我们描述了一种在新型无支架琼脂糖模具中培养卵巢卵泡的方法，该方法可作为补充 体外 配子发生
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方法文章
可定制琼脂糖模具的制备及其在无支架小鼠卵巢卵泡培养中的应用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
卵巢卵泡是卵巢的功能单位，可产生维持女性生殖功能和健康所必需的激素和配子。体外重现卵泡发育、排卵和黄体化过程的能力在基础研究、转化研究和临床应用中具有广泛用途。目前最先进的体外卵泡培养系统可维持卵泡的三维（3D）结构，这对于人类减数分裂成熟至中期II（MII）的卵母细胞发育至关重要。最近，一种无需支架的体外培养小鼠多层次级卵泡的方法已被开发并验证。该方法采用定制的3D打印模具，在琼脂糖上微图案化出微孔阵列，以容纳卵泡的体积扩张。在此无支架环境中培养的卵泡，其激素分泌水平和存活率与成熟的基于海藻酸盐包封的体外卵泡生长（eIVFG）系统相当。重要的是，琼脂糖微孔阵列方法具有可扩展性，技术要求较低，并且相较于eIVFG系统，表现出更优的卵泡生长和排卵率。该方法所制备的模具具有良好的生物相容性，适用于对材料特异性浸出物及其他环境污染物高度敏感的卵母细胞。此外，该系统中的卵泡在同一焦平面上培养，便于进行实时延时成像与分析。为提高该新技术的可及性，本文详细描述了设计和3D打印主模具、制备适用于24孔或96孔板的硅胶模具，以及在琼脂糖模具中培养分离的多层次级卵巢卵泡所需的方法。该系统还可与低成本的延时成像系统整合，实现形态动力学分析。此外，模具可进行石蜡包埋，用于后续组织学分析。总体而言，这一用户友好的方法是一种多功能的卵泡培养工具，还可进一步定制，以促进卵泡微环境中生殖细胞的分化与成熟，从而实现完整的体外配子发生。
引言
卵母细胞（即雌性配子）在受精时为胚胎提供大部分细胞质以及一半的遗传物质，这对下一代的发育至关重要。卵子发生始于胚胎发育时期，此时原始生殖细胞进入减数分裂并停滞于减数分裂Ⅰ前期。这些卵母细胞位于原始卵泡内，构成卵巢储备——一个有限且不可再生的卵泡库，卵母细胞随后被逐步募集。卵泡通过称为卵泡发生的过程发育，其最终目标是产生一个能够受精的成熟配子1,2,3,4,5。卵泡发育始于一个早期的、促性腺激素非依赖性阶段，此阶段旁分泌信号对卵泡的存活和生长至关重要。当卵泡发育至次级阶段时，其功能转而依赖促性腺激素，标志着信号调控由旁分泌向内分泌转变。次级卵泡的一个关键特征是卵母细胞周围至少有两层完整的立方状颗粒细胞，同时出现新形成的膜细胞层。膜细胞构成卵泡的最外层，提供雄激素并起结构支持作用6,7。最终，在排卵期间，卵泡内形成充满液体的囊腔，并在黄体生成素（LH）激增的刺激下破裂，释放出一个处于减数分裂Ⅱ期停滞状态、具备受精能力的配子2,<....
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方案
本方案所涉及的所有动物实验程序均经西北大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行操作。
1. 调整主模具设计
本部分描述了设计阶段（图1）中执行的初始步骤，其中将定制的微孔结构引入24孔培养板主模具的计算机辅助设计（CAD）中，该设计称为24孔主模具基础设计（补充文件 1）。微孔的尺寸决定了卵泡所获得的支撑程度及其最大生长尺寸，而孔的数量则决定了每个琼脂糖模具中可容纳卵泡的最大数量。经过调整的主模具设计将在下一节中用于制备生物相容性硅胶模具，以进行琼脂糖浇铸。
- 使用 CAD 软件打开 24 孔主模具基底设计 .step 文件（图 2A）。
- 选择该对象的内表面区域，然后转到 设计 工作区中的 实体 选项卡，选择 创建草图 以插入所需的微模具设计（图 2Bi）。
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结果
为了确定使用本研究方案第7节中所述的新型技术是否能够支持卵泡的存活与生长，从同一批小鼠中分离卵泡，并平行培养于琼脂糖微模具中或包埋于0.5%海藻酸盐中。培养期间每隔一天的代表性图像显示，卵泡表现出正常的发育、生长以及卵泡腔的形成（图6A）。先前发表的研究结果表明，两种培养方法在卵泡存活率方面无显著差异，但琼脂糖微模具中培养的卵泡直径显著更大57。这表明，与海藻酸盐包埋法相比，琼脂糖微模具能以更高的效率支持卵泡发生。
通过琼脂糖微模具培养的卵泡中卵母细胞的减数分裂进程和纺锤体排列情况进行了评估。按照方案第7.11步所述，对两种条件下的卵泡均诱导排卵。存活至第8天的卵泡进行了后续分析。 体外 排卵，以及两种条件下排卵前（pre-hCG）和排卵后（post-hCG）的代表性图像如下所示（图6B). 既往实验表明，与海藻酸盐相比，琼脂糖中培养的卵泡排卵率显著更高。在排出的卵母细胞中，不同条件下MII期卵母细.......
