小鼠动脉止血的简便有效操作步骤

摘要

本研究旨在开发一种在小鼠动脉中实现止血的有效方法。

摘要

在小鼠动脉穿刺或插管过程中，由于拔针后难以实现止血，通常需要对动脉进行永久性结扎。这会导致供血组织区域发生永久性缺血性损伤。此类局部缺血常引发继发性并发症，影响动物模型的实验结果。本方法旨在手术后封闭穿刺部位的同时维持正常的血流，从而预防术后缺血。该方法包括从小鼠自身获取脂肪组织碎片，采用标准技术进行动脉穿刺，随后用脂肪垫包裹穿刺部位以实现止血并保持血流通畅。在本研究中，对小鼠双侧颈总动脉进行穿刺，随后采用脂肪包裹技术实现止血。激光散斑对比成像（LSCI）显示，假手术组与手术组小鼠的脑血流变化无差异，且手术组术前与术后脑血流测量值之间亦无显著变化。术后7天、14天和28天的组织学评估结果显示：（1）脑组织结构保持完整（H&E染色），（2）神经元形态完整，无退行性改变（尼氏染色），（3）脑切片中未见病理性改变。该动脉止血技术利用了脂肪组织的可塑性及生理凝血机制。操作步骤包括：（1）将自体脂肪包裹于穿刺部位，（2）使用缝线固定，以确保脂肪与动脉外膜充分接触，（3）使渗出的血液渗透至脂肪-动脉界面并在该处发生凝血。这一三重作用机制实现了可靠的止血效果，同时保持了动脉通畅，预防了术后缺血性并发症。该方法具有操作简便、临床有效性高以及良好的转化应用潜力。

引言

在动物模型中，建立动脉损伤是一种广泛使用的实验方法，用于模拟多种病理状态，包括脑缺血-再灌注模型、颈总动脉（CCA）或主动脉（AO）动脉粥样硬化模型以及脊髓缺血模型。

以小鼠脑缺血-再灌注（MCAO）模型为例，目前的标准建模方法^1,2,3包括：分离颈外动脉（ECA），结扎其远端，在近端ECA处用动脉夹夹闭并放置固定缝线，在两点之间造一个穿刺孔，将线栓经颈总动脉（CCA）逆行插入，用固定缝线固定血管和线栓，在穿刺点与远端结扎之间切断ECA，松开动脉夹，将线栓导入颈内动脉（ICA）以阻塞大脑中动脉，撤出线栓后结扎近端ECA。

尽管该操作能够实现再灌注，但仅恢复了颈总动脉与颈内动脉之间的血流，导致颈外动脉永久性断开。这种颈外动脉的切断会引起同侧面部区域的缺血性损伤，这是一种非预期的伤害，不仅使手术操作更加复杂，还给实验动物引入了混杂的创伤，可能影响研究结果。更令人担忧的是，在某些实验方案^4，5中，研究人员采用直接穿刺颈总动脉的方法，插入缝线建立大脑中动脉阻塞（MCAO），随后立即撤出缝线，并在穿刺部位两端进行永久结扎以止血。然而，这种方法会直接增加血管压力，从而升高心脏后负荷，可能导致心力衰竭⁶。

以采用小鼠颈总动脉（CCA）或腹主动脉（AO）内皮损伤模型并结合高脂饮食建立动脉粥样硬化为例，传统方法^7,8,9,10包括在颈总动脉、腹主动脉（AA）或股动脉（CFA）进行动脉穿刺，插入球囊导管以诱导内皮剥脱，并通过永久结扎穿刺部位两端实现止血。这种标准方法存在若干关键局限性：强制性结扎会在阻塞部位远端造成局部缺血；更严重的是，脂质会在结扎部位积聚。这些因素通过影响局部血流动力学，改变了该模型的有效性，干扰了药物向靶病变部位的递送，并导致药理学评估结果产生偏差。

在小鼠脊髓缺血模型中，该操作包括动脉穿刺（通过 CCA、AA 或 CFA 通路，随后插入球囊导管以在目标部位诱导缺血¹¹球囊撤出后，通过双侧永久结扎穿刺部位实现常规止血。

