需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

用于构建轴突损伤模型并实现多组学分析的微流控芯片

1.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/68915

⸱

2025年10月14日

 ,  ,  ,  , 
1Beijing Advanced Innovation Center for Big Data-Based Precision Medicine, Beihang University, 2Interdisciplinary Innovation Institute of Medicine and Engineering, Beihang University, 3School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 4School of Software, Beihang University, 5School of Beijing, Beihang University

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于模拟轴突损伤后神经元代谢动态的微流控系统，可实现成像、多组学分析以及内在代谢重塑的机制研究。

摘要

神经元通过极化形成树突和轴突，从而实现细胞间通讯。轴突损伤会破坏这些连接，并将损伤信号传递至胞体，常导致神经元变性。因此，维持轴突稳态对于促进局部轴突再生及防止神经变性至关重要。该过程依赖细胞代谢提供能量和生物合成前体，并由调节代谢平衡及清除代谢副产物的机制维持。然而，神经元代谢在胞体与轴突之间具有区室化特征，且进一步受到其他因素影响 在体内 由周围微环境因素所影响，例如星形胶质细胞来源的代谢活动（如星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭）。这些因素使得神经元内在代谢机制的研究变得复杂。为应对这些挑战，本文建立了一种用于培养原代皮层神经元的微流控平台 体外 保留所观察到的关键代谢特征 体内，包括生理性糖酵解通量和线粒体呼吸。该系统为研究轴突损伤后神经元内在的代谢重塑提供了一个简化的模型。传统的微流控芯片支持 体外 轴突损伤模型，且兼容活细胞成像、免疫荧光染色和缺氧处理。为满足涉及数百万细胞的大规模转录组学和代谢组学分析需求，我们进一步设计并制备了高通量微流控芯片，并优化了操作流程。该装置具有交替排列的胞体室和轴突室，二者通过微通道连接，轴突损伤通过抽吸轴突室内的液体产生负压实现。该平台可快速评估代谢物和酶的动力学变化，提升多组学研究的准确性和可重复性。

引言

神经元在发育过程中通过极化形成两种具有特殊功能的突起：轴突和树突1,2。神经再生是指神经损伤后轴突重新生长的过程3，其研究重点在于中枢神经系统（CNS）的修复。与周围神经系统不同，中枢神经系统再生能力有限4,5,6，常导致脊髓损伤或创伤性脑损伤患者出现持续性功能障碍或永久性残疾7,8。因此，开发促进中枢神经系统修复的策略，并阐明轴突再生的潜在机制至关重要。

微流控装置，作为集成化、低成本且高通量的 体外 培养系统，近年来在细胞与神经元研究中展现出显著优势9,10与传统方法相比，微流控技术能够精确调控流体剪切应力、浓度梯度和空间结构，从而更真实地模拟生理和病理微环境，促进细胞的生长、迁移、分化及相互作用11,12,13,14基于微流控技术的 体外 轴突损伤模型通过空间极化实现神经元胞体与突起的区室化培养，为研究神经元的内在再生能力及其损伤后的代谢适应提供了不可或缺的工具15,16,17,18为研究神经元如何响应损伤、调控代谢过程提供了关键窗口19并促进轴突再生20然而，现有的用于轴突损伤和代谢研究的微流控平台仍面临诸多挑战，包括神经元细胞得率低、代谢测量准确性下降，以及缺乏标准化的操作流程。

针对这些局限性，本研究开发了一种新型的大规模微流控平台，可实现标准化、高通量的轴突损伤诱导，并提供足够的细胞材料用于分区化的多组学分析。该集成化设计直接应对了神经损伤研究中长期未满足的关键需求。具体而言，我们设计的微流控芯片采用胞体室与轴突室交替排列的结构，通过微沟道相互连接，并利用可控的真空抽吸实现轴突切断。该方法特别适用于需要可重复、高通量轴突损伤模型及精确代谢谱分析的研究，例如探究轴突再生过程中潜在的代谢机制。与传统方法相比，该技术具有更高的通量、更精确的代谢分析能力，以及建立标准化损伤模型的优势。例如，先前的研究已证实线粒体运输在轴突再生中的重要作用20,21,22,23，而我们的平台进一步揭示了损伤后葡萄糖代谢在轴突再生中的作用。本实验方案建立了一个兼具可视化验证与操作标准化的大规模轴突切断与代谢分析技术体系。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有实验均按照北京航空航天大学伦理委员会的指南进行，并获得了该委员会的批准（批准编号：BM20210060）。图1概述了实验时间线。

