应确认各示踪剂的激发和发射荧光光谱无重叠。建议在设定为 37 °C 的加热柜（非加湿、非 CO2 培养箱）中进行步骤 5.1–5.3。若无此设备，试剂在使用前应预热至 37 °C，细胞、缓冲液及收集的样品在孵育期间应始终保持在 37 °C。

  1. 试剂准备
    1. 配制含10 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液（HBSS），调节pH至7.4，预热至37 °C。
      注意：如有需要，可使用含特定处理因素的HBSS+HEPES溶液。每孔顶端室准备80 µL，基底外侧室每孔1 mL，确保总体积充足。
    2. 将约50 mL预热的HBSS+HEPES倒入小烧杯中，用于清洗插入式培养小室。另备一个较大的烧杯用于收集废液。
    3. 将FITC标记的4 kDa葡聚糖完全解冻，用含HEPES的HBSS配制成1.25 mg/mL的溶液。配制足够体积的FITC-葡聚糖溶液，以保证每孔加入80 µL，并额外预留1 µL用于标准曲线制备。
      注意：起始浓度可根据示踪物的大小和预期通透性进行调整。例如，较小或通透性更高的示踪物可使用较低浓度以节省试剂。若需在顶端室施加处理因素，请使用经相应处理的HBSS+HEPES溶液配制FITC-葡聚糖溶液。
  2. FITC-葡聚糖应用于单层细胞
    1. 取一个新的24孔板，在相应孔中加入1 mL HBSS+HEPES（如需处理，可加入相应处理因素）。
    2. 用镊子夹住插入式培养小室，将其从孔中取出，浸入盛有预热HBSS+HEPES的小烧杯（来自步骤5.1.2）中，使顶端室充满液体，然后将其倒置在废液烧杯上方，排空清洗液。
    3. 重复上述清洗步骤2次。
    4. 将插入式培养小室放入步骤5.2.1中准备好的新24孔板的相应孔中。
    5. 用移液器轻柔地将80 µL FITC-葡聚糖溶液加入顶端室。移液时应沿插入小室侧壁加入，避免扰动单层细胞。
    6. 对所有单层细胞重复步骤5.2.5。
    7. 向空孔中加入HBSS或PBS，以维持培养环境湿度。
  3. 收集通透样品
    1. 在完成步骤5.2.7后立即从每个孔的基底外侧室中吸取70 µL液体，加入平底透明底黑色96孔板的相应孔中，并在37 °C避光保存。此为0时间点样品。
    2. 将96孔板置于37 °C孵育，全程避光。
    3. 在接下来的2小时内，每隔30分钟轻轻混匀基底外侧室中的缓冲液，然后从步骤5.3.1中的96孔板空孔中再收集70 µL样品。
  4. 标准曲线的制备
    1. 取1 µL预留的FITC-葡聚糖溶液（1.25 mg/mL；见步骤5.1.3）加入999 µL HBSS+HEPES中，得到1:1000稀释液（即1.25 µg/mL），用于标准曲线。
    2. 进行1:1系列稀释：取150 µL上述溶液加入150 µL HBSS+HEPES中，充分混匀。重复此步骤共10次，共完成12个梯度稀释。
      注意：由此可获得浓度分别为1250、625、312.5、156.25、78.13、39.06、19.53、9.77、4.88、2.44、1.22和0.61 ng/mL的标准曲线。根据细胞系的通透性，可能需要调整标准曲线的浓度范围。首次实验时，建议额外保留一份1.25 mg/mL的FITC-葡聚糖溶液，以便必要时重新配制不同浓度的标准曲线。
    3. 将各稀释梯度的标准品各取70 µL加入步骤5.3.1和5.3.3中96孔透明底板的空孔中。每组重复一次。
  5. 使用荧光酶标仪检测荧光强度，设置如下：激发波长490 nm，发射波长520 nm，从板底部读数，增益设为100，读板高度为7 mm。
    注意：应根据所用荧光染料的特性适当调整激发和发射波长。
  6. 数据分析
    1. 以浓度为横坐标（x轴）、荧光强度为纵坐标（y轴）绘制标准曲线，并拟合线性回归方程。
    2. 利用该线性回归方程及各样品的荧光读数，计算每个时间点各样品中FITC-葡聚糖的浓度。
    3. 绘制各样品浓度随时间变化的曲线，计算线性回归斜率，该值代表每分钟微克数（µg/min）。将此值除以细胞培养插入小室的表面积（0.33 cm²），得到以微克每分钟每平方厘米（µg/min/cm2）表示的通透速率。

