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评估初级运动皮层兴奋性及通过经颅磁刺激与肌电图联合检测兴奋性调节

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DOI：

10.3791/68897

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2025年10月7日

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1Champalimaud Research and Clinical Centre, Champalimaud Foundation, 2Department of Psychiatry and Mental Health, ULS Loures-Odivelas, Hospital Beatriz Ângelo, 3Lisbon School of Medicine, University of Lisbon, FMUL, 4Institute for Systems and Robotics-Lisbon (LARSyS), Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa, 5Portuguese Red Cross Health School, 6Faculty of Medicine, University of Porto, FMUP, 7Department of Psychiatry and Mental Health, Centro Hospitalar Universitário de São João, CHUSJ, 8NOVA Medical School, Faculdade de Ciências Médicas, NMS, FCM, Universidade NOVA de Lisboa

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种实验方案，旨在阐述如何利用经颅磁刺激（transcranial magnetic stimulation, TMS）联合肌电图（electromyography, EMG）来评估初级运动皮层的兴奋性及其兴奋性调节能力。

摘要

我们描述了一种通过联合使用肌电图（EMG）和对初级运动皮层（M1）进行重复经颅磁刺激（TMS）来评估运动皮层兴奋性及其调节作用的实验方案。EMG记录采用自行构建的系统，表面电极置于右手第一背侧骨间肌（FDI）上，参考电极置于左肘部。TMS使用配备双线圈（8字形线圈）的磁刺激器，并在神经导航系统的引导下进行。通过系统性地施加单脉冲TMS并调整线圈位置，确定FDI肌肉对应的运动热点，并将其作为所有TMS操作的目标位点。静息运动阈值（rMT）定义为：在至少10次试验中的5次以上，诱发出振幅≥50 µV的运动诱发电位（MEPs）所需的最小刺激强度；而活动运动阈值（aMT）则定义为：受试者维持最大自主肌肉激活度的10-20%时，在至少10次脉冲中的5次以上诱发出振幅≥200 µV的MEPs所需的最小刺激强度。基线皮层兴奋性定义为：以120% rMT强度随机间隔（6-10 s）施加40次单脉冲TMS后，所获得的MEP振幅的平均值。运动皮层兴奋性的调节通过间歇性θ爆发刺激（iTBS）方案实现（50 Hz三联脉冲，80% aMT强度，以5 Hz频率持续2秒，间歇8秒，重复20次；共600个脉冲）。兴奋性调节效果通过在刺激后四个时间点重复测量MEP振幅进行评估：即刻（T0）、10分钟（T10）、20分钟（T20）和30分钟（T30）。该方案可实现对运动皮层兴奋性的精确且可重复的评估，并能捕捉iTBS所引起的调节效应的峰值变化。

引言

经颅磁刺激（TMS）是一种非侵入性神经刺激技术，可通过产生能够穿透头皮和颅骨的磁场，在到达皮层组织时诱发神经元活动。1. TMS 能够实现 体内 人类中枢神经系统（CNS）神经生理学评估2,3,4当以重复序列（重复经颅磁刺激，rTMS）作用于特定皮层区域时，TMS可诱导皮层靶区兴奋性的改变，这种改变可延续至刺激结束后，具体效应取决于所采用刺激方案的参数。5单脉冲TMS常用于测量皮层兴奋性，当在rTMS前后应用时，可量化TMS诱导的皮层兴奋性调节程度。2,3,4初级运动皮层（M1）一直是此类方案的主要靶区之一，因其功能输出可通过肌电图（EMG）记录进行量化。6,7与其他神经生理学和神经影像学技术（如脑电图（EEG）和功能磁共振成像（fMRI））相比，经颅磁刺激-肌电图（TMS-EMG）在临床应用中具有更多优势。EEG需要复杂的电极设置、严格的伪迹管理以及复杂的信号处理8而fMRI成本较高、可及性有限，且时间分辨率较低9TMS-EMG 依赖于相对简单的表面肌电图记录，其分析集中于运动诱发电位（MEP）幅值和潜伏期等直接且客观的指标。这种在数据采集与处理上的简便性，加之较短的准备时间以及较低的基础设施要求，使得 TMS-EMG 特别适合向临床实践转化，尤其适用于需要快速、可靠且可重复的生物标志物的临床场景。10.