1. 传统与大规模微流控装置的设计

  1. 使用 AutoCAD 设计微流控装置，以创建二维（2D）示意图和三维（3D）结构模型。
  2. 使用这些设计通过SU-8负性光刻技术在硅晶圆上制备主模具。
  3. 通过浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制母模，制备出高精度、功能化的微流控芯片。
  4. 将每个微通道设计为高5 µm，仅允许轴突通过，同时阻挡胞体。
  5. 将微通道制作为10 µm宽，以增加轴突容量。
  6. 将腔室设计为高120 µm、宽220 µm，以提供足够的空间容纳神经元胞体。
  7. 使用该微流控平台进行模拟 体内 通过控制流体流动和神经元定位来实现轴突损伤。
  8. 使用高精度细胞操作装置制备代谢组学和转录组学样本，并实现高通量处理，以提高样本的准确性和生物学有效性。

2. 传统及大规模微流控器件的制备

  1. 按10:1（w/w）的质量比称取PDMS基底和固化剂，放入离心管中。
  2. 将含有PDMS混合物的离心管置于离心搅拌混合器中，在2000 ×g条件下离心4分钟以混合均匀，随后再次在2000 ×g条件下离心4分钟以脱气。
  3. 将13–15 g脱气后的PDMS倒入微流控模具中，确保模具底部完全被覆盖。
  4. 将模具放入真空干燥器中，使用真空泵抽气5–10分钟，彻底去除PDMS中的气泡。
  5. 用橡胶吸耳球轻轻敲击PDMS表面，以破裂任何残留的表面气泡。
  6. 将模具放入鼓风烘箱中，在80 °C下加热100分钟，使PDMS固化。
  7. 当PDMS完全固化后，轻轻将手术刀刀尖插入PDMS边缘下方，小心抬起并将其从模具上剥离。
  8. 使用直径为2.0–2.5 mm的活检打孔器在PDMS上打孔，用于培养基灌注和细胞加载。
  9. 用粘性胶带去除PDMS表面的任何杂质，然后将其放入洁净的玻璃培养皿中，并用铝箔包裹以备储存。
  10. （可选）对PDMS表面进行氧气等离子体处理（30 W，20 s），随后将其压紧至另一表面以实现不可逆键合。
  11. 实验前，将微流控装置在121 °C和101 kPa条件下高压蒸汽灭菌5分钟，以确保无菌。

3. 皮层神经元的制备

  1. 将3只出生后Sprague-Dawley（SD）大鼠（出生后12小时内）置于冰上5分钟以麻醉，随后迅速断头处死。
  2. 解剖大脑皮层的运动区，并将组织置于预冷的解离缓冲液中（例如，2 mL不含钙和镁的HBSS）。
    注意：所有组织解剖操作均需在冰上进行，并使用预冷的溶液。
  3. 使用无菌剪刀将组织剪成约1 mm3大小的碎块，并转移至15 mL离心管中。
  4. 静置5分钟，然后小心吸除上清液以去除残留血液和缓冲液。
  5. 加入预热的木瓜蛋白酶溶液（1 mg/mL），溶于5 mL含钙和镁的HBSS中，并加热至37 °C。
  6. 在37 °C、5% CO2培养箱中孵育40分钟，每10分钟轻轻倒置离心管3次。
  7. 消化完成后，使用200 µL移液器轻柔吹打悬液100次。
    注意：避免引入气泡，以防细胞应激。
  8. 以300 ×g离心3分钟，弃去上清液。
  9. 加入终止液（含1 mg/mL蛋白酶抑制剂，例如，将木瓜蛋白酶解离系统试剂盒中的抑制剂小瓶中的600 µL加入5 mL含钙和镁的HBSS中），重悬细胞。
  10. 将细胞悬液通过40 µm细胞筛过滤，并将滤液收集至新的离心管中。
  11. 以200 ×g离心10分钟，弃去上清液。
  12. 用500 µL含2% B27和1% GlutaMAX的完全神经元培养基重悬细胞沉淀。
  13. 计数细胞（约每只大鼠300万个），并将细胞密度调整至1 × 106个/mL，用于后续实验。

4. 包被

注意：使用多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液处理盖玻片或培养皿，以增强神经元的黏附性，并为神经元生长创造最佳环境。

