用于轴突损伤模型的微流控芯片构建和实现多组学分析

摘要

该协议描述了一种微流体系统，该系统对轴突损伤后的神经元代谢动力学进行建模，从而实现内在代谢重塑的成像、多组学分析和机制研究。

摘要

神经元极化形成树突和轴突，实现细胞间通讯。轴突损伤会破坏这些连接并将损伤信号传递给体细胞，通常会导致神经元变性。因此，维持轴突稳态对于促进局部轴突再生和防止神经退行性变至关重要。这一过程依靠细胞代谢来提供能量和生物合成前体，并由调节代谢平衡和消除副产物的机制维持。然而，神经元代谢被划分为体细胞和轴突之间，并在 体内进一步 受到周围微环境的影响，例如星形胶质细胞衍生的代谢活动（例如，星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭）。这些因素使神经元内在代谢机制的研究变得复杂。为了应对这些挑战，我们开发了一个用于 在体外培养 原代皮质神经元的微流体平台，该平台保留 了在体内观察到的关键代谢特征，包括生理糖酵解通量和线粒体呼吸。该系统为研究轴突损伤后神经元的内在代谢重塑提供了一个简化的模型。传统的微流控芯片支持 体外 轴突损伤模型，并与活细胞成像、免疫荧光染色和缺氧治疗兼容。为了适应涉及数百万个细胞的大规模转录组学和代谢组学分析，我们进一步设计和制造了具有优化作方案的高通量微流控芯片。该装置具有交替排列的体细胞室和轴突室，通过微通道连接，通过从轴突室真空抽吸液体诱导轴突损伤。该平台能够快速评估代谢物和酶动力学，提高多组学研究的准确性和可重复性。

引言

神经元在发育过程中通过极化建立两种不同类型的具有特殊功能的突起，即轴突和树突 ^1,2。神经再生是指神经损伤后轴突再生的过程³，研究重点是中枢神经系统（CNS）修复。与周围神经系统不同，中枢神经系统的再生能力有限 ^4,5,6，^通常会导致脊髓损伤或创伤性脑损伤患者的持续功能障碍或永久性残疾 ^7,8。因此，制定增强中枢神经系统修复的策略并阐明轴突再生的潜在机制至关重要。

微流控设备作为集成、经济高效和高通量的体外培养系统，近年来在细胞和神经元研究中表现出显着的优势 ^9,10。与传统方法相比，微流控技术能够精确调节流体剪切应力、浓度梯度和空间结构，从而密切模拟真实的生理和病理微环境，促进细胞生长、迁移、分化和相互作用11,12,13,14。基于微流控的体外轴突损伤模型通过空间极化实现神经元细胞体和过程的区室培养，为探索神经元的内在再生能力及其损伤后的代谢适应提供了不可或缺的工具^{15,1 6,17,18}。它为了解神经元如何对损伤做出反应、调节代谢过程¹⁹ 和促进轴突再生提供了一个关键窗口²⁰。然而，现有的轴突损伤和代谢研究微流控平台仍面临挑战，包括神经元细胞产量低、代谢测量准确性降低以及缺乏标准化作程序。

针对这些局限性，本研究开发了一种新型的大规模微流控平台，能够实现轴突损伤的标准化、高通量诱导，并为分室多组学分析提供足够的细胞材料。这种集成设计直接直面了神经损伤研究中未满足的关键需求。具体来说，我们设计的微流控芯片具有体细胞和轴突室交替排列的特点，通过微槽连接，通过受控真空抽吸实现轴突横切。这种方法非常适合需要可重复、高通量轴突损伤模型和精确代谢分析的研究，例如研究轴突再生背后的代谢机制。与传统方法相比，该技术具有更高的通量、更高的代谢精度以及建立标准化损伤模型的能力。例如，先前的研究已经证明了线粒体转运在轴突再生中的重要性 20,21,22,23，而我们的平台进一步揭示了葡萄糖代谢在损伤后轴突再生中的作用。该协议建立了一个用于大规模轴切术和代谢分析的技术系统，该系统既可目视验证又可作标准化。

