大鼠巨噬细胞体外吞噬同种异体与异种红细胞的定量评估 In Vitro

摘要

本研究描述了一种标准化的 体外 定量与比较分离大鼠巨噬细胞对异种（人源）和同种异体（大鼠）红细胞吞噬率的实验方案

摘要

异种细胞移植常面临显著的免疫排斥反应，即使在免疫缺陷动物模型中亦是如此。在残存的免疫成分中，巨噬细胞可主动吞噬移植的人源细胞，从而对长期植入造成挑战。为此，我们建立了一种标准化的 体外 定量检测巨噬细胞介导的人源与大鼠红细胞（RBCs）吞噬作用的实验方法。分离并培养大鼠腹腔巨噬细胞，随后将其暴露于人源或大鼠RBCs中。人RBCs通过CD235a进行识别，大鼠RBCs则预先用DeepRed标记。采用流式细胞术分析，以CD163识别巨噬细胞，并通过碘化丙啶（PI）排除法圈选活细胞。结果显示吞噬活性存在显著差异：5.08%的巨噬细胞吞噬了人RBCs，而仅1.59%的巨噬细胞吞噬了大鼠RBCs，相对吞噬指数为3.21。该实验方案可实现对免疫相容性的定量评估，为异种移植中固有免疫应答的可重复评价提供方法，有望用于优化供体-受体配型及指导转化研究中的免疫抑制策略。 关键词：吞噬作用，巨噬细胞，红细胞，异种移植，免疫相容性，流式细胞术，CD235a，CD163，PI，DeepRed

引言

异种细胞移植技术，特别是将人类细胞移植到动物模型中的方法，在生物医学研究中是一项至关重要的策略¹。该技术能够在受控的体内环境中评估细胞存活、植入情况以及免疫应答。尽管小鼠模型由于其遗传背景明确且易于操作，长期以来在该领域占据主导地位，但其体型较小，限制了需要大量血液或高细胞产量的研究。相比之下，大鼠具有多项优势，包括更大的体重、更高的生理相关性以及更高的生物样本产量（如血液或腹腔巨噬细胞）²。因此，大鼠模型在造血系统和免疫系统研究中的应用日益广泛³。

异种移植面临的主要挑战之一是免疫排斥反应。即使在T细胞、B细胞或NK细胞被基因敲除的免疫缺陷模型中，残存的固有免疫细胞（尤其是巨噬细胞）仍具有功能活性⁴。巨噬细胞作为宿主免疫系统的第一道防线，能够通过吞噬作用识别并清除外来细胞⁵。该过程部分由巨噬细胞表面的信号调节蛋白α（SIRPα）与大多数细胞类型表达的“别吃我”信号分子CD47之间的相互作用所调控。当人源CD47无法被啮齿类动物的SIRPα识别时，这种不匹配可能导致吞噬作用增强。即使在这些允许性免疫缺陷动物模型中，该现象依然存在^6,

方案

所有涉及动物的实验均按照江苏大学机构动物护理和使用委员会（UJS-IACUC）批准的伦理政策和程序进行（批准号：UJS-IACUC-2021090102）。本研究已获得江苏大学附属医院机构审查委员会的批准。所有样本均来自已签署知情同意书的患者。移除的上清液应置于专用废液罐中，并移交至医院感染科处理。

1. 巨噬细胞分离

1. 准备：准备必要的材料，包括实验大鼠、麻醉容器、烧杯和作为麻醉剂的异氟烷，并将离心机预冷至 4 °C。
2. 麻醉与处死 大鼠：根据机构动物护理指南，在实验过程中使用吸入式异氟烷对动物进行麻醉，实验结束后用 CO₂ 进行处死。
3. 酒精消毒与切口：用乙醇对大鼠腹部进行消毒，并在腹壁上做一个小切口。
4. 腹腔液的注射与混匀：使用注射器沿中线向腹腔内注入 50 mL 冰冷的无菌 PBS。轻轻摇动大鼠，并用手指按摩腹壁，以确保液体在腹腔内充分混合，按摩持续 2–3 分钟。
5. 腹腔液的收集：将大鼠身体略微倾斜，用注射器吸取腹腔液。
6. 离心：将收集的液体在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
7. 红细胞裂解：加入 3–5 倍于细胞沉淀体积的红细胞裂解缓冲液，轻轻混匀 1–2 分钟。
   注意：例如，若细胞沉淀体积为 1 mL，则加....

结果

通过流式细胞术分析，我们可以推断大鼠巨噬细胞对人红细胞和大鼠红细胞的吞噬率。首先使用PI排除死细胞。CD163阳性且表达CD235a阳性的巨噬细胞表明其吞噬了人红细胞。吞噬了人红细胞的巨噬细胞所占比例即定义为大鼠巨噬细胞对人红细胞的吞噬率。大鼠红细胞的吞噬比例以类似方法计算。CD235a与Deep Red双阳性细胞代表同时吞噬了大鼠和人红细胞的巨噬细胞。通过比较这两个数据点，可评估大鼠巨噬细胞对人红细胞的吞噬能力（图2）。

讨论

本研究建立了一种稳健且可重复的 体外 评估巨噬细胞介导的异种及同种红细胞吞噬作用的检测方法。在本研究中，人红细胞用CD235a-BV421标记，大鼠红细胞则用DeepRed染料染色。当巨噬细胞吞噬标记的红细胞时，偶联的抗体（CD235a-BV421）或染料（DeepRed）随之被内化，导致巨噬细胞自身呈现相应的荧光信号。在此条件下，可通过流式细胞术将吞噬了红细胞的巨噬细胞识别为双阳性群体（例如，CD163）⁺CD235a⁺ 或 CD163⁺DeepRed⁺），从而实现对吞噬活性的直接和定量评估。最初，我们尝试通过将巨噬细胞与异种红细胞（RBCs）共培养来直接评估吞噬率。然而，该方法导致显著的批次间变异，结果不一致，限制了数据的可靠性和可比性。为解决这一问题，我们引入同种异体红细胞作为内部参照，计算相对吞噬比率，即异种红细胞的吞噬率相对于同种异体红细胞吞噬率的归一化值。这种比率化方法有效消除了由实验变异引起的非特异性背景干扰，显著提高了不同批次间数据的一致性和可重复性。此外，采用基于摇床的动态培养系统，以更真实地模拟 体内

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	ThermoFisher	25300062
深红色细胞示踪剂	ThermoFisher	C34565	将粉末（15 μg）溶于DMSO（20 μL）中
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D2650
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	ThermoFisher	C10010500BT
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva	17144002
Ficoll-Paque PREMIUM	Cytiva	17544602
小鼠抗人CD235a BV421抗体	BD Biosciences	562938
小鼠抗大鼠CD163 FITC抗体	BIO-RAD	MCA342F
蛋白酶K	Sigma	P2308
RPMI 1640	ThermoFisher	11875093