  1. 盖玻片包被
    1. 将用于常规微流控装置的盖玻片（Φ25 mm，厚度0.17 mm）放入35 mm培养皿中，并加入2 mL 0.1 mg/mL多聚赖氨酸（PDL）溶液。
    2. 在37 °C下孵育6小时或过夜。
    3. 孵育结束后，小心回收PDL溶液以重复使用或进行妥善处理。
    4. 向培养皿中加入2 mL无菌超纯水，顺时针旋转50次，再逆时针旋转50次（若处理多个培养皿，可将其同时置于较大的培养皿中一起旋转）。
    5. 使用连接无菌移液管头的真空泵抽吸液体，并将废液收集至液体废弃物容器中。
    6. 重复上述清洗步骤（步骤4.1.4–4.1.5）共三次。
    7. 将盖玻片置于生物安全柜中自然晾干后备用。
  2. 培养皿包被
    1. 向培养皿或孔板中加入适量的0.1 mg/mL PDL溶液（例如，常规微流控使用35 mm培养皿时加2 mL，大规模微流控使用10 cm培养皿时加5 mL）。
      注意：确保生物安全柜正常运行并提供无菌气流，以防止污染。
    2. 确保溶液完全覆盖培养皿底部，于37 °C下孵育6小时或过夜。
    3. 回收PDL溶液后，按照步骤4.1.4所述方法，用适量无菌超纯水清洗培养皿三次。
    4. 去除残留的超纯水，并将培养皿置于超净工作台中晾干，以备后续使用。

5. 神经元培养基的制备

  1. 准备用于常规神经元培养的完全培养基。
    1. 从一次性50 mL注射器中取出活塞。将注射器放置在生物安全柜内洁净的台面上，橡胶头朝上。
    2. 依次向注射器中加入500 µL青霉素-链霉素溶液（PS）、1 mL B27添加剂、125 µL GlutaMAX溶液和500 µL胎牛血清（FBS）。每次加入不同组分时均需更换移液器吸头，以避免交叉污染。
      注意：为保持一致性，请严格按照指定顺序添加各组分。
    3. 取一个新的无菌50 mL离心管。将其标记为 "Neurobasal-A (NBA) + 2% B27 + 0.25% GlutaMAX + 1% FBS + 1% PS"。
      注意：若非胚胎期神经元，请使用NBA；若为胚胎期神经元，则使用neurobasal（NB）培养基。
    4. 将一个0.22 µm注射器滤器连接至注射器末端。
      注意：确保滤器与注射器紧密连接，以防漏液。
    5. 使用NBA培养基将注射器加液至总体积50 mL（包含所添加组分的体积），然后重新装入活塞。
    6. 以约2 mL/s的速度缓慢推动活塞，将液体经滤器过滤至已标记的离心管中。
    7. 拧紧离心管盖子，倒置管体3–5次以充分混匀培养基。
  2. 含[U-13C6]-葡萄糖的完全培养基（用于代谢通量分析）：为对受损神经元中的葡萄糖代谢进行代谢通量分析，应使用无糖NBA培养基配制含[U-13C6]-葡萄糖的完全培养基。
    1. 以无葡萄糖NBA培养基作为基础液，在过滤前加入[U-13C6]-葡萄糖，使其终浓度为25 mM（若[U-13C6]-葡萄糖为固体，需预先计算并称量）。其余组分的添加顺序、过滤及混匀步骤均同5.1节所述。

6. 细胞计数

  1. 用75%乙醇彻底擦拭血细胞计数板。确保所有表面完全干燥后再进行下一步操作。
  2. 向一个1.5 mL无菌离心管中加入90 µL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。
  3. 用移液器轻轻吹打收集的神经元细胞悬液3–5次，确保充分混匀。
  4. 使用10 µL移液器，取10 µL混匀后的细胞悬液加入含有90 µL PBS的离心管中（1:10稀释）。
  5. 用200 µL移液器轻轻吹打溶液10次，确保不产生气泡。
  6. 更换新的10 µL枪头，吸取10 µL稀释液，加入血细胞计数板的样品室中。
  7. 将血细胞计数板置于显微镜载物台上，使用20倍物镜调焦。找到中央4 × 4网格，按照标准血细胞计数板规则计数全部16个方格中的细胞。
  8. 记录16个方格中的总细胞数。按以下公式计算细胞浓度：(总细胞数 × 10) × 104 个细胞/mL。
    注意：操作时务必在生物安全柜中进行，并穿戴适当的个人防护装备。