方案

所有实验均按照北京航空航天大学伦理委员会的指导方针进行，并经委员会批准（批准代码：BM20210060）。 图 1 概述了实验时间表。

1. 常规和大型微流控装置的设计

1. 使用 AutoCAD 设计微流体设备，以创建二维 （2D） 原理图和三维 （3D） 结构模型。
2. 使用这些设计在硅晶圆上制造具有 SU-8 负光刻的母模。
3. 通过铸造聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 复制主模，从而获得高精度、功能齐全的微流控芯片。
4. 将每个微通道设计为 5 μm 高，只允许轴突通过，同时阻断体细胞。
5. 使微通道宽 10 μm 以增加轴突容量。
6. 将腔室设计为高 120 μm，宽 220 μm，为神经元体细胞提供足够的空间。
7. 使用该微流体平台通过控制流体流动和神经元放置来模拟 体内 轴突损伤。
8. 使用该设备制备代谢组学和转录组学样品，以进行高精度细胞作，并实现高通量处理，以提高样品准确性和生物学有效性。

2. 常规和大型微流控装置的制造

1. 以 10：1 （w/w） 的比例称量 PDMS 碱和固化剂，然后将它们放入离心管中。
2. 将装有 PDMS 混合物的离心管放入离心搅拌器混合器中。在 2000 × g 下离心 4 分钟以混合，然后在 2000 × g 下再次离心 4 分钟以脱气。
3. 将13-15克脱气的PDMS倒入微流控模具中，确保模具底部完全覆盖。
4. 将模具放入真空干燥器中。使用真空泵排出空气 5-10 分钟，以彻底去除 PDMS 中的气泡。
5. 使用橡胶球轻轻敲击 PDMS 表面，以打破任何残留的表面气泡。
6. 将模具放入对流烤箱中，在80°C下烘烤100分钟以固化PDMS。
7. PDMS 完全固化后，将手术刀的尖端轻轻滑到 PDMS 边缘下方，小心地将其提起并与模具分离。
8. 使用直径为 2.0-2.5 毫米的活检冲头在 PDMS 上打孔，用于培养基输注和细胞上样。
9. 使用胶带去除 PDMS 上的任何表面杂质，然后将其放入干净的玻璃盘中并用铝箔包裹储存。
10. （可选）用氧等离子体（30 W，20 s）处理PDMS表面，然后将其压在另一个表面上以实现不可逆的结合。
11. 实验前，将微流控装置在121°C和101kPa下高压灭菌5分钟，以确保无菌。

3. 皮质神经元的制备

1. 麻醉3只出生后Sprague-Dawley（SD）大鼠（出生后12小时内），将它们放在冰上5分钟，然后迅速斩首。
2. 解剖大脑皮层的运动区域，并将组织置于预冷的解剖缓冲液中（例如，2mL不含钙和镁的HBSS）。
   注意：使用预冷溶液在冰上执行所有组织解剖程序。
3. 使用无菌剪刀将组织切成约 1 毫米³ 块，然后转移到 15 mL 离心管中。
4. 静置5分钟，然后小心地吸出上清液以去除残留的血液和缓冲液。
5. 将预热的木瓜蛋白酶溶液（1mg / mL）加入5mL含有钙和镁的HBSS中，并已加热至37°C。
6. 在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 40 分钟，每 10 分钟轻轻倒置试管 3 次。
7. 消化后，使用 200 μL 移液器轻轻研磨悬浮液 100 次。
   注意：避免引入气泡以防止细胞应激。
8. 以 300 × g 离心 3 分钟，然后弃去上清液。
9. 加入含有 1 mg/mL 蛋白酶抑制剂的终止溶液（例如，在 5 mL 含钙和镁的 HBSS 中加入 600 μL 木瓜蛋白酶解离系统试剂盒抑制剂小瓶）以重悬细胞。
10. 通过 40 μm 细胞过滤器过滤细胞悬液，并将滤液收集在新的离心管中。
11. 将滤液以200× g 离心10分钟，然后弃去上清液。
12. 将沉淀重悬于含有 2% B27 和 1% GlutaMAX 的 500 μL 完全神经元培养基中。
13. 计数细胞（约300万个/大鼠）并将密度调整为1×10⁶ 个细胞/ mL以备后续使用。

