方法文章

评估SHIP缺陷型小鼠克罗恩病样回肠炎及纤维化模型中的治疗干预

DOI：

10.3791/68928

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2025年10月14日

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1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案展示了如何利用含有Src同源2结构域的5'-肌醇磷酸酶（SHIP）缺陷型小鼠模型，该模型可模拟克罗恩病（CD）样的回肠炎症和纤维化，用于测试针对克罗恩病的新型治疗方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

克罗恩病（CD）是一种慢性、反复发作的炎症性疾病，其特征为节段性、透壁性炎症，可累及胃肠道的任何部位。CD 的一个显著特征是肠道屏障功能受损，而肠道纤维化则是常见的并发症。SHIP 缺陷型（SHIP-/-）小鼠会自发出现肠道屏障功能障碍、回肠炎症及纤维化病变，重现了类似克罗恩病性回肠炎的关键特征。SHIP-/- 小鼠因此成为在克罗恩病研究中测试抗炎和抗纤维化疗法的重要模型。

本文介绍了在此模型中评估治疗干预措施的方法，并以地塞米松作为有效疗法的示例。我们提供了一套逐步操作的方案，用于表征疾病特征及治疗反应，包括通过FITC-葡聚糖测定法进行的肠道通透性体内评估，以及大体病理学检查和详细的组织学分析。组织学评估包括采用苏木精和伊红（H&E）染色检测炎症、Masson三色染色检测纤维化，以及阿利新蓝/过碘酸-雪夫（PAS）染色评估杯状细胞增生和肥大。此外，通过定量回肠组织中的细胞因子和炎症标志物来评估炎症状态。上述方法共同构成了在模拟克罗恩病回肠炎的SHIP-/-小鼠模型中评价治疗效果的综合框架。本方案广泛适用于研究肠道炎症、黏膜愈合及肠纤维化的科研人员。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

炎症性肠病（IBD）主要有两种类型：克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），二者均以慢性胃肠道（GI）炎症为特征，病程可表现为反复发作与缓解或持续进展1。尽管IBD传统上被认为是西方国家的疾病，但其在南美洲、亚洲和非洲等发展中国家的发病率正在迅速上升2。与此同时，北美、欧洲和澳大利亚的患病率也持续升高，1990年至2019年间，发病率和患病率均增长了近50%，凸显了IBD日益加重的全球健康负担2,3。尽管已有大量研究投入，IBD的根本病因仍不明确。目前的证据表明，遗传易感性、免疫系统功能障碍以及包括微生物组改变在内的环境因素之间存在复杂的相互作用4,5。

克罗恩病（CD）与溃疡性结肠炎（UC）之间存在关键差异。在UC中，炎症局限于结肠，表现为仅累及黏膜层的连续性病变6,7。相比之下，CD的特征是透壁性、节段性炎症，可累及胃肠道的任何部位，最常见于回肠末端6,7。CD的标志性并发症之一是肠纤维化，其可导致狭窄形成和肠梗阻8。纤维化表现为细胞外基质成分（如胶原蛋白）过度沉积以及肠壁肌层增厚9,10。约30%的CD患者在确诊后10年内会发展为狭窄型疾病11。目前尚无直接靶向纤维化的治疗方法，这一未被满足的临床需求可能通过合适的临床前模型来研究该并发症而得以解决9,12。

为了更好地理解炎症性肠病（IBD）的发病机制并促进新疗法的开发，研究人员已建立了多种小鼠模型12。尽管存在大量结肠炎模型，但仅有少数能够模拟回肠炎症及克罗恩病（CD）相关的纤维化12。其中包括本文所述的含 Src 同源 2 结构域的 5'-肌醇磷酸酶缺陷型（SHIP-/-）小鼠，以及 SAMP1/YitFc 小鼠 和 TnfΔARE 小鼠。这些模型共同反映了人类克罗恩病的复杂性，因为每种模型均由不同的细胞和分子机制驱动。SAMP1/YitFc 小鼠的疾病源于影响上皮屏障功能和免疫调节的多基因易感性13,14，而 TnfΔARE 小鼠则携带肿瘤坏死因子（TNF）mRNA 中 AU 富集元件的缺失，导致 mRNA 稳定性增加和 TNF 过度产生15,16。尽管这些模型具有重要价值，但仍存在局限性。SAMP1/YitFc 模型繁殖效率较低，难以获得足够数量的实验队列17。此外，TnfΔARE 模型需要长达 24 周才能发展出明显的纤维化病理变化，使得干预研究成本高昂且实施困难16。

