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方法文章

可定制琼脂糖模具的制备及其在无支架小鼠卵巢卵泡培养中的应用

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DOI：

10.3791/68871

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2025年10月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了一种在新型无支架琼脂糖模具中培养卵巢卵泡的方法，该方法可作为补充 体外 配子发生

摘要

卵巢卵泡是卵巢的功能单位，可产生维持女性生殖功能和健康所必需的激素和配子。体外重现卵泡发育、排卵和黄体化过程的能力在基础研究、转化研究和临床应用中具有广泛用途。目前最先进的体外卵泡培养系统可维持卵泡的三维（3D）结构，这对于人类减数分裂成熟至中期II（MII）的卵母细胞发育至关重要。最近，一种无需支架的体外培养小鼠多层次级卵泡的方法已被开发并验证。该方法采用定制的3D打印模具，在琼脂糖上微图案化出微孔阵列，以容纳卵泡的体积扩张。在此无支架环境中培养的卵泡，其激素分泌水平和存活率与成熟的基于海藻酸盐包封的体外卵泡生长（eIVFG）系统相当。重要的是，琼脂糖微孔阵列方法具有可扩展性，技术要求较低，并且相较于eIVFG系统，表现出更优的卵泡生长和排卵率。该方法所制备的模具具有良好的生物相容性，适用于对材料特异性浸出物及其他环境污染物高度敏感的卵母细胞。此外，该系统中的卵泡在同一焦平面上培养，便于进行实时延时成像与分析。为提高该新技术的可及性，本文详细描述了设计和3D打印主模具、制备适用于24孔或96孔板的硅胶模具，以及在琼脂糖模具中培养分离的多层次级卵巢卵泡所需的方法。该系统还可与低成本的延时成像系统整合，实现形态动力学分析。此外，模具可进行石蜡包埋，用于后续组织学分析。总体而言，这一用户友好的方法是一种多功能的卵泡培养工具，还可进一步定制，以促进卵泡微环境中生殖细胞的分化与成熟，从而实现完整的体外配子发生。

引言

卵母细胞（即雌性配子）在受精时为胚胎提供大部分细胞质以及一半的遗传物质，这对下一代的发育至关重要。卵子发生始于胚胎发育时期，此时原始生殖细胞进入减数分裂并停滞于减数分裂Ⅰ前期。这些卵母细胞位于原始卵泡内，构成卵巢储备——一个有限且不可再生的卵泡库，卵母细胞随后被逐步募集。卵泡通过称为卵泡发生的过程发育，其最终目标是产生一个能够受精的成熟配子1,2,3,4,5。卵泡发育始于一个早期的、促性腺激素非依赖性阶段，此阶段旁分泌信号对卵泡的存活和生长至关重要。当卵泡发育至次级阶段时，其功能转而依赖促性腺激素，标志着信号调控由旁分泌向内分泌转变。次级卵泡的一个关键特征是卵母细胞周围至少有两层完整的立方状颗粒细胞，同时出现新形成的膜细胞层。膜细胞构成卵泡的最外层，提供雄激素并起结构支持作用6,7。最终，在排卵期间，卵泡内形成充满液体的囊腔，并在黄体生成素（LH）激增的刺激下破裂，释放出一个处于减数分裂Ⅱ期停滞状态、具备受精能力的配子2,8,9。

卵母细胞在卵子发生和卵泡发生过程中获得受精所需的发育能力以及支持早期着床前胚胎发育的能力，这一过程称为核成熟和胞质成熟。10,11,12细胞质成熟在形态上表现为卵母细胞在整个卵泡发生过程中逐渐增大。由于体细胞（包括膜细胞、颗粒细胞和卵丘细胞）的增殖，卵泡本身经历显著的体积扩张。在小鼠中，从早期次级卵泡发育至排卵前卵泡，卵泡直径增大五倍。. 卵母细胞与其周围体细胞之间的双向通讯对卵子发生至关重要。在初级卵泡中，透明带由卵母细胞分泌的蛋白质形成，而卵泡这两个区室之间的通讯部分通过跨 zona 突起实现，后者为这两个卵泡区室提供了物理接触。13,14因此，卵泡微环境对于卵母细胞的正常生长以及核成熟和胞质成熟至关重要。2,5为了更好地理解支持这些过程的离散机制，需要采用先进且具有生理相关性的方法 体外 培养技术。培养卵泡的能力 体外 具有广泛的应用，包括辅助生殖技术和生育力保存15,16,17,18物种保护19,20药物开发21，以及毒理学筛查22,23.