皮质兴奋性调节的测量被视为神经可塑性的间接指标，神经可塑性是指大脑在应对内在或外在刺激时发生功能和结构改变的能力。11,12神经可塑性的改变与多种神经精神疾病相关，例如重度抑郁症（MDD）。13,14,15,16. 鉴于 探究神经可塑性机制的能力， 体内以及在临床环境中的实际应用价值 评估 源自TMS-EMG的皮层兴奋性调节 已被研究作为神经精神障碍的潜在生物标志物17,18,19这些指标作为诊断生物标志物可能具有广阔的应用前景18 以及作为治疗结果的预测指标14,15单脉冲或成对脉冲经颅磁刺激（TMS）通常以静息运动阈值（rMT）的百分比来设定刺激强度，即诱发运动反应所需的最小刺激强度（通常为110%-130% rMT）。实验方案常采用20-40次脉冲以可靠评估皮质脊髓兴奋性，而在不同时间点干预前后评估调节效应时，则通常使用数百次脉冲。20. 脉冲间间隔（IPI）通常应 >4 秒，以尽量减少残留效应并确保连续诱发的运动诱发电位（MEPs）相互独立21在用于调节皮层兴奋性时，相关方案通常采用低频重复经颅磁刺激（rTMS；≈1 Hz，600–1800个脉冲）或持续性θ爆发刺激（cTBS；50 Hz下3个脉冲，每200 ms重复一次，持续40 s），以诱导抑制性后效应。为增强皮层兴奋性，方案通常采用高频重复经颅磁刺激（rTMS；≥5 Hz，通常为5–20 Hz，600–2000个脉冲）或间歇性θ爆发刺激（iTBS）。22iTBS 通常包含 600 次脉冲，以每 burst 3 个刺激、50 Hz 频率组成 burst，以 5 Hz 重复 2 秒，每 10 秒间歇性施加一次 train，刺激强度约为主动运动阈值（aMT）的 80%。由于其高效性、持续时间较短以及对皮层可塑性的显著促进作用，该模式已成为实验和临床研究中最广泛采用的方案。23,24.

然而，由于尚未解决的方法学挑战，其临床应用仍然受限。为应对这些挑战而开展的努力——主要通过检验和改进测量的可靠性——得出了不一致的研究结果25,26,27,28,29。这些不一致的结果至少部分可归因于研究中存在的重大方法学缺陷以及研究间的异质性，包括重复经颅磁刺激（rTMS）参数的差异，例如在低频范式中脉冲数量从20到1800个不等22，而在iTBS范式中则从600个脉冲的序列到改良版的1200个脉冲不等30。此外，未使用神经导航的研究显示，与使用神经导航的方案相比，运动诱发电位（MEP）振幅存在较大变异性，且rTMS方案的调节效应较弱31。已发表研究的样本量也相对较小，通常在10至25名受试者之间，限制了统计效能32。此外，用于评估可靠性的统计方法较为有限，部分研究依赖于组内相关系数（ICC）以外的指标24,33，而ICC通常被认为是最适合评估重测可靠性的指标26。

采用经颅磁刺激-肌电图（TMS-EMG）范式进行皮质兴奋性采集与分析的实验方案也可能导致额外的变异性。某些具体的方法学因素，例如施加的TMS脉冲数量，可能影响结果的可靠性：基于少于20个运动诱发电位（MEP）的估计值可靠性较差，而平均≥30个MEP可提供稳定的皮质脊髓兴奋性测量结果。类似地，刺激间间隔（IPI）也被证明会影响兴奋性，当间隔为2秒或更短时，由于刺激的累积效应，会引起皮质兴奋性的改变；而采用更保守的超过4秒的间隔则可减少此类混杂因素21。肌电图（EMG）采集技术34,35同样会影响测量的可靠性，例如，与单极导联相比，双极导联配置具有更高的空间选择性，并能减少邻近肌肉活动带来的信号污染34,35。因此，标准化数据采集与处理流程对于提高皮质兴奋性调节评估的准确性并确定其稳定性至关重要——稳定性是任何可靠生物标志物的关键属性36。

因此，为了推进将皮层兴奋性调节测量作为神经生物学评估的候选标志物，并确立其在临床应用中的可靠性，我们提出了一项基于该领域现有最佳证据的系统性方法所形成的实验方案，旨在最大限度地减少方法学异质性的潜在影响，并确保对运动皮层兴奋性及其调节进行准确且可重复的测量37,38。该方案包括采用适当的肌电图（EMG）采集协议34、使用神经导航系统39、采集足够数量的运动诱发电位（MEP）20、采用合适的刺激间间隔（IPI）21，以及对数据采集过程和信号处理方法进行详尽报告34。我们的结果表明，与现有文献中的最佳实践相比，信号稳定性得到提升，从而为建立可靠的神经生理学生物标志物所必需的方法学严谨性做出了贡献。

方案

本文所述方案旨在收集Seybert等人37以及Faro Viana等人38所报告的数据。所有参与者在参与研究前均签署书面知情同意书，其中说明了研究目的、操作流程、潜在风险以及其随时退出研究的权利。本研究方案已获得未知领域尚帕利莫德中心伦理委员会批准，并依照《赫尔辛基宣言》的规定执行。在其他研究或地点使用本方案前，必须先获得相关本地伦理委员会和/或主管机构的批准。在进行经颅磁刺激（TMS）前，应采用标准化的安全检查清单，以最大限度降低不良反应的风险，并以国际指南40,41作为可针对具体研究环境进行调整的参考框架。本方案设计总时长约1小时15分钟（图1）。