SHIP 是磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信号通路的一种负调控因子，主要在造血细胞中表达。其功能是去除磷脂酰肌醇 3,4,5-三磷酸的 5' 磷酸基团，从而减弱下游 PI3K 信号传导18。SHIP-/- 小鼠在临床前研究中具有多项优势：这些小鼠繁殖相对容易，并在 8 周龄时即表现出纤维化迹象19。该模型中加速的纤维化重塑可能由 PI3K 通路失调引起的炎症反应增强所驱动，导致免疫细胞过度活化，进而引发快速的组织重塑。尤为重要的是，我们研究组与 Kerr 研究组已独立证实，SHIP-/- 小鼠可发展出具有类似人类克罗恩病（CD）特征的回肠炎19,20。支持该模型相关性的是，部分 CD 患者在回肠活检组织和外周血单个核细胞（PBMCs）中均表现出 SHIP 活性降低21。此外，SHIP 活性较低的患者往往疾病进程更为严重，常需接受多次手术治疗22。

SHIP-/- 小鼠从4周龄开始即出现自发性、间断性的肠道炎症，病变局限于回肠远端，至6周龄时所有小鼠均表现出炎症20。到8周龄时，小鼠已形成纤维化病理特征，表现为肠外肌层增厚以及黏膜下层和肌层之间大量胶原沉积19。该模型中的炎症由巨噬细胞来源的白细胞介素-1β（IL-1β）驱动21。使用含氯膦酸盐的脂质体耗竭巨噬细胞，或使用IL-1受体拮抗剂（阿那白滞素）进行药理学阻断IL-1信号通路，均可减轻SHIP-/-小鼠的肠道炎症21。除了回肠炎外，SHIP-/-小鼠还表现出肺部炎症，我们已利用这一特征来评估旨在实现肠道局部递送的治疗手段的脱靶效应23。其他研究报道，使用Z-IETD-FMK抑制caspase-8可显著减轻SHIP-/-小鼠的回肠和肺部炎症24, 进一步支持将肺部病变作为评估全身性炎症控制的附加指标。

本文对近期发表的关于使用地塞米松成功治疗的研究进行了方法学上的回顾23 ，并详细描述了关键的技术操作步骤，同时补充了在药理学测试中使用小鼠模型时需考虑的若干因素。具体而言，我们强调了在炎症性肠病（IBD）模型中评估药物疗效的标准参数，包括肠道通透性、大体病理学、组织病理学以及促炎介质和效应分子的检测，并讨论了如何整合这些数据以对整体治疗效果作出结论。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

涉及动物的研究应遵循机构动物护理和使用委员会批准的伦理协议，并符合国家研究委员会关于动物护理的指南。本方案中的所有动物实验程序均遵循加拿大动物护理委员会的伦理准则，并已获得不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会批准（方案编号 A21-0212）。

注意：为了评估药物对 SHIP-/- 小鼠肠道病理的治疗效果，应将 SHIP+/+ 小鼠作为健康对照组进行比较。在进行治疗干预时，应在小鼠 6 周龄时开始给药，此时模型中的疾病已完全建立。在此实验中，SHIP+/+ 和 SHIP-/- 小鼠均每日接受口服灌胃给予地塞米松（3 mg/kg），溶于 0.5% β-环糊精（载体）中，或仅给予载体，持续 2 周，给药体积为 10 µL/g。