体外 卵泡培养系统也是从多能干细胞（即所谓的）生成配子能力所必需的中间步骤 体外 配子发生（IVG）24研究人员已利用胚胎干细胞、间充质干细胞和诱导多能干细胞在多种物种中培育配子，通常依赖体细胞来重建天然卵泡微环境25,26,27,28,29,30尽管通过这些方法已实现主要的概念验证里程碑，但仍存在卵母细胞质量较低的挑战，这体现在胚胎发育率和出生后代率较低。 体外 小鼠受精31,32目前其他物种中尚未实现活产，这凸显出需要持续优化方案以全面支持卵子发生和卵泡发育。

目前，卵泡培养采用多种策略。其中技术要求最低且通量最高的方法是无支架法，即将卵泡置于塑料培养皿或膜插件中。33,34此处，颗粒细胞贴附于培养表面，与卵母细胞失去接触33,34卵泡结构的破坏限制了这些技术的可用性和生物学相关性。然而，在低吸附培养板或倒置液滴中进行无支架培养，可在多种哺乳动物物种中维持卵泡的结构完整性。35,36,37遗憾的是，使用这些技术难以控制卵泡之间的相互作用及其所获得的机械支持程度。因此，为了更准确地模拟 体内 生理学，已开发出将卵泡包埋于具有明确且可调控化学成分和/或机械特性的水凝胶中的培养方法33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53例如，海藻酸盐包封的 体外 卵泡生长系统可重现所观察到的关键转录组特征 体内21.

尽管包埋培养方案已取得成功并具有重要价值，但仍存在若干缺点。这些方法在技术上具有挑战性，操作繁琐，通量较低，且无法与自动化成像技术兼容。此外，由于较大哺乳动物卵泡的体积扩张更为显著，包埋培养方法需要采用多步骤操作流程。37此外，封装技术在各个方向上提供均匀的支撑，而毛囊需要在排卵前从水凝胶中释放出来，但这一过程并不会发生。 体内，其中卵泡与周围的卵巢微环境相互作用，后者提供动态的生物力学支持54例如，坚硬的卵巢皮质可维持原始卵泡的静止状态，而较大的生长卵泡通常位于较柔软的髓质区域。55,56一旦含有成熟卵母细胞的卵泡达到终末大小，卵泡壁和卵巢表面上皮发生改变，从而允许排卵发生。因此，若培养技术允许卵泡在单一方向上生长且受到的阻力较小，则更能模拟这一生理过程 体内 生理学

本研究提出了一种新颖的方法，建立了一种可重复、可扩展、技术要求较低且成本效益高的小鼠多层次级卵泡培养体系57。该方法采用经济可行的技术制备超低吸附性的琼脂糖微孔阵列，其几何结构（形状、尺寸）和空间排列（数量、间距）均可精确控制。卵泡在琼脂糖模具中仅在一个方向上无机械支撑，并在同一焦平面上进行培养，从而实现延时成像，便于进行高级形态动力学分析。本研究采用立体光刻（SLA）3D打印技术制备主模具，随后通过复制工艺获得无浸出物的硅胶模具用于琼脂糖成型。与传统的体外卵泡生长（eIVFG）方法相比，新体系在不损害卵泡整体存活率、成熟率或黄体化能力的前提下，显著改善了卵泡生长和排卵结果57。本实验方案详细描述了琼脂糖模具的定制与制备步骤、多层次级卵泡的接种与培养过程，以及最终的延时成像分析方法（图1）。

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方案

本方案所涉及的所有动物实验程序均经西北大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行操作。

1. 调整主模具设计

本部分描述了设计阶段（图1）中执行的初始步骤，其中将定制的微孔结构引入24孔培养板主模具的计算机辅助设计（CAD）中，该设计称为24孔主模具基础设计（补充文件 1）。微孔的尺寸决定了卵泡所获得的支撑程度及其最大生长尺寸，而孔的数量则决定了每个琼脂糖模具中可容纳卵泡的最大数量。经过调整的主模具设计将在下一节中用于制备生物相容性硅胶模具，以进行琼脂糖浇铸。

  1. 使用 CAD 软件打开 24 孔主模具基底设计 .step 文件（图 2A）。
  2. 选择该对象的内表面区域，然后转到 设计 工作区中的 实体 选项卡，选择 创建草图 以插入所需的微模具设计（图 2Bi）。
  3. 输入所需的微孔尺寸（xy 方向）和数量，然后在工具栏中选择完成草图（图 2Bii）。
    注意：对于多层次级卵泡，先前曾使用 500 × 700 µm 的体育场形几何结构57。打印分辨率可能因所用树脂和光固化（SLA）打印机的不同而有所变化；微孔之间应预留至少 400 µm 的间距。
  4. 使用 拉伸 功能（点击 实体 | 创建 | 拉伸）创建深度为 800 µm 的微孔。确保选择 切割 操作，以形成微孔腔体（图 2Biii）。
  5. 对微孔顶部应用 0.100 mm 半径的圆角（点击 设计 | 实体 | 修改 | 圆角）。
    注意：若要创建圆底微孔，可再次使用 圆角 操作处理培养孔底部，并将 半径值 设置为微孔设计的半径值。例如，在设计 500 µm × 700 µm 的孔时，应选择 0.250 mm 的半径值（图 2Biv）。
  6. 将 新的主模具设计 另存为 .step 格式的文件（点击 文件 | 导出）。