4. 涂层

注意：用聚-D-赖氨酸（PDL）溶液处理盖玻片或培养皿，以改善神经元粘附并为神经元生长创造最佳环境。

1. 盖玻片的涂层
   1. 将用于传统微流体装置（Φ25 mm，厚度 0.17 mm）的盖玻片放入 35 mm 培养皿中，并加入 2 mL 的 0.1 mg/mL PDL 溶液。
   2. 在37°C下孵育6小时或过夜。
   3. 孵育后，小心地取出PDL溶液以供重复使用或正确处置。
   4. 向培养皿中加入 2 mL 无菌超纯水，顺时针旋转 50 次，然后逆时针旋转 50 次（对于多个培养皿，在较大的培养皿中同时旋转它们）。
   5. 使用连接到无菌移液器吸头的真空泵吸出水，将废物收集在液体废物容器中。
   6. 总共重复洗涤程序（步骤 4.1.4-4.1.5）三次。
   7. 使用前让盖玻片在生物安全柜中自然风干。
2. 培养皿包衣
   1. 向培养皿或孔板中加入适量的 0.1 mg/mL PDL 溶液（例如，对于常规微流控，将 2 mL 添加到 35 mm 培养皿中，对于大型微流控，将 5 mL 添加到 10 cm 培养皿中）。
      注意： 确保生物安全柜在无菌气流下正常运行，以防止污染。
   2. 确保溶液完全覆盖底部，并在 37°C 下孵育 6 小时或过夜。
   3. 回收PDL溶液后，如步骤4.1.4所述，用适量无菌超纯水洗涤培养皿3次。
   4. 除去所有残留的超纯水，并在层流罩中风干培养皿以备后用。

5.神经元培养基的制备

1. 为常规神经元培养制备完整的培养基。
   1. 从一次性 50 mL 注射器中取出柱塞。将注射器橡胶头朝上放在生物安全柜内的洁净工作台上。
   2. 将 500 μL 青霉素链霉素 （PS）、1 mL B27、125 μL GlutaMAX 和 500 μL 胎牛血清 （FBS） 依次加入注射器中。更换每个组分的移液器吸头以避免交叉污染。
      注意：按指定顺序添加每个组件以保持一致性。
   3. 取一个新的无菌 50 mL 离心管。将其标记为“Neurobasal-A （NBA） + 2% B27 + 0.25% GlutaMAX + 1% FBS + 1% PS”。
      注意：如果不是胚胎神经元，请使用 NBA;将神经基底 （NB） 用于胚胎神经元。
   4. 将 0.22 μm 注射器过滤器连接到注射器的末端。
      注意： 确保过滤器与注射器紧密连接，以防止泄漏。
   5. 使用 NBA 向注射器填充高达 50 mL 的液体，包括添加剂的体积。重新安装柱塞。
   6. 以大约 2 mL/s 的速度缓慢推动柱塞，将液体过滤到标记的离心管中。
   7. 拧紧离心管的盖子。将试管倒置 3-5 次以混合培养基。
2. 含有[^U-13C₆]-葡萄糖的完整培养基（用于代谢通量分析）：对于受损神经元中葡萄糖代谢的代谢通量分析，使用无糖NBA制备含有[^U-13C₆]-葡萄糖的完整培养基。
   1. 使用无葡萄糖NBA作为基础溶液，在过滤前加入[^U-13C₆]-葡萄糖至终浓度为25 mM（如果[^U-13C₆]-葡萄糖为固体，请提前计算并称重）。按照相同的顺序添加其他组分以及过滤和混合步骤，如第 5.1 节所述。