1. 使用FITC-葡聚糖检测法测定上皮屏障通透性

  1. 实验前对小鼠禁食4小时。
  2. 将4 kDa FITC-葡聚糖溶解于无菌1×PBS中，配制成终浓度为80 mg/mL的溶液。
  3. 每只小鼠准备150 µL，另加50 µL用于标准曲线。
    注意：在整个操作过程中，应尽量减少 FITC-葡聚糖溶液和血浆样本的光照暴露。
  4. 轻轻固定（抓取背部皮肤）每只小鼠，并给予150 µL的FITC-葡聚糖溶液 通过 灌胃
    注意：在给予第一只小鼠灌胃后立即启动计时器。每只后续小鼠之间间隔10–15分钟，以便有充足时间依次进行安乐死及后续操作，从而减少因时间差异导致的实验变异性。
  5. 将小鼠禁食 4 h。
  6. 使用5%异氟烷（以1.5 L/min氧气输送的吸入性麻醉剂）麻醉小鼠，随后根据标准机构程序使用二氧化碳实施安乐死。采集血液 通过 使用25 G针头和1 mL注射器进行心脏穿刺。
  7. 立即向每100 µL采集的血液中加入10 µL酸性枸橼酸葡萄糖溶液作为抗凝剂。通过倒置充分混匀。
  8. 以 1500 x g 离心 g 4 °C下离心10分钟，小心将血浆（上清液）转移至预先标记的1.7 mL微量离心管中。样品在分析前需置于冰上并避光保存。
  9. 将每份血浆样本用1×PBS分别按1:2和1:10比例稀释。
  10. 将每种稀释液各100 µL加入不透明的96孔板中，每样设两个复孔。
  11. 使用1×PBS对原始80 mg/mL的FITC-葡聚糖储备液进行1:2倍比稀释，得到以下浓度：3000、1500、750、375、187.5、93.8、46.9、23.4和0 ng/mL。将各浓度溶液分别取100 µL加入96孔板中，每种浓度设两个复孔。
  12. 使用酶标仪在485 nm激发波长和535 nm发射波长下测定荧光。

2. 大体病理学评估

  1. 进行FITC-葡聚糖检测采血后，小心切除整个小肠。
  2. 轻柔去除附着的脂肪和结缔组织。
    注意：处理组织时需格外小心，因为病变区域可能较为脆弱，容易撕裂。
  3. 将小肠平铺在一张空白白纸上，以获得最佳对比度。肉眼检查组织是否存在肉眼可见的疾病迹象。在SHIP-/-小鼠中，炎症通常局限于小肠远端10 cm区域。
    注意：需评估的关键肉眼特征包括颜色变化，即与邻近外观正常的组织相比，病变区域出现明显发红或充血。此外，检查是否存在组织增厚，因为受累区域在轻柔触诊时可能表现为肿胀、水肿或僵硬。注意观察是否有血液存在，可能表现为明显的出血点、暗红色变色或附着的血迹。
  4. 将小肠与标尺并排放置以提供比例参照，并拍照记录大体病理学发现。

3. 组织学评估

  1. 使用注射器以1×PBS轻轻冲洗肠腔以清除肠内容物。避免对组织施加过大压力，以免破坏绒毛和隐窝结构。
  2. 识别并采集最具代表性的远端回肠组织，长度约1厘米，以反映大体病理特征。如存在可见病变区域，应包括在内。进行比较（SHIP+/+ 与 SHIP-/-）时，须确保组织取自解剖位置相匹配的区域。
    注意：为初步评估治疗效果，建议将回肠制备成瑞士卷状。该方法可实现对疾病的全局可视化，并减少取样偏差。
  3. 将组织平放在组织学包埋盒中，并置于海绵之间以防止折叠。
  4. 用于苏木精 & 伊红（H&E) 和马松三色染色，将组织置于4 °C条件下，用10%中性缓冲福尔马林固定过夜，固定液体积至少为组织体积的10–20倍（每个包埋盒约5 mL），并确保所有包埋盒完全浸没。随后将包埋盒转移至70%乙醇中保存，直至处理前均需保持完全浸没状态。
    注意：10% 福尔马林（含 3.7% 甲醛）是一种强效的呼吸道刺激物和皮肤致敏剂，被归类为人类致癌物。吸入、摄入或皮肤接触可导致急性毒性，长期暴露可能增加患癌风险。所有涉及福尔马林的操作均应在经认证的化学通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、耐化学腐蚀手套和眼部防护装置。废液应收集于明确标记的容器中 "甲醛废液" 根据机构的危险废物处理规程进行妥善处置。所有被福尔马林污染的材料（如移液器吸头、组织、手套）均应视为化学危险废物，并依照当地环境健康与安全（EHS）程序进行丢弃。
  5. 对于阿新蓝/过碘酸-雪夫染色，将组织置于卡诺氏液（60% 乙醇、30% 氯仿和 10% 冰醋酸）中，于 4 °C 固定过夜，每盒使用约 5 mL 或为组织体积的 10–20 倍。随后将包埋盒转移至 100% 乙醇中保存，直至后续处理。
    注意：卡诺氏液由60%乙醇、30%氯仿和10%冰醋酸组成。该混合液具有高度挥发性、易燃性和毒性。操作卡诺氏液时必须在通风橱中进行，并储存于密封容器中，远离热源或点火源。卡诺氏液废液应收集于指定的混合有机溶剂废液容器中，并按照机构的危险废物处理指南进行处置。所有被卡诺氏液污染的材料均应作为化学危险废物处理。
  6. 将组织包埋于石蜡中，并切5 µm厚的切片用于染色。
  7. 划线 H&根据以下标准对伊立替康染色的回肠切片进行16分制评分 表1最终的组织学损伤评分由两名对实验条件设盲的研究人员分别评分后取平均值确定。
  8. 使用6点评分法，依据以下标准评估Masson三色染色的横切面 表 2最终的纤维化评分由两位对实验条件设盲的独立评审者所赋评分的中位数计算得出。

