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方法文章

大鼠巨噬细胞体外吞噬同种异体与异种红细胞的定量评估 In Vitro

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DOI：

10.3791/68904

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2025年8月22日

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1Institute of Regenerative Medicine, and Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Jiangsu University, 2Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Large Animal Models for Biomedicine, and South China Institute of Large Animal Models for Biomedicine, School of Pharmacy and Food Engineering, Wuyi University, 4State Key Laboratory of Cell Biology, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 5Innovation and Transformation Center, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 6Prometheus RegMed Tech Ltd, 7Department of Medicinal and Life Sciences, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究描述了一种标准化的 体外 定量与比较分离大鼠巨噬细胞对异种（人源）和同种异体（大鼠）红细胞吞噬率的实验方案

摘要

异种细胞移植常面临显著的免疫排斥反应，即使在免疫缺陷动物模型中亦是如此。在残存的免疫成分中，巨噬细胞可主动吞噬移植的人源细胞，从而对长期植入造成挑战。为此，我们建立了一种标准化的 体外 定量检测巨噬细胞介导的人源与大鼠红细胞（RBCs）吞噬作用的实验方法。分离并培养大鼠腹腔巨噬细胞，随后将其暴露于人源或大鼠RBCs中。人RBCs通过CD235a进行识别，大鼠RBCs则预先用DeepRed标记。采用流式细胞术分析，以CD163识别巨噬细胞，并通过碘化丙啶（PI）排除法圈选活细胞。结果显示吞噬活性存在显著差异：5.08%的巨噬细胞吞噬了人RBCs，而仅1.59%的巨噬细胞吞噬了大鼠RBCs，相对吞噬指数为3.21。该实验方案可实现对免疫相容性的定量评估，为异种移植中固有免疫应答的可重复评价提供方法，有望用于优化供体-受体配型及指导转化研究中的免疫抑制策略。 关键词：吞噬作用，巨噬细胞，红细胞，异种移植，免疫相容性，流式细胞术，CD235a，CD163，PI，DeepRed

引言

异种细胞移植技术，特别是将人类细胞移植到动物模型中的方法，在生物医学研究中是一项至关重要的策略1。该技术能够在受控的体内环境中评估细胞存活、植入情况以及免疫应答。尽管小鼠模型由于其遗传背景明确且易于操作，长期以来在该领域占据主导地位，但其体型较小，限制了需要大量血液或高细胞产量的研究。相比之下，大鼠具有多项优势，包括更大的体重、更高的生理相关性以及更高的生物样本产量（如血液或腹腔巨噬细胞）2。因此，大鼠模型在造血系统和免疫系统研究中的应用日益广泛3。

异种移植面临的主要挑战之一是免疫排斥反应。即使在T细胞、B细胞或NK细胞被基因敲除的免疫缺陷模型中，残存的固有免疫细胞（尤其是巨噬细胞）仍具有功能活性4。巨噬细胞作为宿主免疫系统的第一道防线，能够通过吞噬作用识别并清除外来细胞5。该过程部分由巨噬细胞表面的信号调节蛋白α（SIRPα）与大多数细胞类型表达的“别吃我”信号分子CD47之间的相互作用所调控。当人源CD47无法被啮齿类动物的SIRPα识别时，这种不匹配可能导致吞噬作用增强。即使在这些允许性免疫缺陷动物模型中，该现象依然存在6,7。

在此背景下，定量评估巨噬细胞介导的吞噬作用对于评价细胞存活的可能性以及优化移植策略至关重要8。尽管已开发出多种用于评估免疫排斥反应的体内和离体方法，但针对巨噬细胞吞噬作用的标准化体外检测方法仍然有限。传统的基于显微镜的方法通常耗时耗力，且缺乏定量的严谨性。相比之下，流式细胞术提供了一种基于单细胞的定量分析平台，能够通过表面标志物检测准确区分细胞类型并测量吞噬摄取情况。

