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方法文章

用于嵌合抗原受体T细胞治疗研究的循环胶质瘤模型

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DOI：

10.3791/68881

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2025年10月17日

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, 2Department of Immunology, Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, Gusu School, Nanjing Medical University, 3Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Neurosurgery, The Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Clinical Laboratory Medicine, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案通过侧脑室注射建立循环胶质瘤模型，以研究嵌合抗原受体T细胞疗法的治疗效果 体内.

摘要

脑脊液（CSF）中的循环肿瘤细胞是胶质瘤肿瘤复发和颅内转移的重要因素。目前许多研究正致力于寻找靶向并清除脑脊液中循环肿瘤的有效策略。嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已被广泛应用于多种循环肿瘤的治疗。然而，由于缺乏合适的循环胶质瘤模型，相关研究受到限制。本文建立并应用了一种循环胶质瘤模型用于CAR T细胞疗法的研究。该模型采用侧脑室注射法构建，该方法在颅内疾病局部治疗中被广泛应用。将胶质瘤细胞注射至侧脑室以形成颅内原位肿瘤，从侧脑室脱落的肿瘤用于模拟脑脊液中的循环肿瘤。该模型构建简便，可广泛应用于针对循环胶质瘤的CAR T细胞疗法的各类研究。因此，该循环胶质瘤模型为开展针对循环肿瘤的高效CAR T细胞治疗研究提供了一种独特的胶质瘤转移模型。

引言

胶质瘤是成人中最常见的原发性恶性脑肿瘤1,2。目前的治疗方法，包括手术、放疗和化疗，疗效有限，中位生存期仅为14-15个月3,4,5。脑脊液（CSF）中的循环胶质瘤细胞在肿瘤复发和颅内转移中起关键作用6,7。因此，迫切需要开发更有效的治疗策略以清除循环胶质瘤细胞。

近期关于胶质瘤的研究主要集中在颅内原发性肿瘤8,9。然而，临床上最需要解决的关键问题是如何靶向并清除循环中的胶质瘤细胞。因此，对手术前或手术后循环胶质瘤的研究需要给予更多关注。嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是目前研究循环肿瘤细胞最常用的策略10,11。然而，由于颅内肿瘤具有特殊的解剖结构，建立一个合适的循环胶质瘤模型十分困难，而这对循环胶质瘤的研究至关重要12,13,14,15,16。

本研究建立了一种基于侧脑室注射的独特循环胶质瘤模型。在该模型中，将胶质瘤细胞注入侧脑室，通过以下方法检测颅内原位肿瘤及脑脊液中的循环肿瘤： 体内 第10天进行生物发光成像和流式细胞术分析。当循环胶质瘤模型小鼠的肿瘤负荷达到约6.5 × 10时，开始CAR-T治疗。5p/s. 每5天监测一次肿瘤负荷，以评估CAR-T细胞的治疗效果。该模型模拟了胶质瘤患者肿瘤细胞脱落的状态，可用于循环胶质瘤的多项研究。

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方案

本研究中的动物实验均经南京医科大学机构审查委员会和动物伦理委员会批准并监督（IACUC-1905048）。实验选用6至8周龄的C57BL/6J雌性小鼠。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 动物准备

  1. 将小鼠饲养在屏障环境中，12小时光照/12小时黑暗循环，环境温度24 °C，相对湿度50%的笼具中。
  2. 称量小鼠体重，并按照机构批准的方案通过腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠和10 mg/kg赛拉嗪对其进行麻醉17。
    注：戊巴比妥钠与赛拉嗪的联合使用在小鼠立体定位注射操作中被广泛采用。通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉充分，以确保动物在手术前完全失去意识。为防止角膜干燥和损伤，麻醉期间需将兽用眼科软膏涂抹于眼睛上。
  3. 使用实验动物专用剃毛器去除小鼠头部的毛发，并将小鼠的头部和四肢固定在立体定位仪上。
  4. 用棉签蘸取碘伏对小鼠头部进行消毒，并用无菌手术巾覆盖小鼠身体其余部分。
  5. 使用手术刀沿右侧前额顶部正中线方向切开约1 cm的头皮。
    ​注：所有手术器械在使用前均应正确灭菌，以防止感染。操作器械时应小心谨慎，避免造成伤害，所有操作均应在无菌环境中进行。
  6. 调节鼻夹和耳杆，确保λ缝与bregma之间Z轴的高度差小于或等于0.05 mm。