6. 细胞计数

1. 用 75% 乙醇彻底擦拭血细胞计数器。在继续之前，请确保所有表面完全干燥。
2. 将 90 μL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 缓冲液加入 1.5 mL 无菌离心管中。
3. 通过上下移液3-5次轻轻重悬收集的神经元细胞悬液，以确保彻底混合。
4. 使用 10 μL 移液器，将 10 μL 混合细胞悬液转移到含有 90 μL PBS（1：10 稀释）的离心管中。
5. 使用 200 μL 移液器轻轻混合溶液 10 次，确保不形成气泡。
6. 用新的 10 μL 吸头更换移液器吸头。抽取 10 μL 混合物并将其添加到血细胞计数器的样品室中。
7. 将血细胞计数器放在显微镜载物台上，并使用 20 倍物镜进行聚焦。找到中央的 4 × 4 网格，并按照标准血细胞计数器规则对所有 16 个方格中的细胞进行计数。
8. 记录所有 16 个方格的总单元格计数。使用以下公式计算细胞浓度：（总数 × 10）× 10⁴ 个细胞/mL。
   注意： 始终在配备适当个人防护设备的生物安全柜中工作。

7. 在常规或大型微流控设备中进行皮质神经元的 体外 培养

1. 协议 A（传统微流体设备）。
   1. 验证 35 mm 培养皿中的玻璃表面是否完全干燥。
   2. 使用无菌细尖镊子，将高压灭菌的微流控芯片放置在玻璃表面的中心，微通道朝下。
   3. 使用 200 μL 移液器吸头将芯片轻轻压在玻璃表面上，以确保完全粘附。
   4. 使用永久性记号笔用点 （·） 标记左腔室以指定体细胞隔室。
   5. 使用 10 μL 移液器吸出 10 μL 神经元悬液（1000 万个细胞/mL）。
   6. 将悬浮液慢慢分配到标记的 soma 隔间上方的装载口中。
   7. 确认流体正确流入左腔室的下储液罐。
   8. 将培养皿转移到加湿的培养箱（37°C，5%CO₂）中20分钟。
   9. 从培养箱中取出培养皿。
   10. 使用20×相差显微镜，确认通过微通道从体细胞室到轴突室的培养基灌注。
   11. 将 150 μL 神经元基础培养基添加到轴突隔室（右室）的上部端口中，允许重力驱动的流动到下部储液器。
   12. 类似地，将 15 μL 完全神经元培养基添加到体细胞室（左室）的上端口中。
       注意：在这个阶段，神经元应该明显粘附，大多数细胞碎片被冲入下孔。培养过程中不要更换培养基;使用单次添加的完整神经元培养基，如步骤 5.1.3 中所述。
   13. 将 20 mL 超纯水倒入 150 mm 培养皿中以形成湿度室。将 35 毫米培养皿放入大培养皿内。
   14. 将整个培养系统转移到培养箱中并维持所需的持续时间（例如，7 天）。
       注意：在生物安全柜中的无菌条件下执行所有细胞培养程序。穿戴适当的个人防护装备（实验室外套和手套）。在手术前后对工作表面进行净化。
2. 协议 B（大规模微流控芯片）。
   注意：遵循常规规范的标准方案进行了两次修改。
   1. 使用 10 厘米培养皿放置设备。
   2. 根据实验需要选择全通道或间隔通道播种，因为每种方法都需要不同的轴突损伤方案。
   3. 接种完成后，将5mL完全神经元培养基加入10cm培养皿中，以维持神经元生长。
   4. 将 20 mL 超纯水加入 150 mm 大培养皿中，形成湿度室。然后，将 10 厘米的盘子放入大盘子内。
   5. 与步骤 7.1.14 相同。