7. 体外 在常规或大规模微流控装置中培养皮层神经元

  1. 方案 A（传统微流控装置）。
    1. 确认35 mm培养皿中的玻璃表面完全干燥。
    2. 使用无菌细头镊子，将经高压灭菌的微流控芯片置于玻璃表面中央，微通道面朝下。
    3. 使用200 µL移液枪头轻轻按压芯片，确保其与玻璃表面完全贴合。
    4. 用永久性记号笔在左侧腔室上标记一个点（·），以标识胞体区室。
    5. 使用10 µL移液器吸取10 µL神经元悬液（1000万个细胞/mL）。
    6. 缓慢将悬液加入标记的胞体区室上方的加样口。
    7. 确认液体顺利流入左侧腔室的下层储液区。
    8. 将培养皿转移至加湿培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育20分钟。
    9. 从培养箱中取出培养皿。
    10. 使用20 × 相差显微镜，确认培养基通过微通道从胞体区室灌注至轴突区室。
    11. 向轴突区室（右侧腔室）的上口加入150 µL神经元基础培养基，使其在重力作用下流入下层储液区。
    12. 同样，向胞体区室（左侧腔室）的上口加入15 µL完全神经元培养基。
      注意：此时应可见神经元已贴壁，大部分细胞碎片已被冲入下层孔中。培养期间无需更换培养基；按照步骤5.1.3所述，仅一次性添加完全神经元培养基。
    13. 向150 mm培养皿中加入20 mL超纯水以形成湿度环境，将35 mm培养皿放入大皿中。
    14. 将整个培养系统转移至培养箱中，并维持所需时间（例如7天）。
      注意：所有细胞培养操作均应在生物安全柜内无菌条件下进行。穿戴适当的个人防护装备（实验服和手套）。操作前后对工作台面进行去污染处理。
  2. 方案 B（大规模微流控芯片）。
    注意：在标准传统规格方案基础上进行两项修改。
    1. 使用10 cm培养皿放置装置。
    2. 根据实验需求选择全通道或间隔通道接种方式，因不同方法需采用不同的轴突损伤方案。
    3. 完成接种后，向10 cm培养皿中加入5 mL完全神经元培养基，以维持神经元生长。
    4. 向150 mm大皿中加入20 mL超纯水以形成湿度环境，然后将10 cm培养皿放入大皿中（图3F）。
    5. 同步骤7.1.14。

8. 建立一个 体外 传统微流控装置中的轴突损伤模型

  1. 将微流控装置的左侧标记为胞体区（以“·”标记指示），右侧标记为轴突终末区。
  2. 将种子皮层神经元接种到胞体区室中。
  3. 培养神经元 体外 直至第7天（DIV7），使轴突通过微通道延伸至轴突终末区。
  4. 在DIV7时，在轴突末端区室中进行轴突损伤操作，以建立一个 体外 轴突损伤模型
  5. 取适量NBA培养基，转移至新的15 mL离心管中，备用。
  6. 在微流控装置中培养皮层神经元至指定时间。然后将装置转移至洁净工作台。
  7. 使用无绒纸巾擦干35 mm培养皿底部。用200 µL移液器从微流控装置右侧的两个孔中吸出培养基。
  8. 将真空泵管路连接至一个无菌且未带滤膜的200 µL移液枪头，开启真空泵（抽吸速率为60 L/min），并将枪头对准轴突末端室下孔与腔室之间的连接处，以吸除旧培养基（此时轴突因负压而断裂）。
  9. 更换200 µL移液器吸头，吸取150 µL NBA，通过右侧室的下孔缓慢加入。
    注意：如果液体流速过慢且有气泡形成，应迅速将液体从尖端排出，以快速充满计数室。
  10. 交替使用右侧的两个孔进行液体添加：每次加入NBA后，立即使用真空泵从另一个孔中吸出液体以切断轴突。重复此操作4次，最后一次吸液后，更换为新鲜的完全神经元培养基。
  11. 从细胞体侧孔中吸除旧培养基，并加入含药物（如需要）的新鲜完全神经元培养基。
  12. 将微流控装置与培养皿一同放入150 mm培养皿中，并继续培养指定时间（例如24 h）。
    注意：轴突损伤操作需要使用NBA培养基，因为神经元完全培养基会产生气泡，影响切断效果。