2. 制备硅胶模具容器

注意：为防止细胞毒性化合物从3D打印部件中渗出，将制作两个生物相容性硅胶模具。本节描述设计阶段的最后步骤（图1），最终得到用于硅胶成型的两个容器。此处将使用三个不同的CAD文件，分别为第1节中创建的新主模具设计，以及24孔硅胶铸型容器1和2（分别对应图2Ci-ii以及补充文件2、补充文件3）。

  1. 打开 24-well silicone cast container 1.step 文件，并将新的主模具设计作为外部组件插入（导航至 实体 | 插入 | 插入组件）。
    1. 右键单击该组件，选择 断开链接，以移除与新主模具设计的链接引用。
  2. 将 新主模具设计 与 24-well silicone cast container 1 表面对齐居中，确保其朝向内侧。
    1. 在浏览器中右键单击 新主模具设计 对象，选择 移动/复制 选项。
    2. 在 移动类型部分 选择 自由移动 操作，并在必要时绕 x 轴旋转对象 180°。
    3. 在 移动类型部分 选择 点对点 操作，以 新主模具设计 对象的中心为原点，以 24-well silicone cast container 1 表面的中心为目标点。
    4. 选择 确定 以对齐对象。
  3. 选择 切割 操作，以容器为目标体，主模具为工具体设计（图 2Ciii）。此操作生成硅胶成型第一步所用的容器（图 2Civ）。
    注意：在第一部分中设计的微孔结构现在变为微柱结构，将在第 3 节所述中进行 3D 打印。SLA 打印是一种增材制造方法，因此与打印微孔相比，打印微柱可提高打印分辨率。
  4. 将生成的 新 24 孔硅胶模具 1 保存并导出为 .stl 和 .step 文件。

3. 硅胶容器的3D打印

注意：本节描述了制造阶段（图1）中执行的初始步骤，其中包含所需微孔结构特征的新CAD设计将被3D打印。

  1. 使用3D打印准备软件打开新型24孔硅胶模具1和24孔硅胶铸型容器2的.stl文件。
  2. 将打印件方向设置为微柱朝上，并使用钻孔功能创建一个1 mm宽的开口（图2D）。确保该通道与打印件侧面相通。
    注意：该钻孔可避免打印过程中的凹陷效应，可在打印后填充，或在首次硅胶成型后去除多余的硅胶材料。
  3. 以25 µm的层厚打印两个容器设计（图3A）。
    注意：每个模型应打印三份，以应对打印缺陷或加工过程中的损坏。
  4. 从打印平台取下模具，并根据制造商说明用95%异丙醇清洗。用95%异丙醇充分喷洒微柱区域（图3B）。使用压缩空气去除残留的乙醇。
  5. 让残留的乙醇至少挥发30分钟。
    注意：此时可密封1 mm宽的钻孔通道。可通过在打印件外侧使用P200移液器吸头滴加少量未聚合树脂实现密封，毛细作用将使通道被填满。
  6. 在60 °C条件下用紫外光对3D打印件固化15分钟。
  7. 使用体视显微镜检查每一件打印品，弃用存在缺陷的3D打印件（图3C-F）。需全面目视检查每件打印品，确保所有微柱相互分离且大小和形态均一（图3D）。对于微柱发生融合的缺陷主模具应予以丢弃（图3E）。
    注意：常见问题包括微柱损坏或未清洗干净的树脂残留形成的桥接结构（图3Fi,ii）。
  8. 若钻孔通道未填充，则用Parafilm包裹打印件外部，并储存以备后续使用。