1. 设置要求与准备

  1. 确保有两名技术人员在场以最佳地开展实验，其中一人负责实施经颅磁刺激（TMS）操作，另一人协助完成其他步骤。
  2. 确保以下设备齐全：神经导航系统；舒适座椅；配备相应导联和电极的肌电图（EMG）设备；经颅磁刺激（TMS）刺激器，配备8字形线圈，支持输入间歇性theta脉冲刺激（iTBS）和单脉冲刺激程序，并可与神经导航系统和EMG系统连接。准备一台或两台计算机，以便同时观察EMG软件和神经导航软件。确保计算机配备蓝牙信号接收器，用于接收EMG信号。
  3. 确保备有以下耗材：酒精和纱布垫；用于清洁放置凝胶电极部位皮肤的水砂纸；供受试者使用的泳帽；以及供受试者和技术人员佩戴的耳塞。
  4. 在受试者到达前约30分钟开始准备，以正确设置神经导航系统、肌电图采集板、经颅磁刺激仪，以及用于生理数据采集所需的软件。
  5. 准备肌电图系统。
    1. 确保肌电图（EMG）设备已充满电（如适用），并准备好相应的电极：一个作为参考电极（单极，置于左侧肘部），另一个置于目标肌肉用于记录（双极，置于右侧第一背侧骨间肌）。需要额外一根电缆将经颅磁刺激（TMS）脉冲输出与肌电图信号同步，连接TMS设备与肌电图板。
    2. 将医用级银/氯化银（Ag/AgCl）电极插入接触点（共需3个电极）。同时，将经颅磁刺激（TMS）设备的电缆连接至肌电图（EMG）采集板，以输出每次TMS脉冲的触发信号。
    3. 对于自制的肌电图设备，将尼龙搭扣固定在稳定的表面上。将电极接触点插入肌电图设备对应的接口中。
    4. 在其中一台显示器/计算机上，打开 BONSAI 软件42 以及相应的EMG数据采集脚本。点击 开始 按钮，仅在准备就绪进行数据采集时按下（更多详情，请参见 补充文件 1，步骤1）。
  6. 准备经颅磁刺激（TMS）设备。
    1. 在经颅磁刺激（TMS）设备中设定兴奋性评估方案。该方案包括40次单脉冲刺激，刺激强度为静息运动阈值（rMT）的120%，刺激间随机间隔至少6秒，以避免前次刺激的残留效应。
    2. 根据给定的刺激参数插入一个iTBS刺激方案 先验的 设备参数：50 Hz 脉冲三联组，80% aMT，5 Hz，持续 2 秒，间隔 8 秒，重复 20 次，共 600 个脉冲。
    3. 在TMS设备屏幕显示最大刺激输出（MSO - %）的所有区域贴上纸条，使技术人员在进行静息运动阈值（rMT）和活动运动阈值（aMT）评估时处于盲态（更多细节参见 补充文件 1，步骤 2）。
  7. 准备ANT Neuro神经导航系统用于经颅磁刺激（TMS）。
    1. 组装所需的硬件组件，包括红外追踪相机、带有反光标记的受试者头带、指针工具、校准板（用于经颅磁刺激线圈）以及线圈追踪器（一种圆形装置，可附着于线圈上以实现位置的实时追踪）。
    2. 将相机安装在三脚架上，并将其放置于能够在整个实验过程中清晰看到所有其他神经导航组件的位置。
    3. 将线圈校准追踪器和校准板放置在经颅磁刺激（TMS）线圈上。
    4. 打开神经导航系统软件，输入受试者编号，并校准神经导航组件（更多细节请参见 补充文件 1，步骤3）。