9. 大规模微流控装置轴突损伤

  1. 方法1：手动轴突损伤。
    1. 将神经元接种至微流控装置的所有腔室中。
    2. 将装置置于含5% CO2的湿润培养箱中，37 °C培养三天，随后移除整个微流控装置。
      注意：为避免生长进入微通道的轴突受到机械应力或撕裂，应在DIV3而非DIV7时移除微流控装置。如果实验设计包含未损伤的对照组，则这一点尤为重要。
    3. 在DIV7时，将含有微流控装置的培养皿从培养箱中取出，并放置于无菌操作台面上。
    4. 准备一台配备20倍物镜的显微镜，并使用75%乙醇对操作区域进行消毒。
    5. 手持一支10 µL无菌滤芯吸头，在显微镜引导下识别原始微通道中的轴突束。
    6. 使用吸头沿每束轴突进行纵向划痕操作。
    7. 划痕后在显微镜下实时观察轴突断裂情况。
      注意：操作活体神经元时，应佩戴腈类手套，并在经紫外线灭菌的实验室环境中操作。
  2. 方法2：真空辅助轴突损伤。
    1. 将皮层神经元交替接种于大尺寸微流控装置中。
    2. 开启真空泵，并将其流速设定为60 L/min。
    3. 使用无菌吸头将真空泵管的一端连接至轴突腔室的接口。
    4. 通过常规微流控程序施加负压，完成轴突切断。
    5. （可选）若需特异性收集受损轴突，在轴突切断后的特定时间点，使用真空泵（抽吸速率为60 L/min）快速抽吸胞体室内的内容物，以去除细胞胞体，从而仅保留微通道内的轴突。

10. 常规或大规模微流控设备的缺氧处理

  1. 在微流控装置中接种原代神经元，并在常氧条件下培养至第7天（37 °C，5% CO2）。
  2. 将微流控装置放入低氧培养箱中，并通入含1% O2、5% CO2 和平衡 N2 的混合气体。
  3. 使用转子流量计控制气体流速，并将其设定为25 L/min。
  4. 冲洗箱体5分钟，以置换内部空气。
  5. 在夹闭低氧箱进气口的同时，关闭出口减压阀。
  6. 夹闭低氧箱的出气管路，最后彻底关闭气瓶阀门。
  7. 将微流控装置在低氧箱中于3 °C下孵育1小时。

11. 培养神经元的样品制备 体外 使用大规模微流控设备进行组学分析

  1. 转录组学分析样品。
    1. 轴突损伤完成后6小时，将带有受损轴突的微流控装置转移至超净工作台。
    2. 弃去旧培养基后，用无菌 PBS 洗涤神经元细胞 2 至 3 次。
    3. 使用标准RNA提取试剂盒，按照制造商说明书分离和纯化RNA。
    4. 进行RNA测序。对获得的测序数据进行后续生物信息学分析。
  2. 用于代谢通量分析的样品。
    注意：为了利用大规模微流控装置监测损伤后神经元中葡萄糖代谢通量的变化，我们采用了[U-13C6]-葡萄糖示踪代谢流分析24液相色谱-质谱分析样品制备的方案如下：
    1. 使用 P0 SD 大鼠幼崽进行实验。分离皮层神经元并进行培养 体外 短期（DIV5-DIV7）或长期（DIV15-DIV30）。
    2. 对于年轻（DIV5-DIV7）和成熟（DIV15-DIV30）神经元，分别建立损伤组和未损伤对照组。
    3. 更换培养基，使用含有 25 mM [U-13C6]-葡萄糖（无葡萄糖 Neurobasal-A，1% FBS，2% B27，25 mM [U-13C6]-葡萄糖），在37 °C下孵育4小时。
      注意：为避免换液过程中渗透压或pH变化引起的神经元应激和凋亡，需额外准备培养在含有25 mM [U-13C6]-葡萄糖，并使用该培养基进行换液。
    4. 用预热的含钙和镁的HBSS轻轻冲洗两次，每次5 mL，然后将样品在液氮中速冻，并于-80 °C保存。
      注意：操作液氮时需佩戴腈类手套和实验服。