8. 在传统微流控器件中建立 体外 轴突损伤模型

1. 将微流控装置的左侧标记为体细胞室（如“·”标记所示），将右侧标记为轴突末端室。
2. 将皮质神经元接种到体细胞室中。
3. 在 体外培养 神经元直至第 7 天 （DIV7），使轴突通过微通道延伸至轴突末端室。
4. 在DIV7，在轴突末端室中进行轴突损伤程序，以建立 体外 轴突损伤模型。
5. 取适量NBA培养基，转移到新的15mL离心管中备用。
6. 在指定时间内在微流体装置中培养皮质神经元。然后将设备转移到干净的工作台上。
7. 使用无绒纸擦干 35 毫米培养皿的底部。使用 200 μL 移液器从微流控装置的两个右侧孔中吸出培养基。
8. 将真空泵管连接到无菌、无过滤器的 200 μL 移液器吸头，打开真空泵（抽吸速率 60 L/min），并将吸头对准轴突末端室的下孔和腔室之间的连接点以吸出旧介质（此时，轴突因负压而断裂）。
9. 更换 200 μL 移液器吸头并抽取 150 μL NBA，通过右腔室的下孔缓慢添加。
   注意：如果液体流动太慢并形成气泡，请迅速将液体从尖端排出以快速填充腔室。
10. 交替使用两个右侧孔添加液体：每次添加 NBA 后，立即使用真空泵从另一个孔中吸出液体以切断轴突。重复此作4次，最后一次抽吸后，更换为新鲜的完整神经元培养基。
11. 从细胞体侧孔中吸出旧培养基，并添加含有药物的新鲜完全神经元培养基（如果需要）。
12. 将微流控装置与培养皿一起放入150mm培养皿中，并继续培养指定时间（例如，24小时）。
    注意：轴突损伤手术需要NBA培养基，因为神经元完全培养基会产生影响切断效果的气泡。

9.大规模微流控装置轴突损伤

1. 方法一：手动轴突损伤。
   1. 将神经元播种到微流体装置的所有腔室中。
   2. 将装置在37°C下在含有5%CO₂ 的加湿培养箱中孵育三天，然后取出整个微流体装置。
      注意：为避免机械应力或长入微通道的轴突撕裂，请移除DIV3而不是DIV7处的微流体装置。如果实验设计包括未受损的对照组，这一点尤其重要。
   3. 在DIV7，从培养箱中取出含有微流控装置的培养皿，并将其置于无菌台上。
   4. 准备20倍放大倍率的显微镜，并用75%乙醇对工作区域进行灭菌。
   5. 握住 10 μL 无菌过滤移液器吸头，并在显微镜引导下识别原始微通道中的轴突束。
   6. 使用移液器吸头沿每个轴突束进行纵向划痕。
   7. 刮擦后在显微镜下实时观察轴突断裂情况。
      注意：处理活神经元时，请戴上丁腈手套并在紫外线灭菌的实验室环境中工作
2. 方法二：真空辅助轴突损伤。
   1. 在大幅面微流控装置中交替播种皮质神经元。
   2. 打开真空泵并将其设置为 60 L/min。
   3. 使用无菌移液器吸头将真空泵管的末端连接到轴突室端口。
   4. 通过传统的微流体方案施加真空压力，完全切断轴突。
   5. （可选）为了特异性收集受伤的轴突，在轴切术后的规定时间点，使用真空泵（抽吸速率为60 L / min）快速吸出细胞体室的内容物以去除细胞体，从而仅将轴突留在微通道内。

10. 常规或大型微流控装置的缺氧处理

1. 在常氧条件下（37°C，5%CO₂）在微流体装置和培养物中接种原代神经元直至DIV7。
2. 将微流体装置置于缺氧培养箱室中，并向其供应由1%O_2,5%CO₂和平衡N₂组成的气体混合物。
3. 使用转子流量计控制气体流量并将其设置为 25 L/min。
4. 冲洗腔室 5 分钟以排出空气。
5. 在夹紧缺氧室入口的同时，关闭出口减压阀。
6. 夹住缺氧室的出口管，最后，将气瓶阀门关闭。
7. 将微流控装置在3°C的缺氧室中孵育1小时。