2. 准备受试者

  1. 参与者到达后，通过使用基于已发表指南的问卷和/或结构化访谈来评估经颅磁刺激（TMS）应用的安全性40,41。内容应包括精神疾病和神经系统疾病的病史、意识丧失史、听力障碍、体内是否存在金属或磁性植入物、正在使用的药物以及妊娠状态。仅在无任何安全顾虑的情况下，方可继续进行实验流程。
  2. 让参与者坐在一把舒适的椅子上，确保其双前臂可处于自然放松的位置。调整坐姿角度，以便线圈能够舒适地放置于其头部。
  3. 要求参与者摘下眼镜、发夹或发卡，以及耳环或其他金属和/或电子设备。为其提供耳塞，并确保耳塞正确且稳定地佩戴。指导参与者保持清醒、安静和放松状态。在整个过程中必须确保参与者始终清醒，以尽可能减少生理信号的波动。
  4. 为提高电极与皮肤之间的接触质量并增强电信号传导，使用水砂纸轻轻擦拭第一背侧骨间肌（FDI）区域的皮肤，随后用含酒精的纱布快速擦拭清洁35。在对侧肘部重复此操作。待皮肤干燥后，将接地电极置于肘部作为零电压参考点，将记录电极置于对侧手部的FDI上，其中心位于肌腱方向约2.5 cm处（见图2）。
  5. 在参与者头部佩戴泳帽，用于标记TMS刺激位点的参考位置：
    1. 将泳帽以前后方向戴在参与者头部，确保帽缘前端与眉毛连线对齐，两侧与耳轮根部对齐。将泳帽覆盖头皮，但保持双耳暴露且不被遮挡。
    2. 在泳帽上绘制正中矢状线和两侧耳屏间连线（耳屏间线），以确定头顶点（vertex）的交点位置（图3A、B）。
    3. 从该交点出发，沿耳屏间线向左量取5 cm，再沿矢状线向前量取5 cm，确定另外两个参考点（图3C、D）。
    4. 绘制一条斜线连接外侧点与内侧前点（图3E）。
    5. 从外侧点开始，沿斜线向内前方向量取2.5 cm，标记运动热点的初步估计位置（图3F）。
    6. 围绕该初步估计点，在半径0.5 cm范围内标记4个附加测试点，用于精确定位运动热点。标出用于确定运动热点的区域（红线）（图3E、F）。
  6. 为参与者设置神经导航系统：
    1. 将弹性头带戴在参与者头部，确保标记条朝向摄像头方向，并佩戴舒适，因头带需在整个实验过程中保持固定。
    2. 使用定位指针定义参与者头部的关键解剖标志点（鼻根点、左右耳屏点及头部轮廓点），从而使系统能够根据参与者的头部解剖结构（鼻根点、耳屏点、头皮标志点和头部形状）对刺激靶点进行对齐与追踪；若使用标准MNI空间，则仅依赖上述外部标志；若使用个体化MRI扫描数据，则还可进一步结合脑部解剖结构进行精确定位。此步骤可确保TMS过程中线圈定位与个体解剖结构精确对应（更多细节请参见补充文件1，步骤3）。