2. 循环胶质瘤模型的构建

  1. 用蘸有龙胆紫的棉签标记中线右侧1.5 mm、前囟后方1.1 mm处（坐标：前囟后-1.1 mm，内侧-1.5 mm）。
  2. 使用直径为0.5 mm的微型颅骨钻，在目标坐标处钻孔以暴露硬脑膜。
  3. 用生理盐水冲洗以去除骨碎片。
  4. 使用带有深度限位器的微量注射器吸取 5 µL 肿瘤细胞悬液（GL261-Luc-Gfp，1×10⁶）5 细胞/µL，溶于含0.1% BSA的PBS中）
  5. 以0.2 mm/s的速度将针插入至3.0 mm深度，随后回撤0.5 mm，暂停10秒以稳定组织压力。
  6. 使用校准的微量注射泵以1 µL/min的速度注射细胞，注射后停留10分钟，以尽量减少反流。
  7. 缓慢撤出微量注射器，用无菌棉签在注射部位施加压力30-60秒。
  8. 使用可吸收外科缝线（6-0）缝合头皮，并用碘伏重新消毒切口。
  9. 将小鼠置于精密控制的37°C加热垫上以复温，并监测其健康状况。
  10. 在小鼠恢复持续的翻正反射和自主运动后，将其放回清洁的笼子中。
  11. 对小鼠进行成像 体内 使用生物发光成像系统（IVIS Spectrum）在荷瘤后第10天检测移植的肿瘤。
  12. 腹腔注射 D-荧光素钾盐（150 mg/kg）至小鼠体内。
    注意：使用无菌 D-PBS 稀释 D-荧光素钾盐。
  13. 使用1 L/min氧气中的2%异氟烷诱导麻醉2 10分钟等待期间。
    注意：使用异氟烷时应在通风良好的化学通风橱中进行，以尽量减少接触麻醉气体，确保实验过程中动物和研究人员的安全。
  14. 维持麻醉于 1.5% 异氟烷 通过 鼻锥
  15. 使用 IVIS Spectrum 进行生物发光成像。
  16. 通过穿刺小鼠小脑延髓池进行脑脊液采集。
    注意：在异氟烷麻醉下，通过穿刺小鼠小脑延髓池采集脑脊液（CSF）。所有操作步骤，包括麻醉、手术暴露和样本采集，均在SPF条件下进行，以最大限度减少污染和感染风险。将小鼠俯卧位固定于立体定位仪上，在解剖显微镜下小心暴露枕大池。使用27 G Hamilton注射器针头穿刺该池，并采用徒手操作技术采集脑脊液。每只小鼠可获得约5–10 µL透明脑脊液。为进一步降低感染风险，穿刺前使用碘伏对术区进行消毒，所有手术器械均经高压灭菌处理。脑脊液采集后，用无菌棉球轻压穿刺部位以阻止液体渗漏。随后将小鼠置于加热垫上，并持续监测直至完全从麻醉中恢复。术后给予镇痛药物以缓解不适。动物需每日观察，连续至少三天，以确认无神经系统症状或感染迹象。
  17. 通过流式细胞术检测脑脊液中的肿瘤细胞。GFP+ 群体代表肿瘤细胞。
    注意：已对小鼠胶质瘤细胞系 GL261 进行基因改造，使其携带荧光素酶（Luc）。当荧光值达到约 5 × 105当在脑脊液（CSF）中检测到p/sand肿瘤细胞时，表明操作成功。所使用的成像软件为Living Image 4.5.2，成像参数设置为生物发光模式。
  18. 选择成功成瘤的小鼠以评估CAR-T细胞的治疗效果。