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讨论
体外配子发生和成熟是深入理解卵母细胞生物学的基础技术，在辅助生殖技术、生育力保存以及物种保护方面具有潜在应用价值。支持体外配子发生（IVG）的方法通常依赖于与体细胞共培养，以构建重构卵巢30。这些支持细胞的重要性在体内已被广泛认知，其中卵泡体细胞微环境对卵母细胞的正常生长和发育至关重要2,3,8,9。然而，目前的体外卵泡培养方法所产生的卵母细胞激活能力下降，与体内配子相比，受精率和胚胎发育能力均受到影响，且转录组特征存在差异64,65,66。据报道，体外培养所得卵.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国儿童健康与人类发展国立研究所（R01HD105752 资助 F.E.D.，T32HD094699 资助 E.J.Z）、NIH 共同基金的 SenNet 计划（U54AG075932 和 UH3CA268105 资助 F.E.D.）以及比尔 & 梅琳达·盖茨基金会资助（编号 INV-003385，授予 F.E.D.）。根据比尔 & 比尔及梅琳达·盖茨基金会，本投稿可能产生的作者接受稿件版本已授予知识共享署名4.0通用许可。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>材料与化学品 | |||
| 50 mL 聚苯乙烯离心管 | Globe Scientific | 941-11017-CS | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | MCT-150 | 快速冷冻并储存培养基 |
| 100 毫米培养皿，未处理 | Fisher Scientific | 08-757-100D | 制备并储存琼脂糖微模具 |
| 100% 乙醇 | Mercedes Scientific | 1200 | 组织处理 |
| 1000 µL 移液器吸头，低吸附 | MIDSCI | PR-1000BK | 培养小贴士 |
| 200 µL 移液器吸头，低吸附 | MIDSCI | PR-200BK | 培养小贴士 |
| 24孔板 | 康宁 | 353047 | 培养 |
| 35 mm 培养皿 | Falcon | 351008 | 分离卵巢并在酶解培养基中孵育 |
| 95% 乙醇 | Mercedes Scientific | 1210 | 组织处理 |
| 琼脂糖 | Hoefer | GR140 | 微模具 |
| BioXtra 矿物油，轻质油，适用于小鼠胚胎细胞培养 | Sigma-Aldrich | M5310-500ML | 用作生物相容性脱模剂 |
| 牛血清白蛋白 | MP Biomedicals | 103700 | 培养基 |
| 清洁除尘布，10盎司，6片装 | Office Depot | 110284 | 压缩空气 |
| Clear V4 树脂 1 L | Formlabs, Inc | RS-F2-GPCL-04 | 3D打印树脂 |
| 康宁可重复使用塑料低型100 mL烧杯，聚丙烯，带刻度 | 康宁 | 1000P-100 | 用于混合硅胶组分的烧杯 |
| DNA酶I | Qiagen | 79254 | 酶解培养基 |
| Ecoflex 00-45 近无色 | Smooth-On, Inc | B09M8Y9PTV | 硅胶材料 |
| F-12 + GlutaMAX | Gibco | 31765-035 | 培养基 |
| 胎牛胎球蛋白 | Sigma | F-3385 | 培养基 |
| 胎牛血清（FBS） | 峰值血清 | PS-FB2 | 解剖培养基，酶解培养基 维持培养基 &与成熟培养基 |
| Fisherbrand 灭菌袋 | Fisher Scientific | 01-812-50 | 灭菌袋 |
| 促卵泡激素（FSH） | EMD Serono, Inc. | Gonal-F 处方药 | 培养基 &与成熟培养基 |
| Gibco DPBS、钙、镁 | Fisher Scientific | 14-040-182 | 杜氏磷酸盐缓冲液 |
| 人绒毛膜促性腺激素（hCG） | Sigma Aldrich | C1063-1VL | 成熟培养基 |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS） | 赛默飞世尔科技 | 41400045 | 培养基 |
| Invitrogen Molecular Probes 罗丹明鬼笔环肽 | Fisher Scientific | R415 | 卵细胞骨架染色 |
