用于构建轴突损伤模型并实现多组学分析的微流控芯片

摘要

本方案描述了一种用于模拟轴突损伤后神经元代谢动态的微流控系统，可实现成像、多组学分析以及内在代谢重塑的机制研究。

摘要

神经元通过极化形成树突和轴突，从而实现细胞间通讯。轴突损伤会破坏这些连接，并将损伤信号传递至胞体，常导致神经元变性。因此，维持轴突稳态对于促进局部轴突再生及防止神经变性至关重要。该过程依赖细胞代谢提供能量和生物合成前体，并由调节代谢平衡及清除代谢副产物的机制维持。然而，神经元代谢在胞体与轴突之间具有区室化特征，且进一步受到其他因素影响 在体内 由周围微环境因素所影响，例如星形胶质细胞来源的代谢活动（如星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭）。这些因素使得神经元内在代谢机制的研究变得复杂。为应对这些挑战，本文建立了一种用于培养原代皮层神经元的微流控平台 体外 保留所观察到的关键代谢特征 体内，包括生理性糖酵解通量和线粒体呼吸。该系统为研究轴突损伤后神经元内在的代谢重塑提供了一个简化的模型。传统的微流控芯片支持 体外 轴突损伤模型，且兼容活细胞成像、免疫荧光染色和缺氧处理。为满足涉及数百万细胞的大规模转录组学和代谢组学分析需求，我们进一步设计并制备了高通量微流控芯片，并优化了操作流程。该装置具有交替排列的胞体室和轴突室，二者通过微通道连接，轴突损伤通过抽吸轴突室内的液体产生负压实现。该平台可快速评估代谢物和酶的动力学变化，提升多组学研究的准确性和可重复性。

引言

神经元在发育过程中通过极化形成两种具有特殊功能的突起：轴突和树突^1,2。神经再生是指神经损伤后轴突重新生长的过程³，其研究重点在于中枢神经系统（CNS）的修复。与周围神经系统不同，中枢神经系统再生能力有限^4,5,6，常导致脊髓损伤或创伤性脑损伤患者出现持续性功能障碍或永久性残疾^7,8。因此，开发促进中枢神经系统修复的策略，并阐明轴突再生的潜在机制至关重要。

微流控装置，作为集成化、低成本且高通量的 体外 培养系统，近年来在细胞与神经元研究中展现出显著优势^9,10与传统方法相比，微流控技术能够精确调控流体剪切应力、浓度梯度和空间结构，从而更真实地模拟生理和病理微环境，促进细胞的生长、迁移、分化及相互作用^11,

方案

所有实验均按照北京航空航天大学伦理委员会的指南进行，并获得了该委员会的批准（批准编号：BM20210060）。图1概述了实验时间线。

1. 传统与大规模微流控装置的设计

1. 使用 AutoCAD 设计微流控装置，以创建二维（2D）示意图和三维（3D）结构模型。
2. 使用这些设计通过SU-8负性光刻技术在硅晶圆上制备主模具。
3. 通过浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制母模，制备出高精度、功能化的微流控芯片。
4. 将每个微通道设计为高5 µm，仅允许轴突通过，同时阻挡胞体。
5. 将微通道制作为10 µm宽，以增加轴突容量。
6. 将腔室设计为高120 µm、宽220 µm，以提供足够的空间容纳神经元胞体。
7. 使用该微流控平台进行模拟 体内 通过控制流体流动和神经元定位来实现轴突损伤。
8. 使用高精度细胞操作装置制备代谢组学和转录组学样本，并实现高通量处理，以提高样本的准确性和生物学有效性。

2. 传统及大规模微流控器件的制备

1. 按10:1（w/w）的质量比称取PDMS基底和固化剂，放入离心管中。
2. 将含有PDMS混合物的离心管置于离心搅拌混合器中，在2000 ×

结果

为了建立一个用于研究皮层神经元代谢调控机制的综合性研究平台，我们首先在传统的微流控装置中培养皮层神经元，精确控制轴突沿微通道生长（图2A）。通过合理的设计，微通道具有较低的高度（5 µm）和较大的宽度（10 µm），使得每个通道能够容纳更多的轴突，同时阻止细胞体进入。βIII-微管蛋白的免疫荧光染色证实了轴突通过微通道生长至轴突终末室（图2B）。为进一步确定轴突损伤是否影响神经元存活，我们定量分析了轴突损伤前后神经元的密度。结果显示，轴突损伤后神经元密度无显著差异，表明轴突损伤未导致明显的神经元死亡（图2C）。为满足多组学分析所需的样本量（通常每样本约3 × 10⁶个细胞），我们开发了一种具有可扩展布局和三维结构的大规模微流控装置，以确保实验数据的准确性（图3A–C.......