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结果

采用该方案，分析了在存在或不存在炎症信号的情况下健康人结肠类器官的通透性。既往研究表明，加入一种称为细胞因子混合物（cytomix）的炎症细胞因子混合物（包含 IFNγ、TNFα 和 IL-1β，每种均为 10 ng/ml），可导致肠道上皮细胞模型的肠道屏障功能障碍，该现象可通过跨上皮电阻（TEER）检测进行测量20,27。本研究旨在确定使用所述的异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）通量检测方法是否能够重现这种屏障功能障碍。

来自单一供体的健康人结肠类器官被扩增（图2A），并按所述方法以单层形式接种（n=6）。在分化培养基中达到平台期的跨上皮电阻（TEER）后（步骤4；图2B），向部分孔的培养基基底外侧室中加入细胞因子混合物（cytomix，含IFNγ、TNFα和IL-1β，每种10 ng/mL）。细胞在含cytomix的培养基中继续...

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讨论

本方案旨在利用生理学上具有代表性的类人结肠类器官单层模型评估肠道屏障功能。此处所述的荧光示踪剂通量检测方法，能够提供关于屏障功能完整性的信息，其信息量超越其他类型的屏障检测方法，如跨上皮电阻（TEER）、尤斯 chamber 测量或紧密连接蛋白表达水平的评估。此外，采用患者来源的肠道类器官模型，有助于重现复杂的人体生理特征13,19 优于永生化细胞系，包括非转化细胞的代谢特征以及源自结肠类器官所来源的肠道区域特异性变化，且相较于 体内 研究。

该方案有多种适应性调整方式，可根据特定目的灵活应用其原理。使用多种具有不同电荷、大小或结构且激发/发射光谱不重叠的荧光示踪剂，可对跨细胞和旁细胞转运途径进行详细分析。例如，可同时使用小分子示踪剂（如荧光黄），用于反映旁细胞孔道途径；中等大小示踪剂（如4 kDa葡聚糖），用于旁细胞渗漏途径；以及大分子示踪剂（如40–70 kDa葡聚糖），用于旁细胞非限制性途径，这已在先前的体内研究中得到验证...

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披露

不存在披露事项或利益冲突。

致谢

肖恩·科尔根博士获得美国国立卫生研究院资助，项目编号为 DK1047893、DK50189、DK095491、DK103639 以及退伍军人事务部杰出贡献奖 BX002182。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 圆锥形离心管Celltreat229411
2 mL 内螺纹冻存管 Corning430488
50 mL 圆锥形离心管Celltreat229421
6 孔板，组织培养处理Celltreat229106
70 μm 细胞筛网Falcon352350
96 孔黑/透明底板Thermo Scientific165305
A83-01 R&D2939
BioTek Synergy 酶标仪AgilentSynergy H1
Cellometer Auto T4 明场细胞计数仪NexcelcomCMT-AT4P
Cellometer 细胞计数板NexcelcomNC1531583
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046-5MG
胶原蛋白包被溶液 Cell Applications125-50
DMEM/F-12Gibco11330057
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
乙醇 100%Fisher ScientificA4094
EVOM2 伏特欧姆计配 Stx2 电极World Precision InstrumentsNC9792051
胎牛血清 (FBS)CytivaSH30396.03HI
滤芯吸头Fisher Scientific02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
异硫氰酸荧光素 (FITC)-葡聚糖，4 kDaSigma-Aldrich46944
胃泌素 I（人源）R&D3006
GlutaMAX Fisher Scientific35050061200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽
Hanks 平衡盐溶液 10xThermo Scientific14065056
HEPES 1 MThermo Scientific15630080
重组人干扰素 γBioLegend575308
重组人白细胞介素 1βThermo scientific200-01B-500UG
IntestiCult 肠类器官生长培养基（人源）STEMCELL Technologies06010 商业化肠类器官培养基
活细胞倒置显微镜OlympusIX85
MatrigelCorning354234细胞外基质 (ECM)
微生物培养箱Fisher Scientific151030515
多孔悬浮培养板，24 孔Greiner Bio-one662102
烟酰胺R&D4106
ParafilmMillipore SigmaHS234526B封口膜
巴斯德吸管（硼硅酸盐玻璃）Fisher Scientific13-678-20B
PBS Gibco10010-023
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140122
重组小鼠表皮生长因子R&D2028-EG
冷冻离心机Beckman CoulterBE-AX15R
SB202190 R&D1264
ThiazovivinR&D3845
ThinCert 细胞培养插件，用于 24 孔板，0.4 μmGreiner Bio-one662641
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)Fisher Scientific25200114
重组人肿瘤坏死因子 αR&D10291-TA-100
Y-27632 二盐酸盐 TocrisTB1254-GMP

参考文献

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