4. 细胞因子评估

  1. 在解剖并取下组织学样本后，收集回肠远端剩余的10 cm部分。
  2. 用吸水纸将组织吸干并记录重量。在液氮中速冻后，于-80 °C保存以备后续处理。
  3. 准备处理时，取出组织并始终置于冰上。
  4. 称量组织样本。通过向1× PBS中添加蛋白酶抑制剂（抑肽酶和亮抑酶肽，各10 µg/mL），为所有样本配制足够的匀浆缓冲液。每毫克组织使用10 µL缓冲液（例如，100 mg组织需要1 mL缓冲液）。
    注意：匀浆缓冲液必须在匀浆当天新鲜配制，以确保蛋白酶抑制剂的有效性。
  5. 使用台式匀浆器，在预冷的匀浆缓冲液中对全层回肠组织进行匀浆。确保匀浆液均匀，无可见组织碎片。在处理不同样本之间，用PBS充分冲洗匀浆器探头，以防止交叉污染。
  6. 将组织匀浆液在4 °C条件下以10,000 × g 离心10分钟。
  7. 将澄清的上清液分装，避免反复冻融，并于-80 °C保存以备后续分析。
  8. 根据制造商说明书，对澄清上清液进行酶联免疫吸附测定（ELISA），以定量目标细胞因子。
    注意：使用Varioskan LUX酶标仪及SkanIt RE 7.0.2软件在450 nm处测定吸光度，参考波长为570 nm进行校正。使用Microsoft Excel进行数据分析，根据标准曲线的线性范围对吸光度值进行插值，以确定细胞因子浓度。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

6周龄的 SHIP+/+ 和 SHIP-/- 小鼠每日经口灌胃给予0.5% β-环糊精（溶剂对照组；每种基因型 n = 6）或3 mg/kg 地塞米松（每种基因型 n = 6），持续2周。治疗的时间点和持续时间取决于模型特性，应考虑疾病进展的起始时间和进展速度，以及干预措施是用于预防还是治疗目的。实验中应使用相等数量的雄性和雌性小鼠。尽管我们尚未发现 SHIP-/- 小鼠疾病自然病程中存在基于性别的差异，但不同的治疗方案可能表现出性别特异性的反应。在此模型中，从4至6周龄开始进行预防性治疗可用于阻止炎症和纤维化的发生；而从6至8周、8至10周或6至10周龄开始实施的治疗方案则可用于评估对已建立疾病的治疗效果。最佳给药剂量和时间应参考文献报道并结合剂量滴定实验来确定。我们先前已证实，当地塞米松给药方案在回肠炎症发生后使用时具有显著疗效。

收获当天的推荐时间线如图1A所示。根据大体检查，地塞米松未在 SHIP+/+ 小鼠中诱导任何肠道病理变化。SHIP-/- 小鼠则表现出明显的红肿和增厚区域，提示存在炎症。而在经地塞米松处理的 SHIP-/- 小鼠中，这些大体病理特征消失（图1B）。为评估肠道屏障功能，在口服灌胃 FITC-葡聚糖后检测其血浆浓度。尽管差异无统计学意义，SHIP-/- 小鼠的血浆 FITC-葡聚糖浓度较 SHIP+/+ 对照组有所升高，提示肠道通透性增加。地塞米松治疗使 SHIP-/- 小鼠的 FITC-葡聚糖浓度降低至与 SHIP+/+ 小鼠相似的水平（图1C）。