3. 经颅磁刺激-肌电图生理学评估

  1. 启动用于肌电图（EMG）数据采集的 BONSAI 脚本42。在记录过程中，密切观察受试者是否存在面部肌肉收缩、肢体运动、头帽意外移位或其他可能影响其生理状态及生理数据采集的行为。
  2. 测定运动热点（Motor Hotspot）。
    1. 将经颅磁刺激（TMS）线圈以切线方向放置于受试者头皮，手柄朝后，与正中矢状线成 45° 角，线圈中心对准第 2.5 步中标记的位置——此位置将用于所有 TMS 操作。
    2. 在初始估计的运动热点位置，以最大刺激输出（MSO）的 30% 施加刺激脉冲。
    3. 以 MSO 的 5–10% 为步长逐步增加刺激强度，直至观察到稳定的运动反应。
    4. 在初始估计位置及其周围多个位置施加单脉冲刺激，确定最能稳定诱发较高振幅运动诱发电位（MEP）的位置；在可能的情况下，该位置应仅引起第一背侧骨间肌（FDI）的可见收缩——此即 FDI 的运动热点（MH）。
    5. 在神经导航系统软件中，选择确定 MH 的脉冲记录，以指导后续刺激定位。
  3. 确定静息运动阈值（rMT）。
    1. 使用神经导航系统引导线圈至第 3.2 步确定的 MH 位置——rMT 是指在此处施加 10 次单脉冲 TMS（刺激间期约 5 秒），至少有 5 次在对侧 FDI 中诱发出振幅 ≥50 µV 的 MEP 所需的最低 %MSO。
    2. 从用于定义 MH 的 %MSO 开始，以 2% 步长逐步降低刺激强度，直至在对侧 FDI 中诱发出 ≥50 µV 反应的脉冲少于 10 次中的 5 次。
    3. 再以 1% 步长逐步增加 MSO，直至在对侧 FDI 中诱发出 ≥50 µV 反应的脉冲达到 10 次中的至少 5 次。
    4. 记录 rMT 对应的 %MSO 值。
  4. 测定最大自主肌肉激活水平。
    1. 指导受试者通过将示指指甲用力抵住拇指腹，形成“环形”动作，以最大力量激活第一背侧骨间肌（FDI）。
    2. 受试者开始肌肉收缩约 2 秒后，按下运行 BONSAI 脚本的计算机空格键，记录对应时间点，以跳过初始激活上升阶段及因电极移动引起的伪迹尖峰。
    3. 重复该过程三次，每次收缩之间间隔 1 分钟休息时间，以防止疲劳并确保充分恢复。
  5. 确定活动状态下的运动阈值（aMT）。
    1. 使用神经导航系统引导线圈至第 3.2 步确定的 MH 位置——aMT 是指在轻微自主收缩状态下，此处施加 10 次单脉冲 TMS 中至少有 5 次诱发出峰-峰振幅 ≥200 µV 的 MEP 所需的最低 %MSO。
    2. 要求受试者维持 10% 至 20% 最大自主收缩力（MViC）的亚最大收缩，并使用肌电图（EMG）监测持续收缩过程，提供实时反馈（详见 补充文件 1 第 1 步）。
    3. 从 rMT 对应的 %MSO 开始，以 2% 步长逐步降低刺激强度，直至在 10 次单脉冲中诱发出 ≥200 µV MEP 的次数少于 5 次。
    4. 再以 1% 步长逐步增加 MSO，直至在 10 次单脉冲中诱发出 ≥200 µV MEP 的次数达到至少 5 次。
    5. 记录 aMT 对应的 %MSO 值。
  6. 确定基线皮层兴奋性。
    注：此阶段旨在建立受试者基线 MEP 振幅，作为后续比较的参考基准。
    1. 使用神经导航系统将线圈精确定位于第 3.2 步定义的运动热点上方。
    2. 确认表面 EMG 电极正确放置于目标肌肉（如第一背侧骨间肌），并验证信号质量（噪声最小，MEP 清晰）。
    3. 在 TMS 设备上加载单脉冲刺激方案。
    4. 输入先前定义的 rMT 并启动方案（刺激参数见第 1.6.1 步）。
    5. 通过平均 40 个 MEP 的峰-峰振幅来评估基线皮层兴奋性。
      注：峰-峰振幅定义为每个单独 MEP 波形中最小值与最大值之间的电压差。为进一步分析，可将 MEP 振幅归一化为基线值，以控制个体间差异，具体方法可参考既往文献32。
  7. 实施皮层兴奋性调节方案。
    注：此步骤涉及施加间歇性 theta 爆发刺激（iTBS）方案以调节皮层兴奋性。
    1. 在 TMS 设备上加载 iTBS 方案。
    2. 输入先前定义的 aMT 并启动方案（刺激参数见第 1.6.2 步）。
    3. 在 iTBS 方案结束后立即启动秒表，以监测刺激后时间间隔。
  8. 评估皮层兴奋性调节效果。
    1. T0，即皮层兴奋性调节方案结束后立即按照第 3.6 步所述，使用 120% rMT 重新施加单脉冲刺激方案。
    2. 通过将导航指针置于鼻根点并在神经导航系统软件中验证对齐情况，确认神经导航准确性。确保空间偏差 < 5 mm。记录该数值。
    3. T10、T20 和 T30，即在皮层兴奋性调节方案后 10、20 和 30 分钟——重复第 3.8.1 步的单脉冲刺激方案，并按第 3.8.2 步重新验证神经导航准确性。
    4. 完成最后一次刺激区块后，停止 BONSAI 脚本。在软件中结束神经导航会话。系统将根据 BONSAI 数据采集生成一个“bin.”文件。
    5. 采用与基线相同的评估方法（即平均每个时间点记录的 40 个 MEP 的峰-峰振幅），评估刺激后各时间点（T0、T10、T20 和 T30）的皮层兴奋性，从而比较调节方案后相对于基线的兴奋性变化。
    6. 皮层兴奋性调节程度的计算：通过计算 delta MEP（ΔMEP）来量化刺激方案诱导的皮层兴奋性调节程度。ΔMEP 定义为每次干预后时间点（T0、T10、T20、T30）记录的 MEP 平均振幅与基线 MEP 平均振幅之差，再除以基线 MEP 平均振幅进行归一化。该指标可用于评估 iTBS 方案诱导的皮层兴奋性变化的幅度和持续时间。
       运动诱发电位变化（ΔMEP）计算公式；神经生理学研究公式。
  9. 询问受试者是否有任何不适，并提供联系方式，以便其在会话结束后如有需要或疑问时能够联系研究人员。

结果

本方案旨在提供一种可靠且可重复的皮质脊髓兴奋性评估方法，同时确保其在不同的肌电图（EMG）系统和经颅磁刺激（TMS）设置之间具有广泛的适用性。我们采用了传统的阈值搜索程序，因其在不同研究中已被广泛验证，具有良好的可重复性和可比性；同时我们也承认其他方法同样成熟可靠（例如基于序贯测试参数估计的阈值搜索方法）43,44。采集总共40次单脉冲TMS刺激，可确保记录到足够数量的运动诱发电位（MEP），从而实现对MEP幅值的可靠估计，即使部分脉冲未能引发反应亦可满足分析需求20。脉冲之间的间隔被随机化，且最短间隔不少于6秒，以避免先前刺激带来的残留效应21，并使脉冲序列不可预测，从而减少受试者肌肉的预期性预激活。采用120%静息运动阈值（rMT）的单脉冲TMS刺激强度，是已被广泛确立的标准参数，可在各受试者中稳定诱发可测量的MEP，并一致地反映由间歇性theta脉冲刺激（iTBS）诱导的可塑性变化。离线EMG处理，包括滤波、伪迹去除以及背景肌电活动的监测，可确保所测得的MEP真实反映皮质脊髓兴奋性，而非噪声干扰，且不受肌肉预激活的影响（详见补充文件1第4步）。尽管使用本方案可采集超过30分钟的iTBS后MEP数据，但我们选择在iTBS后T30时间点结束数据采集，这与现有证据一致，即该方案所诱发的类似长时程增强（LTP）的可塑性变化主要发生在此时间窗内32。总体而言，本方案强调可重复性、可靠性以及概念上的普适性，不依赖于特定设备或软件。