4. 硅胶模具制造

注意：本节描述了制造阶段的最后步骤（图1），其中将进行两次硅胶模制步骤。这是为了防止3D打印部件释放有毒浸出物。

  1. 按照制造商的说明准备硅胶，简要步骤如下：
    1. 将组分A和组分B容器中的内容物充分混合，将烧杯放在天平上，按1A:1B的重量比倒入容器中。确保材料过量。
    2. 彻底混合3分钟，确保刮擦容器的侧壁和底部。
    3. 将材料放入真空干燥器中，静置5分钟以去除夹带的气泡。如果仍有气泡，可重复脱气最多2次。
  2. 将混合物均匀地倒入硅胶模具容器1中。确保混合物液面与3D打印模型齐平或略低，以保证硅胶模具的平整性（图4Ai，ii）。
    1. 使用p200移液器吸头去除任何夹带的空气，必要时使用真空脱气。
  3. 在室温下固化硅胶至少5小时，最好过夜，然后再脱模。
  4. 从3D打印模具中取出硅胶，并使用体视显微镜目视检查微模具的完整性（图4Aiii，B）。如有必要，清除钻孔通道中的多余材料（图4Aiv）。丢弃存在桥接或微孔结构受损的模具（图4C）。
  5. 将硅胶模具放入硅胶模具容器2中，用于第二次硅胶成型步骤（图4Av）。硅胶容器2的侧壁有一个1 mm的开口，在放置硅胶模具后该开口将被覆盖。
  6. 用胚胎安全的矿物油对硅胶模具进行轻喷，并清除微孔中的多余油分。这将作为脱模剂，以便在固化后分离两部分硅胶。
  7. 重复步骤4.1中所述的混合步骤，并将混合物倒入硅胶模具容器2中。确保混合物液面低于或与3D打印模型齐平，以保证硅胶模具的平整性（图4Avi）。
  8. 在室温下让硅胶固化至少5小时，最好过夜，然后再脱模。
  9. 从3D打印模具中取出硅胶，并将硅胶模具1和2彼此分离（图4Avii）。使用体视显微镜目视检查微柱的完整性（图4D）。如果微孔中存在气泡或过多油分，则丢弃该模具（图4E）。
  10. 用70%乙醇清洗硅胶模具，并在超净工作台中风干30分钟。
  11. 放入灭菌袋中，使用干循环进行高压灭菌（夹套压力：20 psi，腔体温度：250 °F，灭菌时间：15分钟）。

5. 培养基的制备

注意：卵巢组织的消化用于卵泡的分离与培养， 体外 卵母细胞成熟及黄体化过程需要六种培养基：解剖培养基（DM）、酶解培养基（EM）、维持培养基（MM）、生长培养基（GM）、成熟培养基（IVM）和黄体化培养基（LM）。这些培养基的配制方法可参见 Converse 等人先前的描述。38 由Simon等人分析的不同培养基成分重要性的解释33，其目的在文中简要提及 表1.

  1. 提前最多 1 周配制培养基，并在 4 °C 下保存。

6. 定制琼脂糖模具的制备与卵泡培养物的保存

注意：本节介绍如何使用第4节中制备的硅胶模具来制备用于卵泡培养的定制琼脂糖模具。琼脂糖模具可在4 °C下制备并保存，用于卵泡培养前最多2周。

  1. 将模具放入灭菌袋中，按照第4.11节所述使用干循环进行高压灭菌。使用前让模具冷却。
  2. 通过在微波炉或加热板上将无菌的1.5%琼脂糖（w/v）溶液溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中来制备琼脂糖溶液。使用无菌锥形管，并将其置于盛有水的烧杯中，以实现更均匀的加热，并减缓液态琼脂糖溶液的凝固。
  3. 在超净工作台中，将无菌琼脂糖溶液移液至硅胶模具中。移液时应缓慢平稳，以尽量减少气泡产生，并确保模具顶部平整，不呈凸面或凹面。浇注时的顶部即为培养时的底部，应保持水平。对于适用于24孔板的微模具，使用约600 µL琼脂糖；对于适用于96孔板的微模具，使用85 µL。
  4. 让微模具冷却约3分钟，直至完全凝固。将硅胶模具倒置，使微模具脱模至100 mm培养皿中。
  5. 在显微镜下检查微模具是否存在任何缺陷，包括裂纹、微孔融合或边界不完整等情况。将合格的微模具置于含1%青霉素-链霉素的无菌PBS中，4 °C保存，最多可保存2周后再使用。
    注意：应制备比实际所需数量更多的模具，以弥补随时间推移发生的降解或在板间转移过程中可能造成的微模具损伤。
  6. 在卵泡分离当天，用750 µL维持培养基2倍量对微模具进行平衡，至少孵育1小时（共两次孵育）。
  7. 移除所有维持培养基，加入750 µL生长培养基，并放入培养箱中孵育1小时。
  8. 接种前更换为新鲜且已平衡的生长培养基。

7. 晚期次级卵泡的分离与培养

注意：本节介绍如何在琼脂糖微模具中分离并接种卵泡以进行卵泡培养。多层次级卵泡需培养8天，存活率必须超过80%，并能产生成熟卵母细胞。次级卵泡的分离与培养已在其他文献中详细描述38。用于海藻酸盐包埋培养以及接种至琼脂糖模具中的卵泡，其分离与筛选方法一致。