在上述三种模型中，穿刺后的止血均通过双侧结扎穿刺部位来实现。尽管这种方法在控制出血方面有效，但不可避免地会引起局部缺血，导致继发性并发症，最终影响模型的有效性。因此，在止血过程中维持血管通畅在生理学和实验设计上均至关重要。本文介绍一种创新、简便且有效的适用于小鼠实验的动脉止血方法。该方法首先使用动脉血管夹夹闭穿刺部位的两端，然后用一块3 mm × 3 mm × 1 mm的脂肪垫包裹穿刺处以覆盖伤口。再以结扎缝线在动脉周围固定脂肪垫。随后逐步松开动脉夹，并根据出血情况调整结扎线的松紧度，直至实现完全止血。该方法可恢复血流，维持正常的血流动力学状态，并避免因永久性血管结扎所致的周围组织缺血性损伤。此技术特别适用于对小鼠建模后长期观察其生理状况，以及评估药理学干预效果，从而显著提高临床前研究的实验严谨性。

方案

所有实验操作均严格遵守沈阳农业大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的《实验动物护理和使用指南》（方案批准号：SNLL25040501；动物使用许可证号：SYXK(辽)2021 - 0010）。所使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 实验准备

1. 动物信息与记录：按照ARRIVE指南（动物研究：体内实验报告）记录所有动物实验数据。使用6至8周龄的雄性Balb/C小鼠，体重为22 g ± 4 g。饲养环境维持在24 ± 2 °C，相对湿度为55% ± 5%，光照周期为12小时明/12小时暗。
2. 动物准备
   1. 使用异氟烷挥发器对小鼠进行麻醉（遵循机构批准的方案）。以4%异氟烷诱导麻醉，随后以2%异氟烷维持麻醉。在麻醉期间使用眼药膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。麻醉诱导后，皮下注射卡洛芬（carprofen），剂量为5 mg/kg，用于术中和术后镇痛。
   2. 麻醉完成后，去除颈部和颅部区域的毛发，并用聚维酮碘对暴露的皮肤进行消毒，随后用75%乙醇去除残留物。
   3. 将小鼠置于37 °C加热垫上，用于后续所有实验操作。
3. 测量小鼠基线脑血流量
   1. 将小鼠置于俯卧位。在开始手术前，通过适当监测（如脚趾夹捏反应）确认已达到外科麻醉深度。沿中线做头皮切口，暴露顶骨。仔细分离并去除颅骨表面覆盖的筋膜层。
   2. 调整激光散斑成像（LSCI）系统，以10倍放大倍率扫描暴露的小鼠顶骨区域，并记录基线脑血流数据。
4. 获取脂肪垫并进行动脉穿刺
   1. 将小鼠重新置于仰卧位。沿颈部中线做切口。取一块3 mm × 3 mm × 1 mm的皮下脂肪组织移植物，留待后续使用。
   2. 钝性分离下颌下腺、胸骨舌骨肌和胸锁乳突肌，暴露双侧颈总动脉（CCA）。
   3. 游离颈总动脉，以暴露颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）。
   4. 在颈总动脉远端应用血管夹1，在近端放置血管夹2。
   5. 使用23 G针头在两个血管夹之间穿刺颈总动脉。
5. 应用脂肪垫
   1. 拔出针头后，将脂肪垫的切割面（非浆膜面）包裹在穿刺部位的颈总动脉周围。
   2. 在脂肪包裹区域下方放置一根4-0缝线；然后在脂肪表面轻轻打一个单结，施加压力以确保脂肪垫与血管壁紧密接触；最后逐步调整结扎力度，达到止血所需的压力平衡。
   3. 用湿润棉签抬起远端颈总动脉。松开血管夹1，并缓慢撤出棉签，使血液逐渐流向穿刺部位。
   4. 检查血流情况；若观察到活动性出血，则使用血管夹1重新夹闭远端颈总动脉。
   5. 等待1分钟，然后缓慢松开血管夹1；若发生出血，重新调整脂肪垫位置或略微收紧单结以增加压力；持续调整直至完全止血。
   6. 用湿润棉签抬起近端颈总动脉。松开血管夹2，并缓慢撤出棉签，使血流受控地流向穿刺部位。
   7. 若出现出血，使用血管夹2重新夹闭远端颈总动脉。
   8. 略微收紧缝线的单结以增加压力；等待1分钟后，抬起近端颈总动脉并松开血管夹2；同时将湿润棉签缓慢向穿刺部位滚动。
   9. 若出血持续，重复上述两个步骤，直至实现完全止血。
   10. 在原有结上再打一个结，形成双结，从而更牢固地将脂肪垫固定在血管壁上，并通过血管内外压力的平衡实现止血。
   11. 确认脂肪垫两侧的颈总动脉均充盈且管径一致；视为血流恢复成功并实现有效止血。
   12. 重复相同操作，在对侧颈总动脉进行穿刺止血。
   13. 在假手术组小鼠中暴露双侧颈总动脉，但不进行动脉穿刺或脂肪垫包裹，其余操作与手术组完全相同。
   14. 缝合颈部手术切口并涂抹抗菌剂。
6. 术后脑血流评估
   1. 完成双侧颈总动脉穿刺止血后，调整LSCI系统扫描暴露的顶骨区域，获取10倍放大图像，并记录脑血流变化。
   2. 缝合头皮切口并涂抹抗菌剂，将小鼠置于37 °C加热垫上恢复，之后放回饲养笼中继续护理。
7. 术后监测与组织采集
   1. 术后期间每日监测并记录小鼠的存活状态、运动活动以及颈下颌区域是否有出血迹象。
   2. 在术后第7、14和28天，按照机构批准的方案使用二氧化碳处死小鼠，并用4%多聚甲醛固定脑组织。