11. 使用大型微流控装置进行组学分析的体 外 培养神经元的样品制备

1. 转录组学样品。
   1. 轴突损伤完成后 6 小时，将带有受损轴突的微流控装置转移到层流罩中。
   2. 丢弃旧培养基后，用无菌PBS洗涤神经元细胞2-3次。
   3. 使用标准 RNA 提取试剂盒根据制造商的说明分离和纯化 RNA。
   4. 进行 RNA 测序。对获取的测序数据进行后续生物信息学分析。
2. 用于代谢通量分析的样品。
   注意：为了使用大型微流体设备监测损伤后神经元中葡萄糖代谢通量的变化，我们采用了[^U-13C₆]-葡萄糖追踪代谢通量分析²⁴。制备用于LC-MS分析的样品的方案如下：
   1. 使用P0 SD大鼠幼崽进行实验。解剖皮质神经元并在 体外 短期（DIV5-DIV7）或长期（DIV15-DIV30）培养它们。
   2. 对于年轻 （DIV5-DIV7） 和成熟 （DIV15-DIV30） 神经元，建立损伤组和未损伤对照组。
   3. 用含有25mM [^U-13C₆]-葡萄糖（不含葡萄糖的Neurobasal-A，1%FBS，2%B27,25mM [^U-13C₆]-葡萄糖）代替培养基，并在37°C下孵育4小时。
      注意：为避免培养基交换过程中渗透或pH值变化引起的神经元应激和细胞死亡，请在接种时制备在含有25mM [^U-13C₆]-葡萄糖的培养基中培养的附加神经元，并使用该培养基进行交换。
   4. 用5mL预热的HBSS（含钙和镁）轻轻冲洗两次后，将样品在液氮中快速冷冻并储存在-80°C。
      注意：处理液氮时，请戴丁腈手套和实验室外套。

12. 基于常规和大型微流控设备的神经元免疫荧光染色

注意：当使用微流体装置在 体外 培养神经元时，必须考虑在拆卸这些装置进行活细胞固定过程中可能发生的对微通道内神经元轴突的潜在损伤。

1. 使用微废物真空泵从微流控装置的四个孔中取出培养基。
   注意：在整个免疫荧光染色过程中将液体保持在两个腔室中。抽吸参数不应太高（2.5 L/min 为最佳），以避免损伤或吸出神经元细胞体和轴突。
2. 向微流控装置的两个上孔中的每一个加入 100 μL 1x PBS（PBS 将自然流向下孔）。
3. 更换真空泵末端的无过滤器吸头，从下孔吸出 PBS，然后重复该过程 3 次。在最后一次迭代中，从四个孔中吸出所有PBS。
4. 向两个上孔中的每一个加入 150 μL 4% 多聚甲醛 （PFA） 溶液，并在室温下固定 10-15 分钟。
   注意：避免在活细胞固定过程中拆卸设备，以保持神经元结构完整性。这种方法有助于更清楚地区分神经元体细胞和轴突的位置。
5. 用 1x PBS 洗涤 3 次，然后将神经元与含有 5% 山羊血清、0.3 M 甘氨酸、2% 牛血清白蛋白 （BSA）、PBS 和 0.1%（或 0.5%） Triton X-100 的封闭缓冲液孵育 1 小时。
6. 在封闭缓冲液中稀释一抗（例如，βIII-微管蛋白，小鼠，1：2000），向左上孔加入100μL，向右上孔加入50μL，并在4°C下与神经元孵育过夜。
7. 吸出一抗后，如步骤12.2-12.3所述，用1x PBS洗涤3次。然后，如步骤12.6所述，将用封闭缓冲液制备的二抗加入微流控装置的上孔中，并在黑暗中孵育30分钟（必要时用铝箔覆盖）。
8. 用 1x PBS 洗涤 3 次后，用超纯水冲洗一次。小心地使用弯曲的镊子从微流体装置的右上角抓住并取出设备。
9. 向培养皿中加入 1 mL PBS，以将大盖玻片与培养皿分离。
10. 使用移液器抽取 15 μL 封固剂，并将其滴到盖玻片指定位置的盖玻片上。
11. 轻轻地将细胞侧降低到封固剂上，放置盖玻片，并去除多余的液体。
12. 让封片介质在室温下完全干燥。
13. 一旦封片介质在室温下干燥，使用转盘共聚焦显微镜进行成像。
14. 选择 20 倍空气物镜，将曝光时间设置为每帧 100-200 毫秒，并将激光功率设置为最大值的 5-10%，绿色荧光蛋白 （GFP） 激发为 488 nm，红色荧光蛋白 （RFP） 激发为 561 nm。