对 SHIP-/- 小鼠肠道横切面的组织学检查揭示了典型的病理特征，包括免疫细胞浸润、绒毛-隐窝结构破坏、杯状细胞增生/肥大以及肌层增厚（图 2A）。与 SHIP+/+ 小鼠相比，这些特征表现为显著更高的组织学损伤评分（p = 0.0005，图 2B）。在经地塞米松处理的 SHIP+/+ 小鼠中未观察到组织学损伤。与大体病理学和屏障功能的改善一致，地塞米松减轻了 SHIP-/- 小鼠的组织病理学改变，尽管该效应未达到统计学显著性（p = 0.0981，图 2A 和 图 2B）。Masson 三色染色显示 SHIP-/- 小鼠肠道组织中存在大量胶原沉积，并伴有显著高于 SHIP+/+ 对照组的纤维化评分（图 2C）。地塞米松有效减轻了 SHIP-/- 小鼠的纤维化特征，使纤维化评分降低至与 SHIP+/+ 对照组相当的水平（图 2C）。此外，阿利新蓝/过碘酸雪夫（Alcian blue/PAS）染色证实 SHIP-/- 小鼠存在杯状细胞增生/肥大，而地塞米松治疗后该现象有所减轻（图 2D）。

为评估炎症性细胞因子浓度，对全层回肠组织匀浆进行了ELISA检测（图3A）。与SHIP+/+对照组小鼠相比，SHIP-/-小鼠的IL-1β浓度显著升高（p = 0.0468），该结果与既往研究中IL-1β表达水平与该模型疾病严重程度相关的发现一致。地塞米松治疗显著降低了SHIP-/-小鼠的IL-1β浓度（p = 0.0023）。与以往报道一致，IL-6和TNF的浓度在四组实验动物之间无显著差异。我们还检测了全层回肠匀浆中中性粒细胞相关蛋白髓过氧化物酶（MPO）和脂质运载蛋白-2（LCN-2）的浓度，作为炎症的额外生化标志物（图3B）。与SHIP+/+对照组相比，SHIP-/-小鼠的MPO和LCN-2浓度均显著升高（分别为p = 0.0031和p = 0.0002），但LCN-2浓度的升高主要由6只小鼠中2只测得的高浓度值驱动。地塞米松治疗降低了MPO水平，并轻度降低LCN-2水平，但差异无统计学显著性。这些数据表明，MPO是SHIP-/-小鼠炎症反应的一个有效标志物，而LCN-2浓度则不够稳定或可靠。

为了研究 SHIP-/- 小鼠模型中炎症特征与纤维化特征之间的关系，我们利用全层回肠组织的组织学损伤评分、纤维化评分以及 IL-1β 浓度进行了斯皮尔曼相关性分析（图 4）。IL-1β 浓度与组织学损伤评分呈正相关（r = 0.6813），表明炎症加重与组织损伤加剧相关（图 4A）。IL-1β 浓度与纤维化评分之间也观察到中等程度的相关性（r = 0.4117），提示炎症性细胞因子的产生与纤维化重塑之间存在关联（图 4B）。此外，组织学损伤评分与纤维化评分之间存在显著相关性（r = 0.6241），表明在 SHIP-/- 小鼠中，结构损伤与纤维化进程是平行发展的（图 4C）。

FITC-dextran absorption graph and experiment: fasting, euthanasia, fluorescence measurement steps.
图1地塞米松可减轻 SHIP-/- 小鼠的肠道大体病理学损伤及通透性。 SHIP+/+ 和 SHIP-/- 小鼠在6至8周龄期间，每天经口灌胃给予0.5% β-环糊精作为载体对照（VC）或地塞米松（Dex；3 mg/kg）。A推荐的实验时间线。B) 对盲肠和远端回肠进行大体形态学评估，并展示代表性图像（每组 n = 4–6 只小鼠）。星号标注大体检查中观察到的散在红斑和增厚区域。图像旨在代表整体病理变化的典型示例，不用于定量分析。C为评估肠道通透性，将小鼠禁食 4 小时后经口灌胃给予 80 mg/mL FITC-葡聚糖。再禁食 4 小时后采集血液 通过 心脏穿刺采集血液，测定血浆中FITC-葡聚糖浓度。数据以均值±标准差表示。灰色条带表示健康C57BL/6小鼠在灌胃后4小时血浆FITC-葡聚糖浓度的通常范围25统计学显著性通过Kruskal-Wallis检验，随后采用Dunn's多重比较检验进行分析。 请点击此处以查看此图的放大版本。