在本文中，我们建立了一种标准化的 体外 评估大鼠腹腔巨噬细胞对人和大鼠红细胞差异性吞噬作用的实验方法。由于红细胞结构简单且表达CD47（一种作为“自我”信号以抑制巨噬细胞介导清除的分子），因此是吞噬作用检测的理想模型9在此方案中，采集大鼠腹腔巨噬细胞 通过 腹腔灌洗，培养 体外，并与标记了DeepRed的人源红细胞或同种异体大鼠红细胞共同孵育。共孵育后，采用流式细胞术评估巨噬细胞对红细胞的内吞作用。通过CD163表达鉴定巨噬细胞，人源红细胞通过CD235a鉴定，大鼠红细胞通过DeepRed荧光鉴定。死细胞被排除在分析之外。 通过 PI染色，确保仅分析有活力的巨噬细胞。

该方法能够对同种异体和异种红细胞的吞噬活性进行准确的定量评估，从而深入了解巨噬细胞介导的免疫清除程度。体外实验结果显示，大鼠巨噬细胞对人红细胞的吞噬率（5.08%）显著高于对大鼠自身红细胞的吞噬率（1.59%），相对吞噬指数为3.21。这些结果凸显了先天免疫机制在异种环境中的重要性，并表明该检测方法在临床前模型验证中的重要价值。

总之，本文所述方案提供了一种可重复且高效的巨噬细胞吞噬作用检测方法 体外该方法对于从事异种移植、造血干细胞研究以及免疫相容性检测领域的研究人员尤为有用。通过提供一种标准化的吞噬作用定量分析框架，该检测方法有助于提高实验的可重复性，并加深对跨物种移植模型中先天免疫应答机制的理解。

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方案

所有涉及动物的实验均按照江苏大学机构动物护理和使用委员会（UJS-IACUC）批准的伦理政策和程序进行（批准号：UJS-IACUC-2021090102）。本研究已获得江苏大学附属医院机构审查委员会的批准。所有样本均来自已签署知情同意书的患者。移除的上清液应置于专用废液罐中，并移交至医院感染科处理。

1. 巨噬细胞分离

  1. 准备：准备必要的材料，包括实验大鼠、麻醉容器、烧杯和作为麻醉剂的异氟烷，并将离心机预冷至 4 °C。
  2. 麻醉与处死 大鼠：根据机构动物护理指南，在实验过程中使用吸入式异氟烷对动物进行麻醉，实验结束后用 CO2 进行处死。
  3. 酒精消毒与切口：用乙醇对大鼠腹部进行消毒，并在腹壁上做一个小切口。
  4. 腹腔液的注射与混匀：使用注射器沿中线向腹腔内注入 50 mL 冰冷的无菌 PBS。轻轻摇动大鼠，并用手指按摩腹壁，以确保液体在腹腔内充分混合，按摩持续 2–3 分钟。
  5. 腹腔液的收集：将大鼠身体略微倾斜，用注射器吸取腹腔液。
  6. 离心：将收集的液体在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  7. 红细胞裂解：加入 3–5 倍于细胞沉淀体积的红细胞裂解缓冲液，轻轻混匀 1–2 分钟。
    注意：例如，若细胞沉淀体积为 1 mL，则加入 3–5 mL 裂解缓冲液。此步骤可在室温或 4 °C 下进行，随后在 400–500 × g 条件下离心 5 分钟。在 4 °C 下离心效果更佳。由于渗透压作用，红细胞将发生裂解，溶液变为红色。离心后，去除红色上清液。
    1. 红细胞（RBC）裂解缓冲液配方：将 8.3 g NH4Cl、1.0 g KHCO3 和 1.8 mL 5% EDTA 溶于 800 mL 蒸馏 H2O 中，经 0.2 µm 滤膜过滤除菌，用蒸馏 H2O 定容至 1000 mL，调节 pH 至 7.2~7.4。如果仍可见红色沉淀，重复此步骤直至溶液澄清透明。通常，少量残留的红细胞不会影响后续检测（若沉淀中红细胞较少，此步骤可省略）。
  8. 细胞洗涤：用约 10 mL 预冷的 RPMI 1640 培养基将细胞洗涤两次，每次在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  9. 细胞重悬与计数：将细胞重悬于预冷的 RPMI 1640 + 1% FBS + 1% PS 培养基中，使用台盼蓝染色法进行细胞计数，并评估细胞活力。
  10. 细胞培养：如需培养，将细胞以 1 × 106/mL 的密度接种于 24 孔板中，每孔加入 1 mL RPMI 1640-10% FBS-1% PS 培养基。孵育 2 小时后更换培养基，并用 RPMI 1640 培养基洗涤 1–2 次以去除非贴壁细胞。
    注意：贴壁细胞将形成单层巨噬细胞。如需提取 RNA，向细胞沉淀中加入 1 mL Trizol，反复吹打以裂解细胞，将混合液转移至 1.5 mL 微量离心管中，立即进行 RNA 提取或于 -80 °C 保存。如进行流式细胞术（FACS）分析，将每管细胞数量调整至 1 × 106，加入 20 µL FACS 缓冲液，随后进行 FACS 染色。FACS 缓冲液配方：DPBS + 2% FBS，经 0.22 µm 滤膜过滤除菌，4 °C 保存。