12. 基于传统和大规模微流控装置的神经元免疫荧光染色

注意：培养神经元时 体外 使用微流控装置时，必须考虑在拆卸装置以进行活细胞固定的过程中，微通道内神经元轴突可能受到的损伤。

  1. 使用微型废液真空泵从微流控装置的四个孔中移除培养基。
    ​注意：在整个免疫荧光染色过程中，需保持两个腔室中有液体。吸力参数不宜过高（2.5 L/min 为最佳），以避免损伤或吸走神经元胞体和轴突。
  2. 向微流控装置的两个上层孔中各加入 100 µL 的 1× PBS（PBS 将自然流入下层孔中）。
  3. 更换真空泵末端的无滤芯吸头，从下层孔中吸除 PBS，并重复该过程三次。最后一次操作时，将四个孔中的 PBS 全部吸除。
  4. 向两个上层孔中各加入 150 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，在室温下固定 10–15 分钟。
    注意：活细胞固定过程中避免拆卸装置，以维持神经元结构的完整性。该方法有助于更清晰地区分神经元胞体和轴突的位置。
  5. 用 1× PBS 洗涤三次，然后将神经元与封闭缓冲液（含 5% 山羊血清、0.3 M 甘氨酸、2% 牛血清白蛋白（BSA）、PBS 和 0.1%（或 0.5%）Triton X-100）在室温下孵育 1 小时。
  6. 用封闭缓冲液稀释一抗（例如 βIII-微管蛋白，小鼠来源，1:2000），向上左孔加入 100 µL，向上右孔加入 50 µL，并在 4 °C 下与神经元孵育过夜。
  7. 吸除一抗后，按照步骤 12.2–12.3 所述方法用 1× PBS 洗涤三次。然后按照步骤 12.6 所述方法，将用封闭缓冲液配制的二抗加入微流控装置的上层孔中，在避光条件下孵育 30 分钟（必要时可用铝箔覆盖）。
  8. 用 1× PBS 洗涤三次后，再用超纯水冲洗一次。小心使用弯头镊子夹住微流控装置的右上角，将其从装置中取出。
  9. 向培养皿中加入 1 mL PBS，使大片盖玻片与皿分离。
  10. 用移液器吸取 15 µL 封片剂，滴加至指定用于盖玻片的位置。
  11. 轻轻将细胞面朝下置于封片剂上，放置盖玻片，并去除多余液体。
  12. 在室温下使封片剂完全干燥。
  13. 待封片剂在室温下完全干燥后，使用转盘共聚焦显微镜进行成像。
  14. 选择 20× 空气物镜，设置每帧曝光时间为 100–200 ms，激光功率设置为最大值的 5–10%，使用 488 nm 激发绿荧光蛋白（GFP）和/或 561 nm 激发红荧光蛋白（RFP）。

13. 传统微流控装置中的活细胞成像

  1. 在微流控装置中培养皮层神经元至 DIV7。
  2. 根据制造商说明书配制活细胞染料（例如线粒体膜电位探针）。
  3. 将染料稀释于预热（37 °C）的神经元维持培养基中。
  4. 将染料溶液加入微流控装置的胞体侧室。
  5. 在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 30 分钟。
  6. 用 3 mL 预热（37 °C）的含钙镁 HBSS 轻柔清洗各室 3 次。
  7. 向微流控芯片中加入不含酚红的活细胞成像溶液。
  8. （可选）加入 GlutaMAX（0.25%）和 B27（2%）以延长成像时间。
  9. 将微流控芯片放置于显微镜载物台上，使胞体室位于左侧，轴突末梢室位于右侧。
  10. 在物镜上滴加一滴浸没油，确保油与芯片下方的盖玻片接触。
  11. 使用 40 倍物镜，曝光时间为 150 ms，激光功率最高为 10–15% 进行成像。
    注意：根据染料的光稳定性调整这些参数。

14. 数据分析

  1. 使用 ImageJ 软件分析显微镜图像。使用生物分析仪评估 RNA 质量。利用适当的平台进行并分析 RNA-seq。
  2. 对于代谢组学研究，使用 MRMPROBS 程序（版本 2.60）提取原始质谱数据，并收集已鉴定代谢物的信息，包括同位素细节和峰面积。
  3. 所有统计分析均使用 GraphPad Prism（版本 8.4.3）进行。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。组间比较采用非配对双尾 t 检验或 Mann-Whitney 检验，组内多个时间点的比较采用双因素方差分析（显著性：ns，无显著性；*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

为了建立一个用于研究皮层神经元代谢调控机制的综合性研究平台，我们首先在传统的微流控装置中培养皮层神经元，精确控制轴突沿微通道生长（图2A）。通过合理的设计，微通道具有较低的高度（5 µm）和较大的宽度（10 µm），使得每个通道能够容纳更多的轴突，同时阻止细胞体进入。βIII-微管蛋白的免疫荧光染色证实了轴突通过微通道生长至轴突终末室（图2B）。为进一步确定轴突损伤是否影响神经元存活，我们定量分析了轴突损伤前后神经元的密度。结果显示，轴突损伤后神经元密度无显著差异，表明轴突损伤未导致明显的神经元死亡（图2C）。为满足多组学分析所需的样本量（通常每样本约3 × 106个细胞），我们开发了一种具有可扩展布局和三维结构的大规模微流控装置，以确保实验数据的准确性（图3A–C...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

建立用于研究轴突损伤与再生的先进体外模型，对于揭示神经元修复过程中涉及的分子与代谢机制至关重要16,19。在本研究中，我们提出了一种标准化的工作流程，该流程整合了微流控装置、大规模神经元培养以及精确的轴突损伤方案，能够对受损皮层神经元进行可靠的多组学分析。