  1. 从小鼠中解剖卵巢，并去除卵巢周围脂肪组织和卵巢囊。将卵巢置于2.5 mL酶解液中，按先前所述方法，在37 °C条件下于摇床中孵育20分钟57.
  2. 用移液器将2 mL维持培养基加入IVF培养皿中，置于培养箱（37 °C，5% CO₂）内2在卵泡分离之前。
  3. 用250 µL FBS终止反应。在酶法分离后筛选晚期次级卵泡，并将其转移至含DM的IVF培养皿中。
  4. 将卵泡转移至含有预平衡维持培养基的IVF培养皿中，放入培养箱（37 °C，5% CO₂）培养。21小时。
    注意：晚期次级卵泡的起始大小为150–180 µm，且含有两层以上的颗粒细胞。
  5. 向琼脂糖微模具中加入750 µL新鲜GM，放入培养箱中孵育，以备接种。在琼脂糖微模具周围的相邻孔中加入无菌PBS，以维持湿度，并在整个培养期间尽量减少培养基的蒸发。
  6. 将卵泡接种至预先平衡并浸没在生长培养基（GM）中的琼脂糖模具中。在显微镜下，使用200 µm吹打管尖将高质量的多层次级卵泡转移至琼脂糖微模具中。确保每个24孔板中的微模具内转移10个卵泡，且每个卵泡位于彼此相邻但相互分隔的微孔中。
    1. 弯曲剥离针头，以便更精确地操作，并将毛囊转移至微孔中。
    2. 快速转移卵泡，以尽量减少温度和pH变化，因为MM和GM均为CO₂依赖性培养基2 缓冲的。
    3. 确保将全部10个卵泡转移至微模具后，其中的卵泡起始大小相近。
  7. 将已接种的微模具放回培养箱中，至少孵育1小时，使卵泡在成像前恢复。
  8. 每隔一天以 4 倍和 10 倍放大倍数对卵泡进行成像，以量化卵泡存活和生长情况。
    注意：也可以设置延时成像以进行形态动力学测量，相关内容将在第9节中详细描述。
  9. 每隔一天更换50%的培养基。
  10. 使用干冰对用过的培养基进行速冻，随后于 -80 °C 保存。利用该条件培养基通过雌二醇 ELISA 检测激素生成水平。
    注意：如果在接种当天（培养期开始时）配制生长培养基（GM），该培养基可在 4 °C 保存，并用于整个培养期间。
  11. 在培养的第8天，移除全部生长培养基（750 µL）并迅速冷冻。
  12. 将培养基更换为IVM培养基以促进 体外 排卵
    注意：排卵也可在活细胞成像系统中进行，以评估排卵时间及卵泡破裂特征。
  13. 在添加IVM培养基14-16小时后取出卵丘-卵母细胞复合体（COCs），评估成熟状态。
    1. 成熟状态的定义如下：通过第一极体的排出判断为MII期（健康卵母细胞的预期结果）；无极体或生发泡存在时判断为GVBD/MI期（成熟延迟）；生发泡（GV）期表现为卵母细胞中央可见圆形细胞核（减数分裂未进展），或卵母细胞退化、变扁和/或变暗。
  14. 可选：由于MII期卵母细胞的纺锤体参数（包括染色体排列、形态和体积）与卵母细胞质量和胚胎发育结果密切相关58,59，使用它们来评估成功的程度 体外 卵子发生。通过整体免疫细胞化学法固定并染色MII期卵子，以评估纺锤体形态。
    1. 固定：将卵在含有0.1% Triton X-100的3.8% PFA中于37 °C固定20分钟。用封闭缓冲液（含钙镁的PBS（PBS +/+）加入10% Tween-20和0.3% BSA）洗涤卵3次。
    2. 纺锤体染色：
      1. 在室温下将卵置于通透缓冲液（PBS +/+ 含 0.1% Triton X-100 和 0.3% BSA）中孵育 15 分钟
      2. 用封闭缓冲液冲洗2次。
      3. 将卵在含1 µg/mL Alexa Fluor 488标记的抗α-微管蛋白抗体的溶液中，室温下避光振荡孵育2小时。
      4. 用含DAPI的封片剂将卵固定在显微镜载玻片上之前，先用封闭缓冲液洗涤3次，每次20分钟。
      5. 为了观察卵母细胞的细胞骨架，在染色过程中加入1:50的罗丹明鬼笔环肽。
    3. 使用63倍物镜在共聚焦显微镜下对整个纺锤体进行z轴层扫成像，层扫宽度为1.0 µm。

8. 自定义琼脂糖模具的下游应用

注意：琼脂糖微模具可用于组织学分析，实现对不同目的基因或蛋白的定量与定位。微模具可构建毛囊微阵列，从而实现多个毛囊的平行染色。此外，无需转移毛囊即可直接进行光学相干断层扫描（OCT）图1，应用）。光学相干断层扫描是一种成像技术，可实现样本的三维重建，与共聚焦显微镜相比具有更高的穿透深度和分辨率，因而能够更有效地对培养的卵泡等三维样本进行成像 体外60.