2. 大鼠或人红细胞的采集

  1. 准备：用肝素预冲洗15 mL离心管和10 mL注射器。
  2. 从大鼠尾静脉采集血液：麻醉大鼠后，用剪刀小心剪去大鼠尾部一小段，从尾静脉采集血液。实验结束时，用CO2处死大鼠。
  3. 采集人血：采用静脉穿刺技术采集人血。
  4. 血液样本混合：将1 mL PBS与1 mL人静脉血或大鼠血混合。
  5. Ficoll密度梯度分离：对于人外周血，向15 mL离心管中加入1.5 mL密度为1.077的Ficoll溶液；对于大鼠血，向15 mL离心管中加入1.5 mL密度为1.084的Ficoll溶液。
  6. 血液样本分层：沿离心管壁缓慢将稀释后的血液样本分层加至相应的密度梯度溶液上。
  7. 离心：在18–20 °C条件下，以400 × g离心30分钟。
  8. 去除血浆和淋巴细胞层：移除上层血浆层、淋巴细胞层及Ficoll溶液层，仅保留底部红细胞层。
  9. 红细胞洗涤：用10 mL PBS洗涤红细胞一次。
  10. 离心并弃去上清液：以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
  11. 细胞重悬与计数：向1.5 mL微量离心管中加入1 mL RPMI 1640培养基，加入适量红细胞沉淀并混匀，进行细胞计数。

3. 体外 吞噬作用检测

  1. 巨噬细胞的分离与培养：分离巨噬细胞，并以每孔 1 × 106 个细胞的密度接种于12孔培养板中。于37 °C、5% CO2条件下孵育2小时，使细胞充分贴壁。
  2. 去除未贴壁细胞：孵育2小时后，小心移除未贴壁的细胞，并用RPMI 1640培养基轻轻洗涤。
  3. 继续培养：继续培养贴壁巨噬细胞最多2小时，以确保其完全贴附于培养板底部。
  4. 饥饿处理：2小时后，更换为无血清RPMI 1640培养基，在饥饿条件下孵育2小时，以增强巨噬细胞的吞噬活性。
  5. 加入人源细胞：将预先用DeepRed染色的人源细胞加入培养板中，于37 °C、5% CO2条件下孵育2小时，使巨噬细胞吞噬人源细胞。
  6. 实验结束与分析：吞噬实验结束后，可在显微镜下观察吞噬活性，或通过流式细胞术（FACS）进行定量分析。