该方法的成功在很大程度上依赖于若干关键的操作步骤。在微流控芯片制备过程中，精确控制PDMS的固化时间（80 °C下100–120分钟）和灭菌时间（5–10分钟）至关重要，以防止芯片过度硬化，从而避免后续出现滑脱或泄漏问题25。此外，轴突切断过程中真空泵的参数设置必须准确：吸力过大可能损伤神经元胞体，而吸力不足则可能导致轴突切断不完全。值得注意的是，常规装置和大规模装置均采用相同的制备流程，主要区别在于模具设计以及固化后打孔的位置和直径。对于常规微流控装置，通孔直径为5 mm；而对于大规模微流控装置，通孔直径为3 mm。另一个关键的操作细节是在轴突切...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到北京市自然科学基金（资助号：L222080、F251031、Z240011、7192103）和国家自然科学基金委员会（资助号：82271513）的支持

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Neurobasal-A 培养基Gibco10888022培养基
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠InvitrogenA-21042免疫荧光
分析天平上海舜宇恒平科学仪器有限公司FA1004试剂/样品的精确称量
B27 (50x)Gibco17504044培养基
BCA 蛋白检测试剂盒BosterAR1189蛋白质浓度测定
BioanalyzerAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
牛血清白蛋白GenviewFA016免疫荧光
离心搅拌脱气混合器THINKARE-310混合 PDMS 并进行脱气
CLARIOstarPlus-ACU 分析仪BMG LABTECHCLARIOstar Plus蛋白质浓度测定
CO2 培养箱赛默飞世尔科技（阿什维尔）有限责任公司3111细胞培养，37 °C，5% CO?
耐腐蚀隔膜真空泵上海力辰邦西仪器科技有限公司LC-85DLC吸除废液及为轴突切断提供负压
D-葡萄糖 (U-13C6, 99%)剑桥同位素实验室CLM-1396代谢通量分析
DNase IRoche11284932001神经元培养
Dr.TOM2 平台 BGI Genomics执行并分析 RNA-seq 
电热鼓风干燥箱BIOM 华宏邦恩 / 华英博思DHG-9070APDMS 固化
电子天平上海华超工贸有限公司HC313常规物料称量
Fluoromount 水性封片剂Sigma-AldrichF4680免疫荧光
GlutaMAXGibco35050061培养基
甘氨酸SolarbioG8200免疫荧光
HBSSGibco14025092神经元培养
HBSS，无钙、无镁Gibco14175095神经元培养
高压蒸汽灭菌器斯泰克仪器（上海）有限公司HMJ-54A实验器材和培养基的灭菌
低氧培养舱STEMCELL Technologies27310低氧处理
ImageJNIH用于显微图像分析
Leica 显微镜徕卡显微系统 CMS 股份有限公司DMIL LED Fluo活细胞及荧光观察
活细胞成像溶液InvitrogenA14291DJ活细胞成像
医用低温储存箱 (-80 °C)青岛海尔生物医疗股份有限公司DW-86L388J在 -80 °C 长期保存样品
迷你台式真空泵海门麒麟贝尔仪器制造有限公司GL-805小规模真空应用
MitoTracker Orange CMTMRosInvitrogenM7510线粒体膜电位染色
MRMPROBS 程序Version 2.60用于提取原始质谱数据 
Neurobasal 培养基Gibco21103049培养基
无葡萄糖 Neurobasal-A 培养基GibcoA2477501培养基
木瓜蛋白酶WorthingtonLS003127神经元培养
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148细胞固定
PDMSDow CorningDC184器件制备
PDS 试剂盒抑制剂瓶WorthingtonLK003182神经元培养
青霉素-链霉素Gibco15140122培养基
磷酸盐缓冲液BiosharpBL302A稀释物质及清洗细胞容器
等离子清洗机Harrick PlasmaODC-32G-2表面活化
多聚赖氨酸（Poly-D-lysine）Sigma-AldrichP6407神经元培养
Prism GraphPadVersion 8.4.3统计分析
冷冻离心机Eppendorf AG（德国）5430R在控温条件下进行样品分离
RNArep Pure 细胞/细菌总 RNA 提取试剂盒天根dp430转录组学
转子流量计DwyerRMA-23-SSV控制低氧气体流速
体视显微镜奥林巴斯公司SZ2-ILST样品观察与解剖
Stuart 轨道摇床Kylin-BellTS-200以可调速度混合细胞培养物/溶液
Triton X-100Sigma-AldrichX100免疫荧光
ULVAC 旋片式真空泵ULVAC（宁波）有限公司GLD-N202为过滤/干燥提供真空环境
βIII-微管蛋白PromegaG7121免疫荧光