13. 传统微流控设备中的活细胞成像

1. 在微流体装置中培养皮质神经元直至DIV7。
2. 根据制造商的说明制备活细胞染料（例如，线粒体膜电位探针）。
3. 在预热（37°C）神经元维持培养基中稀释染料。
4. 将染料溶液装入微流控装置的体细胞室中。
5. 在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 30 分钟。
6. 用 3 mL 预热 （37°C） 含有钙和镁的 HBSS 轻轻清洗隔室 3 次。
7. 在微流控芯片中加入无酚红活细胞成像溶液。
8. （可选）包括 GlutaMAX （0.25%） 和 B27 （2%） 用于延长成像。
9. 将微流控芯片放在显微镜载物台上，体细胞室在左侧，轴突末端室在右侧。
10. 在物镜中加入一滴浸油，确保油与芯片下方的盖玻片接触。
11. 使用 40 倍物镜，曝光时间为 150 毫秒，最大激光功率为 10-15% 进行成像。
    注意：根据染料光稳定性调整这些参数。

14. 数据分析

1. 使用 ImageJ 软件分析显微镜图像。使用生物分析仪评估 RNA 质量。使用适当的平台执行和分析 RNA-seq。
2. 对于代谢组学研究，使用 MRMPROBS 程序（2.60 版）提取原始质谱数据，并收集有关已鉴定代谢物的信息，包括同位素详细信息和峰面积。
3. 使用 GraphPad Prism（版本 8.4.3）进行所有统计分析。将数据呈现为SEM±平均值。使用未配对双尾t检验或Mann-Whitney检验进行组比较，并应用双向方差分析进行组内多个时间点之间的比较（显著性：ns，不显著;*p < 0.05;**p < 0.01;***p < 0.001）。

结果

为了建立研究皮质神经元代谢调节机制的综合研究平台，我们首先在传统的微流控装置中培养皮质神经元，精确控制轴突沿微通道的生长（图2A）。通过适当的设计，微通道的高度较低（5μm）和宽度较大（10μm），允许每个通道容纳更多的轴突，而不允许细胞体进入。βIII-微管蛋白的免疫荧光染色证实轴突通过微通道生长到轴突末端室（图2B）。为了进一步确定轴突损伤是否影响神经元存活，我们定量分析了轴突损伤前后的神经元密度。结果表明，轴突损伤后的神经元密度没有显着差异，表明轴突损伤不会导致明显的神经元死亡（图2C）。为了满足多组学分析的样本量要求（通常每个样品约3×10⁶个细胞），我们开发了一种具有可扩展布局和三维结构的大型微流控装置，确保实验数据准确（图3A-C）。P...

讨论

建立用于研究轴突损伤和再生的先进体外模型对于揭示神经元修复中涉及的分子和代谢机制至关重要^16,19。在这项研究中，我们提出了一种标准化工作流程，该工作流程集成了微流体设备、大规模神经元培养和精确的轴突损伤方案，从而能够对受伤的皮质神经元进行稳健的多组学分析。