所有参与经颅磁刺激（TMS）操作的人员均应接受机构安全规程培训，以确保受试者的安全与健康。在操作过程中，若受试者报告轻微症状（如头晕），应暂停操作，为其提供饮用水，必要时让其平卧并抬高下肢。视情况联系护士或医生。头痛可能在操作期间或操作后不久出现。应告知受试者此类情况属预期反应，必要时可服用常见的非处方止痛药。若头痛持续，应联系研究团队。在极少数发生癫痫发作的情况下，必须立即停止操作，并根据机构规程启动应急处理程序。

采用此处所述的结构化和标准化方案，收集了47名健康志愿者的数据。该方法旨在提高皮质兴奋性评估的可靠性，实际结果也确实显示，在相隔6周的两次评估中，结果具有一致性37。在首次评估时，通过iTBS后运动诱发电位（MEP）振幅变化（ΔMEP）评估发现，左侧运动皮质兴奋性在T0、T10和T20时间点均出现显著调制，而T30时间点的效应未达到统计学显著性（T0：W = 259，p < 0.01，r = 0.42；T10：W = 320，p < 0.01，r = 0.51；T20：W = 291，p < 0.01，r = 0.46；T30：W = 190，p = 0.06，r = 0.32）；而在6周后的第二次评估中，所有时间点均观察到显著效应（T0：W = 293，p < 0.01，r = 0.48；T10：W = 278，p < 0.01，r = 0.46；T20：W = 315，p < 0.01，r = 0.52；T30：W = 275，p < 0.01，r = 0.45），表明兴奋性调制在时间上具有稳健性（图4A）。T0时间点兴奋性调制的稳定性进一步得到组内相关系数（ICC）的支持（ICC = 0.67，95% CI = 0.31–0.85；p < 0.01），显示iTBS后早期具有中等到良好的重测信度（图4B）。然而，T10、T20和T30时间点的皮质兴奋性时间可靠性未被观察到，提示该方案在评估后期类可塑性现象时存在局限性。此外，关键的神经生理学参数，包括静息运动阈值（aMT）、活动运动阈值（rMT）和基线MEP振幅，在整个研究期间保持稳定，进一步强调了该方案的内部一致性和操作可靠性。最后，系统评估了潜在混杂因素的影响，包括利手性、状态焦虑、对经颅磁刺激（TMS）效应的预期、性别和年龄。未发现这些变量与皮质兴奋性调制之间存在显著关联，支持了所观察效应的稳健性以及该方案在不同个体特征间的普适性，相关结果见Seybert等人的研究37。

经颅磁刺激工作流程图；皮层兴奋性调节过程说明。
图1：左侧M1区兴奋性及其调节评估——实验方案概述。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示骨骼测量过程的手部解剖图，标注了骨骼及2.5 cm的距离。
图2：第一背侧骨间肌（FDI）表面肌电图记录的电极放置位置。 （a）示指；（b）肌腱区域；（c）FDI肌腹；（d）拇指。将主动电极置于FDI肌腹处，第二个电极置于距肌腹远端约2.5 cm处，靠近肌腱。参考电极应置于对侧肘部。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示 EEG 电极放置位置的示意图，标明头皮上的特定测量点和位置。
图3：帽状标记操作流程。（A，B）确定解剖学参考线：正中矢状线和双耳屏线，并确定头顶点；（C，D）从头顶点开始，沿双耳屏线向侧方测量  cm 标记一个参考点（左侧），并沿矢状线向前方测量 5 cm 标记另一个参考点；（E）连接侧方点与前方点构建一条对角线。沿该对角线，从侧方点向内前方向 2.5 cm 处标记一点，作为运动热点的初步估计位置。 通过在初步估计点周围 0.5 cm 半径范围内再标记四个附加点，进一步优化热点定位，形成用于运动阈值测定的刺激位点簇；（F）确定运动热点并在帽状装置上进行相应标记（红线）。请点击此处查看该图的放大版本。