参考文献

  1. Namba, T., et al. Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex. Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).
  2. Donato, A., Kagias, K., Zhang, Y., Hilliard, M. A. Neuronal sub-compartmentalization: a strategy to optimize neuronal function. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (3), 1023-1037 (2019).
  3. Anderson, M. A., et al. Required growth facilitators propel axon regeneration across complete spinal cord injury. Nature. 561 (7723), 396-400 (2018).
  4. Hilton, B. J., Bradke, F. Can injured adult CNS axons regenerate by recapitulating development. Development. 144 (19), 3417-3429 (2017).
  5. Li, Y., et al. Microglia-organized scar-free spinal cord repair in neonatal mice. Nature. 587 (7835), 613-618 (2020).
  6. Hilton, B. J., et al. An active vesicle priming machinery suppresses axon regeneration upon adult CNS injury. Neuron. 110 (1), 51-69 (2022).
  7. Alizadeh, A., Dyck, S. M., Karimi Abdolrezaee, S. Traumatic spinal cord injury: An overview of pathophysiology, models and acute injury mechanisms. Front Neurol. 10, 441408(2019).
  8. Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 7533(2020).
  9. Zhao, P., et al. Microfluidic model to mimic initial event of neovascularization. J Vis Exp. (170), e62003(2021).
  10. Li, N., Sip, C., Folch, A. Microfluidic chips controlled with elastomeric microvalve arrays. J Vis Exp. (8), e296(2007).
  11. Chowdhury, A. N., et al. A customizable chamber for measuring cell migration. J Vis Exp. (121), e55264(2017).
  12. De Ninno, A., et al. Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments. J Vis Exp. (170), e61895(2021).
  13. Shahryari, V., et al. Pre-clinical orthotopic murine model of human prostate cancer. J Vis Exp. (114), e54125(2016).
  14. Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Microfluidic co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating soluble signal-mediated interactions. J Vis Exp. (38), e1749(2010).
  15. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  16. Liu, R., Zhou, B. Harmine promotes axon regeneration through enhancing glucose metabolism. J Biol Chem. 301 (3), 108254(2025).
  17. Shrirao, A. B., et al. Microfluidic platforms for the study of neuronal injury in vitro. Biotechnol. Bioeng. 115 (4), 815-830 (2018).
  18. Van Laar, V. S., Arnold, B., Berman, S. B. Primary embryonic rat cortical neuronal culture and chronic rotenone treatment in microfluidic culture devices. Bio Protoc. 9 (6), e3192(2019).
  19. Huang, N., et al. Reprogramming an energetic AKT-PAK5 axis boosts axon energy supply and facilitates neuron survival and regeneration after injury and ischemia. Curr Biol. 31 (14), 3098-3114 (2021).
  20. Zhou, B., et al. Facilitation of axon regeneration by enhancing mitochondrial transport and rescuing energy deficits. J Cell Biol. 214 (1), 103-119 (2016).
  21. Cartoni, R., et al. The mammalian-specific protein armcx1 regulates mitochondrial transport during axon regeneration. Neuron. 92 (6), 1294-1307 (2016).
  22. Han, S. M., Baig, H. S., Hammarlund, M. Mitochondria localize to injured axons to support regeneration. Neuron. 92 (6), 1308-1323 (2016).
  23. Yang, L. Q., Chen, M., Ren, D. L., Hu, B. Dual oxidase mutant retards mauthner-cell axon regeneration at an early stage via modulating mitochondrial dynamics in zebrafish. Neurosci Bull. 36, 1500-1512 (2020).
  24. Yuan, M., et al. Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by LC-MS/MS. Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).
  25. Mercimek, R., et al. On the effects of 3D printed mold material, curing temperature, and duration on polydimethylsiloxane (PDMS) curing characteristics for lab-on-a-chip applications. Micromachines (Basel). 16 (6), 684(2025).
  26. Derosa, B. A., et al. Convergent pathways in idiopathic autism revealed by time course transcriptomic analysis of patient-derived neurons. Sci Rep. 8 (1), 8423(2018).
  27. Cheng, X. T., Huang, N., Sheng, Z. H. Programming axonal mitochondrial maintenance and bioenergetics in neurodegeneration and regeneration. Neuron. 110 (12), 1899-1923 (2022).
  28. Huang, N., Sheng, Z. H. Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism. Cell Regen. 11 (1), 33(2022).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

轴突损伤模型多组学分析皮层神经元代谢重塑轴突再生转录组分析代谢通量分析PDMS微流控真空抽吸损伤
用于构建轴突损伤模型并实现多组学分析的微流控芯片
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。