讨论

建立用于研究轴突损伤与再生的先进体外模型，对于揭示神经元修复过程中涉及的分子与代谢机制至关重要^16,19。在本研究中，我们提出了一种标准化的工作流程，该流程整合了微流控装置、大规模神经元培养以及精确的轴突损伤方案，能够对受损皮层神经元进行可靠的多组学分析。

该方法的成功在很大程度上依赖于若干关键的操作步骤。在微流控芯片制备过程中，精确控制PDMS的固化时间（80 °C下100–120分钟）和灭菌时间（5–10分钟）至关重要，以防止芯片过度硬化，从而避免后续出现滑脱或泄漏问题²⁵。此外，轴突切断过程中真空泵的参数设置必须准确：吸力过大可能损伤神经元胞体，而吸力不足则可能导致轴突切断不完全。值得注意的是，常规装置和大规模装置均采用相同的制备流程，主要区别在于模具设计以及固化后打孔的位置和直径。对于常规微流控装置，通孔直径为5 mm；而对于大规模微流控装置，通孔直径为3 mm。另一个关键的操作细节是在轴突切.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal-A 培养基	Gibco	10888022	培养基
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠	Invitrogen	A-21042	免疫荧光
分析天平	上海舜宇恒平科学仪器有限公司	FA1004	试剂/样品的精确称量
B27 (50x)	Gibco	17504044	培养基
BCA 蛋白检测试剂盒	Boster	AR1189	蛋白质浓度测定
Bioanalyzer	Agilent	https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
牛血清白蛋白	Genview	FA016	免疫荧光
离心搅拌脱气混合器	THINK	ARE-310	混合 PDMS 并进行脱气
CLARIOstarPlus-ACU 分析仪	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus	蛋白质浓度测定
CO2 培养箱	赛默飞世尔科技（阿什维尔）有限责任公司	3111	细胞培养，37 °C，5% CO?
耐腐蚀隔膜真空泵	上海力辰邦西仪器科技有限公司	LC-85DLC	吸除废液及为轴突切断提供负压
D-葡萄糖 (U-13C6, 99%)	剑桥同位素实验室	CLM-1396	代谢通量分析
DNase I	Roche	11284932001	神经元培养
Dr.TOM2 平台	BGI Genomics		执行并分析 RNA-seq
电热鼓风干燥箱	BIOM 华宏邦恩 / 华英博思	DHG-9070A	PDMS 固化
电子天平	上海华超工贸有限公司	HC313	常规物料称量
Fluoromount 水性封片剂	Sigma-Aldrich	F4680	免疫荧光
GlutaMAX	Gibco	35050061	培养基
甘氨酸	Solarbio	G8200	免疫荧光
HBSS	Gibco	14025092	神经元培养
HBSS，无钙、无镁	Gibco	14175095	神经元培养
高压蒸汽灭菌器	斯泰克仪器（上海）有限公司	HMJ-54A	实验器材和培养基的灭菌
低氧培养舱	STEMCELL Technologies	27310	低氧处理
ImageJ	NIH		用于显微图像分析
Leica 显微镜	徕卡显微系统 CMS 股份有限公司	DMIL LED Fluo	活细胞及荧光观察
活细胞成像溶液	Invitrogen	A14291DJ	活细胞成像
医用低温储存箱 (-80 °C)	青岛海尔生物医疗股份有限公司	DW-86L388J	在 -80 °C 长期保存样品
迷你台式真空泵	海门麒麟贝尔仪器制造有限公司	GL-805	小规模真空应用
MitoTracker Orange CMTMRos	Invitrogen	M7510	线粒体膜电位染色
MRMPROBS 程序		Version 2.60	用于提取原始质谱数据
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049	培养基
无葡萄糖 Neurobasal-A 培养基	Gibco	A2477501	培养基
木瓜蛋白酶	Worthington	LS003127	神经元培养
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	细胞固定
PDMS	Dow Corning	DC184	器件制备
PDS 试剂盒抑制剂瓶	Worthington	LK003182	神经元培养
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	培养基
磷酸盐缓冲液	Biosharp	BL302A	稀释物质及清洗细胞容器
等离子清洗机	Harrick Plasma	ODC-32G-2	表面活化
多聚赖氨酸（Poly-D-lysine）	Sigma-Aldrich	P6407	神经元培养
Prism	GraphPad	Version 8.4.3	统计分析
冷冻离心机	Eppendorf AG（德国）	5430R	在控温条件下进行样品分离
RNArep Pure 细胞/细菌总 RNA 提取试剂盒	天根	dp430	转录组学
转子流量计	Dwyer	RMA-23-SSV	控制低氧气体流速
体视显微镜	奥林巴斯公司	SZ2-ILST	样品观察与解剖
Stuart 轨道摇床	Kylin-Bell	TS-200	以可调速度混合细胞培养物/溶液
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	免疫荧光
ULVAC 旋片式真空泵	ULVAC（宁波）有限公司	GLD-N202	为过滤/干燥提供真空环境
βIII-微管蛋白	Promega	G7121	免疫荧光