| 体外受精培养皿 | 赛默飞世尔科技 | 150260 | 分离、筛选并预平衡卵泡 |
| Leibovit'z 15 (L15) | Gibco | 11415-064 | 解剖介质 &和酶解培养基 |
| Liberase | Sigma Aldrich | 5401119001 | 酶解培养基 |
| MEM? + GlutaMAX | Gibco | 32561-037 | 维持培养基， 培养基 &与成熟培养基 |
| 小鼠表皮生长因子（EGF） | BD 生物科学 | 354010 | 成熟培养基 |
| Nalgene 透明聚碳酸酯经典设计干燥器 | 赛默飞世尔科技 | 5311-0250 | 真空干燥器 |
| 石蜡 | Fisher Scientific | 83-30 | 组织处理 &和包埋 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | 解剖培养基，酶解培养基 & 维持培养基 |
| 移液器吸头剥离器 | Origio | MXL3-200 | 培养 |
| 含DAPI的VECTASHIELD PLUS抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-2000 | 卵核染色 |
| 二甲苯 | Mercedes Scientific | 9840 | 组织处理 |
| α-Tubulin（11H10）兔单克隆抗体（Alexa Fluor 488 标记） | 细胞信号技术公司 | 5063S | 卵细胞微管蛋白染色 |
| <强>仪器设备 | |||
| 构建平台 2 | Formlabs, Inc | BP-F3-02-01 | 3D 打印机组件 |
| Dino-Lite Edge AF4915ZTL，USB 2.0 | Dino-Lite | AF4915ZTL | 用于延时成像设置的成像仪 |
| Form 3 树脂槽 V2.1 | Formlabs, Inc | RT-F3-02-01 | 3D 打印机部件 |
| Form 3B+ 3D 打印机 | Formlabs, Inc | F3B-P-PRINTER | Formlabs 的立体光刻（SLA）3D 打印机 |
| 后固化 | Formlabs, Inc | FH-CU-01 | 固化平台 |
| 形成洗涤液 | Formlabs, Inc | FH-WA-01 | 洗涤平台 |
| 喷雾瓶配泵式雾化器 | VWR | 0309-3005 | 涂抹脱模剂 |
| Edge 系列聚光罩（T5、T8 型号除外） | Dino-Lite | N3C-R | 延时成像装置的成像组件 |
| 结合RK-10支架与RK-10-EX臂扩展装置的安装支架组件 | Dino-Lite | RK-10A | 延时成像装置的成像组件 |
| 组织包埋机 | Leica | HistoCore Arcadia | 嵌入微模具 |
| 组织处理仪 | Leica | TP1020 | 处理微模具 |
| 211DS 摇床培养箱（往复式摇床） | Labnet International | I-5211-DS | 将卵巢在酶解培养基中孵育以释放卵泡 |
| <强>软件 | |||
| Autodesk Fusion | 欧特克有限公司 | 计算机辅助设计（CAD）软件。Autodesk 通过其 Autodesk 教育计划提供免费的教育用途访问权限。 | |
| DinoCapture 3.0 版本 1.1.1.3 | Dino-Lite | ||
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | 分析OCT图像并测量卵泡 | |
| PreForm | Formlabs, Inc | 一款专为 Formlabs 公司的光固化立体成型（SLA）3D 打印机设计的免费打印准备软件。 |
参考文献
- Duncan, F. E., et al. Unscrambling the oocyte and the egg: clarifying terminology of the female gamete in mammals. Mol Hum Reprod. 26 (11), 797-800 (2020).
- Jaffe, L., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte ....
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重印与许可