MEP 散点图；中位数值，基线与随访会话的比较，MEP 变化百分比（ΔMEP），统计分析。
图 4：研究的代表性结果。（A）iTBS 后左侧运动皮层兴奋性的调节，通过基线期和随访期 T0、T10 和 T20 时 MEP 振幅（ΔMEP）的变化反映；（B）T0 时的重测信度以组内相关系数（ICC）表示，为 0.67（95% CI：0.31–0.85；p < 0.01），表明兴奋性调节具中等至良好的一致性。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件1：实验方案的附加细节。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了一种全面且结构严谨的实验方案，用于评估初级运动皮层（M1）的皮层兴奋性及其通过经颅磁刺激（TMS）联合肌电图（EMG）进行的兴奋性调节。该方案详细描述了实验过程中所有必要的操作步骤，包括实验设备的准备与神经导航系统的校准、TMS和EMG设备的参数设置，以及用于确定运动热点（MH）、静息运动阈值（rMT）和活动运动阈值（aMT）的标准化操作流程。这些前期准备步骤为后续实验序列奠定了基础，后续步骤包括皮层兴奋性的基线评估、通过间歇性短阵爆发刺激（iTBS）进行神经调控，以及再次评估皮层兴奋性以量化所产生的调节效应。

该方法的一个关键优势在于其高度的标准化和严谨性，能够解决以往研究中存在的诸多局限性。该领域的前期工作常常存在方法学不一致、方法描述不充分以及受试者内部和个体间变异性较高的问题35。方法学上的差异包括采集的运动诱发电位（MEPs）数量20、刺激间间隔（IPI）21以及肌电图（EMG）滤波方法，这些因素可能影响研究结果的可重复性34。本研究所描述的方案通过采用神经导航技术以确保线圈定位的精确性39、使用经过验证的EMG操作流程34，以及遵循既定的刺激和信号采集最佳实践45，从而避免了上述方法学上的缺陷。尽管尚未量化每一项具体操作的独立贡献，但综合应用这些要素使得观察到的效应在稳定性与可靠性方面较以往研究有所提升25,26,27,28,29,30。

尽管方法学的严谨性和标准化是获得可靠测量结果的基础，但受试者准备和实验会话管理的实际操作是影响所获取数据质量的最重要实验步骤之一。正确清洁电极放置部位的皮肤、确保电极紧密且牢固地贴附，以及确认神经导航头带佩戴舒适且稳固，对于最大限度减少不同会话之间的变异性至关重要。在整个实验过程中，必须持续监测受试者的状态，包括警觉性、手部运动以及电极的稳定性，以防止伪迹产生并维持高质量的记录。当出现经颅磁刺激-肌电图（TMS-EMG）数据采集问题时，应及时调整线圈位置或刺激参数。定期检查肌电图（EMG）信号质量对于解决常见的技术问题至关重要，例如信号丢失、电极脱落或轻微的导航偏移。轻微调整线圈位置、确保电极接触稳定或重新校准神经导航系统，通常可恢复信号质量并保持一致性。还须认识到，尽管已采取最佳措施，某些信号波动或与受试者相关的变异性仍可能无法避免。在此类情况下，为避免损害数据完整性，更合适的做法可能是暂停实验、重复关键测量，甚至重新安排实验时间，以确保获得可靠且可解释的结果。

采用本方案获得的结果显示，在施加iTBS后，左侧M1区的皮质兴奋性发生了显著调制。这种调制在6周后仍然明显，但兴奋性调制的测量值仅在iTBS后立即进行评估时显示出个体内稳定性，提示存在一个时间特异性的稳定窗口。值得注意的是，兴奋性效应在后续时间点并未持续保持，这一局限性可能源于随时间推移而增加的变异性25,27。该观察结果进一步强调了皮质兴奋性测量时机的重要性，尤其是在考虑其作为诊断或预测性生物标志物的潜在作用时。事实上，尽管长期以来人们一直关注将运动皮质兴奋性及皮质兴奋性调制（ΔMEP）用作临床指标，但其应用受到较差的可靠性和高变异性的限制。虽然一些研究报道了中等程度的可重复性，但更多研究发现ΔMEP缺乏临床应用所必需的稳定性18,19。当前方案通过提供一种可复制的框架，以一致的方式测量兴奋性，直接应对了这一问题。稳健的TMS-EMG方法还可为健康与疾病状态下的潜在神经生物学机制提供有价值的见解，有助于可靠地评估人运动皮质中类神经可塑性现象。具体而言，iTBS被认为可激活类长时程增强（Long-Term Potentiation-like）过程，诱导NMDA受体依赖性的突触效能增强，调制抑制性中间神经元，并促进皮质去抑制，从而共同增强刺激后MEP 的振幅24。这一解释与动物模型的研究证据一致。在啮齿类动物和非人灵长类动物中，TBS已被证明可诱导皮质脊髓兴奋性和突触强度的持久增强，表明跨物种存在同源的类可塑性机制12。因此，人类在接受iTBS后观察到的MEP变化很可能反映了具有较强转化基础的与可塑性相关的神经过程。