2. 病理学检查

1. 固定24小时后，通过梯度乙醇脱水脑组织，二甲苯透明，石蜡包埋以进行切片。
2. 对海马区切片进行苏木精-伊红（H&E）染色，并在显微镜下观察脑组织形态。
3. 对海马区切片进行尼氏（Nissl）染色，并在显微镜下观察神经元结构。

结果

对假手术组和手术组的术前及术后激光散斑衬比成像数据和相对灌注量测量结果进行分析，显示无显著变化，表明该动脉止血技术成功封闭了颈总动脉穿刺部位，且未影响脑血流（图1）。

术后对实验组小鼠持续监测28天，未观察到死亡情况。其运动活性与假手术组相比，或与自身术前基线水平相比均无差异，且在颈区或下颌下区未检测到出血现象。这些结果证实了该方法在动脉止血方面的有效性。

假手术组和手术组的脑组织H&E染色结果显示，皮层、海马和丘脑区域的组织学结构清晰，组织架构保持完整，未见明显病理性改变。神经元形态完整，细胞密度未见降低。尼氏染色显示神经元排列有序，细胞结构正常，尼氏体完整。这些病理学结果证实，动脉闭合技术可有效封闭颈动脉穿刺部位，在长期观察期间不会影响脑灌注或导致脑损伤（图2）。

讨论

在MCAO模型中，保留ECA可防止因ECA结扎和切断引起的面部缺血性损伤，从而更好地模拟临床病理状态。而传统的插入栓线方法 通过 CCA穿刺技术具有操作简便的优点，但需要对穿刺部位进行双侧结扎，导致脑部灌注依赖于Willis环的侧支循环，无法充分模拟真实脑卒中的病理生理过程。本研究介绍的脂肪垫止血技术可在拆除缝线的同时实现血管修复和血流恢复，从而在不引起缺血并发症的情况下，同步维持脑部和面部的血液灌注。该方法允许术后立即实现再灌注，无需依赖代偿性循环机制。因此，优化后的MCAO模型能更准确地模拟人类脑卒中的发病机制，产生具有临床相关性的数据，并支持长期存活研究，避免结扎所致的缺血性合并症。

对于涉及血管内皮损伤或球囊诱导的缺血-再灌注动物模型，该方法可有效封闭插管后的动脉穿刺部位，在防止脂质沉积的同时维持通畅的血流。

综上所述，图1 显示术后脑血流未受损害且血管通畅，证明了止血的短期有效性。对手术组与假手术组的术后长期观察未发现死亡病例，且

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-0 缝合线缝纫针	上海浦东金环医用材料有限公司
Balb/C 小鼠	北京华阜康生物科技股份有限公司		6-8周龄，雄性
DHG 系列电热恒温鼓风干燥箱	上海一恒科技有限公司	DHG-9123A
苏木精-伊红（H&E）高清晰染色试剂盒	Servicebio	G1076-500ML
异氟烷	深圳瑞沃德生命科技有限公司	R510-22
激光散斑血流成像仪	深圳瑞沃德生命科技有限公司	RFLSI ZW
尼氏染液	Servicebio	G1036-100ML
组织包埋机	Leica	HistoCore Arcadia H
切片扫描成像系统	深圳盛强科技有限公司	SQS-40R
小动物麻醉机	深圳瑞沃德生命科技有限公司	R500
组织脱水机	Leica	HistoCore pearl
超纯水系统	Thermo	50132370
超薄半自动切片机	Leica	HistoCore MULTICUT