  1. 用于组织学应用时，按步骤 6.2 所述配制琼脂糖溶液（1.5% w/v）。
    1. 移除琼脂糖微模具孔周围的所有培养基，并使用 P200 移液器在微模具腔体的角落小心吸除腔内的培养基。
    2. 小心地用移液器加入 100 µL 液态琼脂糖溶液，以填充并密封微孔和腔体，避免扰动卵泡；确保表面平整。使用无菌 P10 移液器吸头去除任何气泡。
    3. 在室温下静置 2 分钟，使琼脂糖凝固。在显微镜下确认微模具已完全密封。
    4. 将密封的微模具置于 750 µL 固定液（改良 Davidson 溶液或 3.8% 多聚甲醛）中，在 4 °C 下轻轻振荡固定过夜。
    5. 吸除固定液，并用梯度递增的乙醇溶液洗涤密封的微模具，起始于 50% 乙醇，最终使用 70% EtOH。
    6. 使用自动组织处理仪，按照标准处理程序（表 2）进行处理，并包埋于石蜡中。包埋时注意微模具的方向。确保样品前后均有石蜡包裹，以最大限度减少切片过程中的组织丢失。
    7. 将包埋样品连续切片至 5 µm 厚度，并置于带电荷的显微镜载玻片上。
    8. 使用自动染色机进行 H&E 染色，并在成像前用封片介质封片。
  2. 进行 OCT 检测时，将含有卵泡的微模具置于盛有 IVM 培养基的 50 mm 培养皿中。
    1. 为获得代表性 OCT 图像，请使用自行搭建的可见光光谱范围内的 OCT 系统进行成像，其轴向分辨率为 1.3 µm，横向分辨率为 9.4 µm61,62。
    2. 在 1.58 x 1.58 mm2 的视场范围内扫描卵泡，包含 512 条 A 扫描线和 512 次 B 扫描，每条 B 扫描重复 2 次，每个体积重复 3 次。
    3. 使用 ImageJ 处理 OCT 图像，以可视化卵泡的三维结构并量化体积。
      1. 通过将文件拖入打开的 ImageJ 应用程序，以 Z 轴堆栈形式上传图像。
      2. 通过进入 插件|3D|体积查看器 将 Z 轴堆栈可视化为三维图像。旋转三维图像以观察不同时间点的不同角度。
      3. 导航至 文件| 另存为 |Tiff ，将图像保存至目标位置。