4. 流式细胞术

  1. 细胞准备：用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞，并使用含 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 培养基终止消化。离心收集细胞，弃去上清液，用 FACS 缓冲液重悬细胞并计数。每管准备 1 × 106 个细胞，共两管。此外，准备一管人红细胞（RBCs）和一管大鼠红细胞（RBCs）。
  2. 单染管准备：向其中一管样本中加入小鼠抗大鼠 CD163 抗体，向人红细胞管中加入小鼠抗人 CD235a 抗体，向大鼠红细胞管中加入 DeepRed。
    1. 将这些管置于冰上避光孵育 30 分钟，每 10 分钟混匀一次。每管加入 1 mL FACS 缓冲液以洗去未结合的抗体，离心后弃去上清液。用 500 µL FACS 缓冲液重悬细胞。
  3. 样本准备：向样本管中加入小鼠抗大鼠 CD163 抗体、小鼠抗人 CD235a 抗体以及 DeepRed。冰上避光孵育 30 分钟，每 10 分钟混匀一次。每管加入 1 mL FACS 缓冲液以洗去未结合的抗体，离心后弃去上清液。用 500 µL FACS 缓冲液重悬细胞。
  4. 分析：通过在 FSC-H 与 FSC-A 图中设门排除细胞黏连。在分析样本前，使用单染管调整合适的电压和补偿设置（图 1）。使用 FlowJo v10.8.1 软件分析数据。
    注意：使用 CD163-FITC 和 PI 单染对照设置补偿。

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结果

通过流式细胞术分析，我们可以推断大鼠巨噬细胞对人红细胞和大鼠红细胞的吞噬率。首先使用PI排除死细胞。CD163阳性且表达CD235a阳性的巨噬细胞表明其吞噬了人红细胞。吞噬了人红细胞的巨噬细胞所占比例即定义为大鼠巨噬细胞对人红细胞的吞噬率。大鼠红细胞的吞噬比例以类似方法计算。CD235a与Deep Red双阳性细胞代表同时吞噬了大鼠和人红细胞的巨噬细胞。通过比较这两个数据点，可评估大鼠巨噬细胞对人红细胞的吞噬能力（图2）。

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讨论

本研究建立了一种稳健且可重复的 体外 评估巨噬细胞介导的异种及同种红细胞吞噬作用的检测方法。在本研究中，人红细胞用CD235a-BV421标记，大鼠红细胞则用DeepRed染料染色。当巨噬细胞吞噬标记的红细胞时，偶联的抗体（CD235a-BV421）或染料（DeepRed）随之被内化，导致巨噬细胞自身呈现相应的荧光信号。在此条件下，可通过流式细胞术将吞噬了红细胞的巨噬细胞识别为双阳性群体（例如，CD163）+CD235a+ 或 CD163+DeepRed+），从而实现对吞噬活性的直接和定量评估。最初，我们尝试通过将巨噬细胞与异种红细胞（RBCs）共培养来直接评估吞噬率。然而，该方法导致显著的批次间变异，结果不一致，限制了数据的可靠性和可比性。为解决这一问题，我们引入同种异体红细胞作为内部参照，计算相对吞噬比率，即异种红细胞的吞噬率相对于同种异体红细胞吞噬率的归一化值。这种比率化方法有效消除了由实验变异引起的非特异性背景干扰，显著提高了不同批次间数据的一致性和可重复性。此外，采用基于摇床的动态培养系统，以更真实地模拟 体内

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披露

JYG 是 Prometheus RegMed Tech Ltd. 的科学顾问。其余作者声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

感谢梅芳女士、马敏女士、孟雨桐女士和雷泉凯先生在项目初期所做出的贡献。本研究部分得到了中国国家自然科学基金（82270697）、中国广东省科学技术计划项目（2021B1212040016）、广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515012574）、江苏省医学重点学科培育单位（JSDW202229）、海河细胞生态系统实验室创新基金（HH24KYZX0008）以及中国青年创业就业基金会—医脉通公益基金（HH25KYHX0003）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTAThermoFisher25300062
深红色细胞示踪剂ThermoFisher C34565将粉末（15 μg）溶于DMSO（20 μL）中
二甲基亚砜（DMSO）SigmaD2650
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）ThermoFisherC10010500BT
Ficoll-Paque PLUSCytiva17144002
Ficoll-Paque PREMIUMCytiva17544602
小鼠抗人CD235a BV421抗体BD Biosciences562938
小鼠抗大鼠CD163 FITC抗体BIO-RADMCA342F
蛋白酶KSigmaP2308
RPMI 1640ThermoFisher11875093

参考文献

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吞噬作用检测异基因红细胞流式细胞术红细胞CD163标志物CD235a抗体免疫排斥体外吞噬作用
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