3. 通过向侧脑室注射CAR-T细胞治疗循环性胶质瘤

  1. 当循环胶质瘤模型小鼠中的肿瘤大小达到约6.5 × 105 p/s，选择这些小鼠进行CAR-T治疗。
  2. 称重循环胶质瘤模型小鼠，并通过腹腔注射每公斤体重50 mg戊巴比妥钠和每公斤体重50 mg赛拉嗪进行麻醉。
  3. 重复步骤1.3−1.5的过程。
  4. 分离头皮和颅骨，精确定位构建循环胶质瘤模型时所钻的孔洞，并按照步骤2.2-2.3中所述程序进行操作。
  5. 用微量注射器吸取10 µL CAR-T细胞悬液，小心将针头插入小鼠侧脑室，使用立体定位仪调节注射深度，缓慢注入CAR-T细胞溶液。
    注意：与GL261细胞注射一致，CAR-T细胞被注射至右侧侧脑室（坐标：前囟后-1.1 mm，内侧-1.5 mm），注射深度为2.5 mm。对照组以PBS替代CAR-T细胞进行处理。
  6. 保留针头10分钟，然后缓慢拔出针头，用无菌纱布轻轻按压注射部位，以防止注射完成后出血。使用可吸收缝合线（6-0）缝合头皮，并对切口进行消毒。
  7. 将小鼠置于精密控制的37°C加热垫上以复温，并监测其健康状况。
  8. 在小鼠恢复持续的翻正反射和自主运动后，将其放回清洁的笼子中。
  9. 执行 体内 利用生物发光成像技术监测小鼠肿瘤的生长。光学成像可用于评估CAR-T细胞治疗的疗效。
  10. 每两天称量一次小鼠体重，每5天进行一次生物发光成像（BLI）以更准确地监测肿瘤生长，直至达到实验终点。
  11. 处死小鼠，并将脑组织在4%多聚甲醛中固定24-48小时。
  12. 将组织包埋于石蜡中，并切成5 µm厚的切片。
  13. 脱蜡切片，梯度酒精复水，苏木精染色，伊红复染，盖玻片封片。
    注意：本研究的终末观察时间为第30天，小鼠通过腹腔注射过量戊巴比妥钠实施安乐死。小鼠尸体交由南京医科大学医学实验动物中心进行处理。废弃针头置于锐器盒中，并交由南京医科大学实验室与设备管理处集中处置。

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结果

用于CAR-T治疗的循环胶质瘤模型示意图如图所示 图1将CAR-T细胞通过微量注射器注入侧脑室，以验证其治疗效果。该方法可将CAR-T细胞直接递送至脑部，靶向循环中的胶质瘤细胞。注射操作于小鼠侧脑室植入GL261细胞后的第11天进行。在不同时间点（第15、20、25和30天），通过以下方法监测肿瘤反应 体内 生物发光成像和流式细胞术检测GFP+ 脑脊液中的肿瘤细胞，从而证实CAR-T细胞成功输注。

实验时间线如 图2A所示。如图2B、2C所示，CAR-T治疗组的肿瘤明显小于对照组，表明CAR-T疗法有效减小了肿瘤体积。为进一步确认CAR-T细胞成功递送至脑室并发挥抗肿瘤作用，对脑组织切片进行了组织学分析...

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讨论

本研究通过侧脑室注射建立的循环胶质瘤模型取得了重要进展，相较于现有模型具有多项优势。侧脑室注射技术具有高度可重复性，能够在相对较短的时间内实现稳定的肿瘤建模，使其成为研究肿瘤细胞向脑脊液（CSF）播散以及评估治疗手段（如CAR-T细胞疗法）效果的有力工具。与传统的静脉输注CAR-T细胞相比，后者难以穿越血脑屏障，而脑室内注射则可将CAR-T细胞精准递送至肿瘤周围区域10,18。2024年发表于《新英格兰医学杂志》（The New England Journal of Medicine）的一项研究报道，三名复发性胶质母细胞瘤（GBM）患者在接受新型CAR-T治疗后1至5天内出现显著肿瘤退缩，其中一名患者的肿瘤几乎完全消失19。该方法成功实施依赖于若干关键步骤：精确制作颅窗并进行钻孔，以及准确的立体定位注射至侧脑室，是确保肿瘤建模一致性的核心环节。使用微注射泵控制注射速率，并在注射后保持足够的停留时间，有助于最大限度减少反流，从而可靠地递送肿瘤细胞和CAR-T...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由国家自然科学基金（82230059）和中国江苏省重点研发计划（BE2022770）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
可吸收外科缝合线上海浦东金环医疗用品有限公司R611
CAR-TCreative Biolabs
D-荧光素钾盐MCEHY-12591B
GL261-Luc-Gfp上海中乔新舟生物科技有限公司ZQ0932
活体生物发光成像系统TanonTanon ABL X6
实验动物剃毛器碧云天生物技术FS600
小鼠南京医科大学动物中心
微量注射泵RWDR462
微量注射器Hamilton87943
微型颅骨钻RWD78001
戊巴比妥钠 ChemSrc57-33-0
立体定位仪RWD68043
赛拉嗪ChemSrc7361-61-7

参考文献

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