9. 卵泡培养的延时分析

注意：在无支架培养系统中生长的卵泡位于相同的焦平面上，适用于在培养箱中进行活细胞延时成像。在第7.7步将卵泡接种后即可开始延时成像（图1，应用部分）。

确保整个延时过程中所有变化均准确无误。因此，每完成一个步骤后，都应浏览整个图像序列，以确保测量结果不存在任何差异。

  1. 延时成像设置：
    1. 在手持显微镜上安装一个聚光罩。
    2. 将带支架的便携式显微镜放入培养箱中，并连接至已安装软件的笔记本电脑。
    3. 将培养小室置于显微镜下并调整位置使其对齐，调节显微镜的高度和焦距，使所有卵泡均处于清晰对焦状态。使用自动白平衡（AWB）功能，选择最佳照明条件 LED 控制 翻转 自动曝光 （AE） 关闭，然后选择 最佳曝光时间.
      注意：每次更换培养基前后，必须确保模具的定位保持一致；否则，将需要对每两天的培养进行单独分析。
    4. 开始延时成像，选择成像持续时间 8 天 和间隔 30 分钟选择 照片 和 不拍照时关闭LED.
  2. 在“设置测量”对话框中指定将要记录的测量项目（点击 分析 | 设置测量参数) 在进行 ImageJ 分析之前。
    注意：有关 ImageJ 软件中可整合的测量参数的更多信息，请参见用户指南第 30.7 小节63.
  3. 将所有图像放入一个独立的分析文件夹中以开始分析。
  4. 将分析文件夹拖放到 ImageJ 软件中，以图像堆栈形式打开延时序列。确保 按数字顺序排序名称 选择该选项，如果图像序列无法完全载入计算机内存，请选择 虚拟堆栈.
  5. 使用 矩形选择 使用工具选择一个区域，确保整个延时成像过程中所有卵泡均包含在内。为此，请先使用最后一幅图像，并逐层滚动图像序列，确认没有任何卵泡被裁切。然后裁剪所选区域（导航至 图像 | 裁剪或 Ctrl+Shift+X, 图5Ai，ii).
  6. 为延时图像序列设置比例尺（分析 | 设置比例尺). 使用成像仪拍摄的第0天图像，测量三个可识别的特征（如卵泡或微孔）。使用延时成像序列中的同一张第0天图像，对其中一项测量结果定义标尺，并利用另外两项测量结果验证标尺设置的准确性。
  7. 使用以下方法对所有图像进行对齐 SIFT 插件 （导航至 插件 | 注册 | 使用SIFT进行线性堆栈对齐, (图5Bi，ii）。使用 以下为标准设置，可根据具体情况逐案调整： 使用SIFT进行线性堆栈对齐，initial_gaussian_blur = 1.60，steps_per_scale_octave = 3，minimum_image_size = 64，maximum_image_size = 1024，feature_descriptor_size = 4，feature_descriptor_orientation_bins = 8，closest/next_closest_ratio = 0.92，maximal_alignment_error = 25，inlier_ratio = 0.05，expected_transformation=Rigid，interpolate.
  8. 将图像栈转换为8位灰度（图像 | 类型 | 8 位).
  9. 使用滚动球背景扣除法去除背景（点击 过程 | 减去背景 图5Ci，ii）使用以下设置（可根据具体情况调整）： 滚动球半径 = 70.0 像素；选择 禁用平滑处理.
  10. 对图像进行阈值处理（导航至 图像 | 调整 | 阈值) 使用以下设置将延时图像分为两类像素： setThreshold(35, 255, "原始"）；运行（"应用LUT", "堆栈")；setOption("黑色背景"，true）；运行（"转换为蒙版", "方法=双峰间值，背景=暗色，计算黑色").
  11. 使用矩形选择工具逐个测量每个卵泡，然后选择 颗粒分析 功能（点击 分析 | 分析颗粒）。使用以下设置：Analyze Particles...", "大小= 8000-无穷 显示 排除 包含 概括 叠加 添加 复合 堆叠图5Di,ii).
    1. 在保存结果之前，确认每幅图像的感兴趣区域（ROI）准确无误（图5Ei，ii). 将摘要和结果保存为 .CSV 格式。
    2. 对所有其他卵泡重复此操作。

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结果

为了确定使用本研究方案第7节中所述的新型技术是否能够支持卵泡的存活与生长，从同一批小鼠中分离卵泡，并平行培养于琼脂糖微模具中或包埋于0.5%海藻酸盐中。培养期间每隔一天的代表性图像显示，卵泡表现出正常的发育、生长以及卵泡腔的形成（图6A）。先前发表的研究结果表明，两种培养方法在卵泡存活率方面无显著差异，但琼脂糖微模具中培养的卵泡直径显著更大57。这表明，与海藻酸盐包埋法相比，琼脂糖微模具能以更高的效率支持卵泡发生。

通过琼脂糖微模具培养的卵泡中卵母细胞的减数分裂进程和纺锤体排列情况进行了评估。按照方案第7.11步所述，对两种条件下的卵泡均诱导排卵。存活至第8天的卵泡进行了后续分析。 体外 排卵，以及两种条件下排卵前（pre-hCG）和排卵后（post-hCG）的代表性图像如下所示（图6B). 既往实验表明，与海藻酸盐相比，琼脂糖中培养的卵泡排卵率显著更高。在排出的卵母细胞中，不同条件下MII期卵母细...