除了评估iTBS等神经调节方案外，本文详述的标准化TMS-EMG方法在多种应用中也具有广阔前景。在运动学习范式中，皮质脊髓兴奋性的变化可作为技能习得和神经可塑性的生物标志物。例如，已有研究表明，视觉运动学习能够增强皮质脊髓兴奋性，反映出潜在的神经适应机制46。在脑卒中康复领域，对皮质脊髓兴奋性的评估可为治疗策略提供依据，其中TMS神经反馈可用于上调受损运动皮层的兴奋性，从而可能促进功能恢复47。在药理学方面，TMS-EMG评估能够检测药物诱导的皮层兴奋性变化，有助于揭示其对中枢神经系统的作用48。此外，已有文献记录了皮质脊髓兴奋性随年龄变化的差异，老年人通常表现出兴奋性降低，这可能影响其运动表现和学习能力49。通过将该标准化方案拓展至上述领域，研究人员可在不同情境和人群中更全面地理解皮质脊髓系统的动态特性。

因此，我们认为该方案为未来建立皮质可塑性可靠生物标志物的研究提供了重要的基础。特别是，后续研究应在更大且更具多样性的群体中（包括临床群体）重复验证这些效应。未来的研究应评估在iTBS结束后立即测量的皮质兴奋性是否能够稳定地区分健康个体与临床个体的特征，以明确其诊断敏感性以及预后价值，例如在治疗反应预测中的应用。总之，本文所述方法在皮质兴奋性评估的标准化方面代表了重要进展。通过减少常见的变异来源，并强调实验设计的精确性，该方案为研究类似皮质可塑性的现象及其潜在的临床应用提供了可靠且可重复的方法。

披露

AJO-M 收到了 Schuhfried GmBH 提供的资助，用于认知测验的常模制定与验证工作，并曾担任 Compass Pathways, Ltd 赞助的难治性抑郁症裸盖菇素治疗试验（EudraCT 编号：2017-003288-36 和 2020-001348-25）在葡萄牙的国家协调员，以及 Janssen-Cilag, Ltd 赞助的难治性抑郁症艾司氯胺酮治疗试验（EudraCT 编号：2019-002992-33）的国家协调员；曾因参加会议及参与顾问委员会而收到来自 MSD、Neurolite AG、Janssen Pharmaceuticals、Angelini Pharma 和欧洲毒品与毒瘾监测中心的酬金、演讲费或资助；曾从 Bioprojet Pharma 和 NaturalX Health Ventures 获得咨询费（以上均与本提交的研究无关）；现任葡萄牙精神病学与精神健康学会副主席；担任葡萄牙医学会及葡萄牙卫生部国家医师考试委员会精神病学工作组负责人；担任公共成瘾行为与依赖研究所伦理委员会主席；同时担任葡萄牙强迫症基金会科学委员会主席。其余作者声明，他们不存在与本研究相关的潜在利益冲突，包括本研究之外的相关财务活动，以及读者可能认为已对本文内容产生影响或可能影响本文内容的其他关系或活动。上述任何机构均未参与本研究的设计与实施、数据的收集、管理、分析与解释，未参与稿件的撰写、审阅或批准，也未参与决定是否提交该稿件。

致谢

作者衷心感谢Champalimaud基金会科学硬件与软件开发平台为本工作提供的资源和技术支持。 DRS（2023.05754.BD）和 FFV（2024.00723.BD）由葡萄牙科学技术基金会的博士奖学金资助。GC 获得脑与行为研究基金会 2023 年 NARSAD 青年研究者奖的支持。 & 行为研究基金会。AJO-M 的研究得到了欧洲研究理事会启动资助（资助协议号：950357）以及 PsyPal 项目（资助协议号：875358）的支持，两项资助均来自欧盟“地平线2020”研究与创新计划。GC 和 AJO-M 还获得了欧洲研究理事会概念验证资助（资助协议号：101158262）的支持。本研究内容的责任完全由作者承担，不代表任何资助机构的官方观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于生理数据采集的 BONSAI 软件（"MT_ACQ.bonsai" 脚本）Bonsaihttps://bonsai-rx.org/
由 Champalimaud 基金会科学硬件开发平台开发的肌电图（EMG）系统 Champalimaud Researchhttps://www.cf-hw.org/home科学硬件与软件开发平台网站：https://www.cf-hw.org/home
配备 Cool-B65 八字形线圈的 MagPro X100 刺激器Magventure刺激器：9016E0731；  线圈：9016E0491
Visor2 神经导航系统ANT Neuro来自同一家公司的软件与硬件

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肌电图记录运动诱发电位静息运动阈值活动运动阈值θ爆发刺激神经导航系统第一背侧骨间肌皮层兴奋性调节
评估初级运动皮层兴奋性及通过经颅磁刺激与肌电图联合检测兴奋性调节
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