这种方法的成功在很大程度上依赖于几个关键的程序步骤。在微流控芯片制备中，精确控制PDMS固化时间（80°C下100-120分钟）和灭菌时间（5-10分钟）对于防止芯片过度硬化以及随后的滑移或泄漏问题至关重要²⁵。此外，轴切术期间真空泵的准确参数设置至关重要：过度抽吸会损伤神经元体细胞，而抽吸不足可能导致轴突切断不完全。值得注意的是，传统设备和大型设备都是使用相同的协议制造的。主要区别在于模具的设计以及固化后的冲孔位置和直径。对于传统的微流控装置，孔的直径为5 mm，而对于大型微流...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal-A 培养基	吉布科	10888022	培养基
Alexa Fluor 488 山羊防鼠	Invitrogen	型号：A-21042	免疫荧光
分析天平	上海顺宇恒平科学仪器有限公司	FA1004型	精确称量试剂/样品
B27 （50 倍）	吉布科	17504044	培养基
BCA蛋白测定	博斯特	AR1189	蛋白质浓度
生物分析仪	安捷伦	https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
牛血清白蛋白	捷威	FA016型	免疫荧光
离心搅拌搅拌机	想	ARE-310型	混合 PDMS 和脱气
CLARIOstarPlus-ACU 分析仪	BMG 实验室技术	克拉里奥斯塔 Plus	蛋白质浓度
CO2培养箱	赛默飞世尔科技（阿什维尔）有限责任公司	3111	细胞培养在37°C下孵育;C，5% CO？
耐腐蚀隔膜真空泵	上海立辰邦西仪器科技有限公司	LC-85DLC	吸出废液并为轴切术提供抽吸
D-葡萄糖 （U-13C6， 99%）	剑桥同位素实验室	CLM-1396	代谢通量
DNase I	罗 氏	11284932001	神经元培养
Dr.TOM2平台	华大基因组学		进行和分析RNA-seq
电动热风烘箱	BIOM 华虹波恩 / 华英博思	DHG-9070A	固化 PDMS
电子天平	Shanghai Huachao Industrial Co., Ltd.	HC313型	物料的常规称重
氟管水封片剂	西格玛-奥尔德里奇	F4680型	免疫荧光
谷氨酸MAX	吉布科	35050061	培养基
甘氨酸	索拉生物	G8200型	免疫荧光
哈佛商学院	吉布科	14025092	神经元培养
HBSS，无钙，无镁	吉布科	14175095	神经元培养
高压蒸汽灭菌器	STIK 仪器（上海）有限公司	HMJ-54A型	实验室设备和培养基的灭菌
缺氧室	干细胞技术	27310	缺氧治疗
图像J	美国国立卫生研究院		用于分析显微镜图像
徕卡显微镜	徕卡显微系统 CMS 有限公司	DMIL LED 荧光灯	实时和荧光观察
活细胞成像解决方案	Invitrogen	A14291DJ	活细胞成像
医用低温收纳盒（-80°C;C)	青岛海尔生物医药有限公司	DW-86L388J型	样品长期储存在-80°C;C
迷你台式真空泵	海门麒麟贝尔仪器制造有限公司	GL-805型	小规模真空应用
MitoTracker 橙色 CMTMRos	Invitrogen	型号M7510	线粒体膜电位染色
MRMPROBS 程序		版本 2.60	提取原始质谱数据
神经基础培养基	吉布科	21103049	培养基
不含葡萄糖的 Neurobasal-A	吉布科	A2477501	培养基
木瓜 蛋白酶	沃辛顿	LS003127	神经元培养
多聚甲醛	西格玛-奥尔德里奇	第 6148 页	细胞固定
PDMS的	道康宁	DC184型	设备制造
PDS 试剂盒抑制剂样品瓶	沃辛顿	LK003182	神经元培养
青霉素链霉素	吉布科	15140122	培养基
磷酸盐缓冲盐水	生物夏普	BL302A	稀释物质并清洁细胞容器
等离子清洗机	哈里克等离子体	ODC-32G-2型	激活
聚D-赖氨酸	西格玛-奥尔德里奇	第 6407 页	神经元培养
棱镜	图形板	版本 8.4.3	统计分析
冷冻离心机	Eppendorf AG（德国）	5430R型	在受控温度下分离样品
RNArep 纯细胞/细菌总 RNA 提取试剂盒	天根	DP430	转录组学
转子流量计	德怀尔	RMA-23-SSV型	控制低氧流量
体视显微镜	奥林巴斯公司	SZ2-ILST	样本观察和解剖
斯图尔特轨道振动器	麒麟贝尔	TS-200型	以可调速度混合细胞培养物/溶液
海卫一 X-100	西格玛-奥尔德里奇	100倍	免疫荧光
ULVAC 旋片真空泵	ULVAC （宁波）有限公司	GLD-N202型	为过滤/干燥创造真空
βIII-微管蛋白	普罗梅加	G7121	免疫荧光