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讨论

体外配子发生和成熟是深入理解卵母细胞生物学的基础技术，在辅助生殖技术、生育力保存以及物种保护方面具有潜在应用价值。支持体外配子发生（IVG）的方法通常依赖于与体细胞共培养，以构建重构卵巢30。这些支持细胞的重要性在体内已被广泛认知，其中卵泡体细胞微环境对卵母细胞的正常生长和发育至关重要2,3,8,9。然而，目前的体外卵泡培养方法所产生的卵母细胞激活能力下降，与体内配子相比，受精率和胚胎发育能力均受到影响，且转录组特征存在差异64,65,66。据报道，体外培养所得卵...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国儿童健康与人类发展国立研究所（R01HD105752 资助 F.E.D.，T32HD094699 资助 E.J.Z）、NIH 共同基金的 SenNet 计划（U54AG075932 和 UH3CA268105 资助 F.E.D.）以及比尔 & 梅琳达·盖茨基金会资助（编号 INV-003385，授予 F.E.D.）。根据比尔 & 比尔及梅琳达·盖茨基金会，本投稿可能产生的作者接受稿件版本已授予知识共享署名4.0通用许可。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>材料与化学品
 50 mL 聚苯乙烯离心管Globe Scientific941-11017-CS
1.5 mL 微量离心管Fisher ScientificMCT-150快速冷冻并储存培养基
100 毫米培养皿，未处理Fisher Scientific08-757-100D 制备并储存琼脂糖微模具
100% 乙醇Mercedes Scientific1200组织处理
1000 µL  移液器吸头，低吸附MIDSCIPR-1000BK培养小贴士 
200 µL  移液器吸头，低吸附MIDSCIPR-200BK培养小贴士 
24孔板康宁353047培养
35 mm 培养皿Falcon351008分离卵巢并在酶解培养基中孵育
95% 乙醇Mercedes Scientific1210组织处理
琼脂糖HoeferGR140微模具
BioXtra 矿物油，轻质油，适用于小鼠胚胎细胞培养Sigma-AldrichM5310-500ML用作生物相容性脱模剂
牛血清白蛋白 MP Biomedicals103700培养基
清洁除尘布，10盎司，6片装Office Depot 110284压缩空气
Clear V4 树脂 1 LFormlabs, IncRS-F2-GPCL-043D打印树脂
康宁可重复使用塑料低型100 mL烧杯，聚丙烯，带刻度康宁1000P-100用于混合硅胶组分的烧杯 
DNA酶IQiagen79254酶解培养基
Ecoflex 00-45 近无色Smooth-On, IncB09M8Y9PTV硅胶材料
F-12 + GlutaMAXGibco31765-035培养基
胎牛胎球蛋白SigmaF-3385培养基
胎牛血清（FBS）峰值血清PS-FB2解剖培养基，酶解培养基  维持培养基 &与成熟培养基
Fisherbrand 灭菌袋Fisher Scientific01-812-50 灭菌袋
促卵泡激素（FSH）EMD Serono, Inc.Gonal-F 处方药 培养基 &与成熟培养基
Gibco DPBS、钙、镁Fisher Scientific14-040-182 杜氏磷酸盐缓冲液
人绒毛膜促性腺激素（hCG）Sigma AldrichC1063-1VL成熟培养基
胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）赛默飞世尔科技41400045培养基
Invitrogen Molecular Probes 罗丹明鬼笔环肽Fisher ScientificR415卵细胞骨架染色
体外受精培养皿赛默飞世尔科技150260分离、筛选并预平衡卵泡
Leibovit'z 15 (L15)Gibco11415-064解剖介质 &和酶解培养基
LiberaseSigma Aldrich5401119001酶解培养基
MEM? + GlutaMAXGibco32561-037维持培养基，  培养基 &与成熟培养基
小鼠表皮生长因子（EGF）BD 生物科学354010成熟培养基
Nalgene 透明聚碳酸酯经典设计干燥器赛默飞世尔科技5311-0250真空干燥器 
石蜡Fisher Scientific83-30组织处理 &和包埋
青霉素-链霉素Gibco15140-122解剖培养基，酶解培养基 & 维持培养基
移液器吸头剥离器OrigioMXL3-200培养
含DAPI的VECTASHIELD PLUS抗荧光淬灭封片剂Vector LaboratoriesH-2000卵核染色
二甲苯Mercedes Scientific9840组织处理
α-Tubulin（11H10）兔单克隆抗体（Alexa Fluor 488 标记）细胞信号技术公司5063S卵细胞微管蛋白染色
<强>仪器设备
构建平台 2Formlabs, IncBP-F3-02-01 3D 打印机组件
Dino-Lite Edge AF4915ZTL，USB 2.0Dino-LiteAF4915ZTL用于延时成像设置的成像仪
Form 3 树脂槽 V2.1 Formlabs, IncRT-F3-02-013D 打印机部件
Form 3B+ 3D 打印机Formlabs, IncF3B-P-PRINTERFormlabs 的立体光刻（SLA）3D 打印机
后固化 Formlabs, IncFH-CU-01固化平台 
形成洗涤液Formlabs, IncFH-WA-01洗涤平台
喷雾瓶配泵式雾化器VWR0309-3005涂抹脱模剂
Edge 系列聚光罩（T5、T8 型号除外）Dino-LiteN3C-R延时成像装置的成像组件
结合RK-10支架与RK-10-EX臂扩展装置的安装支架组件Dino-LiteRK-10A延时成像装置的成像组件
组织包埋机LeicaHistoCore Arcadia嵌入微模具
组织处理仪LeicaTP1020处理微模具
211DS 摇床培养箱（往复式摇床）Labnet InternationalI-5211-DS将卵巢在酶解培养基中孵育以释放卵泡
<强>软件 
Autodesk Fusion欧特克有限公司计算机辅助设计（CAD）软件。Autodesk 通过其 Autodesk 教育计划提供免费的教育用途访问权限。
DinoCapture 3.0 版本 1.1.1.3 Dino-Lite
ImageJ美国国立卫生研究院分析OCT图像并测量卵泡
PreFormFormlabs, Inc一款专为 Formlabs 公司的光固化立体成型（SLA）3D 打印机设计的免费打印准备软件。 

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可定制琼脂糖模具的制备及其在无支架小鼠卵巢卵泡培养中的应用
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