SHIP+/+ 和 SHIP-/- 肠道组织的组织学；图表中的损伤评分和纤维化。
图 2：地塞米松减轻 SHIP-/- 小鼠回肠远端的组织学损伤评分、胶原沉积、肌层厚度以及杯状细胞增生和肥大。 SHIP+/+ 和 SHIP-/- 小鼠从6至8周龄期间，每天经口灌胃给予0.5% β-环糊精作为溶剂对照（VC）或地塞米松（Dex；3 mg/kg）。(A) 对小鼠回肠横切面进行H&E染色，以10倍放大倍数拍摄图像；比例尺 = 200 µm。(B) SHIP+/+ 和 SHIP-/- 小鼠的组织学损伤评分以中位数 ± 四分位距（IQR）表示。(C) 固定后的回肠横切面采用Masson三色染色法检测纤维化；胶原呈蓝色。图像以10倍放大倍数拍摄；比例尺 = 200 µm。SHIP+/+ 和 SHIP-/- 小鼠的纤维化评分以中位数 ± IQR表示。(D) 固定后的回肠横切面采用阿利新蓝/过碘酸雪夫（Alcian blue/PAS）染色。图像以10倍放大倍数拍摄；比例尺 = 200 µm。所有切片均代表每组n = 6只小鼠的结果（除SHIP+/+ Dex和SHIP-/- Dex组为n = 5）。组织学损伤评分的统计学显著性采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn多重比较检验。 请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质表达分析柱状图；SHIP基因型中的炎症标志物；统计结果。
图3：地塞米松降低 SHIP-/- 小鼠回肠全层匀浆中 IL-1β 的浓度。 SHIP+/+ 和 SHIP-/- 小鼠从6至8周龄期间，每天经口灌胃给予0.5% β-环糊精作为载体对照（VC）或地塞米松（Dex；3 mg/kg）。(A) 检测回肠全层匀浆中 IL-1β、TNF 和 IL-6 的浓度。(B) 检测回肠全层组织匀浆中髓过氧化物酶（MPO）和脂质运载蛋白-2（LCN-2）的浓度。数据以均值 ± 标准差表示。统计分析采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn多重比较检验。请点击此处查看该图的放大版本。

IL-1β 水平与损伤和纤维化评分的相关性图示，显示相关系数。
图 4：IL-1β 浓度与组织学损伤和纤维化呈正相关，且纤维化与 SHIP-/- 小鼠的组织学损伤评分呈正相关。采用 Spearman 相关性分析评估 SHIP-/- 小鼠全层回肠组织中组织学损伤评分、纤维化评分与 IL-1β 浓度之间的关系。结果显示：（A）组织学损伤评分与 IL-1β 浓度之间存在显著正相关（r = 0.6813）；（B）纤维化评分与 IL-1β 浓度之间存在显著正相关（r = 0.4117）；以及（C）组织学损伤评分与纤维化评分之间存在显著正相关（r = 0.6241）。每个数据点代表一只小鼠。请点击此处查看该图的放大版本。

损伤组分评分
隐窝结构丧失0 = 无
1 = <25% 丧失
2 = 25–50% 丧失
3 = 50–75% 丧失
4 = >75% 丧失
免疫细胞浸润0 = 无
1 = 固有层中偶见免疫细胞
2 = 固有层中免疫细胞增多
3 = 固有层中免疫细胞融合成片并突破黏膜
4 = 整个切片范围内均有免疫细胞浸润
杯状细胞增生与肥大0 = 无
1 = 杯状细胞数量和体积增加 <50%
2 = 杯状细胞数量和体积增加 >50%
溃疡形成0 = 无
1 = 中度溃疡
2 = 显著溃疡
水肿0 = 无
1 = 累及 <50% 的切片区域
2 = 累及 >50% 的切片区域
肌层增厚0 = 无
1 = 中度增厚
2 = 显著增厚

表1：组织学损伤评分。根据表征 SHIP-/- 小鼠模型回肠炎的关键特征，对 SHIP+/+ 和 SHIP-/- 小鼠回肠横切面的 H&E 染色组织学损伤进行评分，包括结构破坏（0-4）、免疫细胞浸润（0-4）、杯状细胞增生和肥大（0-2）、溃疡（0-2）、水肿（0-2）以及肌层增厚（0-2）。

纤维化组分评分
胶原过度沉积0 = 正常结构；无过量胶原
1 = 胶原轻度增加；局限于黏膜下层或浆膜下层
2 = 胶原中度扩展至黏膜下层及部分肌层，胶原束排列紊乱
3 = 胶原广泛致密沉积，取代正常结构，累及黏膜下层及肌层（透壁性）
黏膜下层纤维肌性增生/肌性化/肌性闭塞0 = 无，黏膜下层肌组织含量正常
1 = 肌组织含量轻度增加
2 = 黏膜下层出现大量肌组织，影响形态但结构正常
3 = 肌组织完全闭塞整个黏膜下层空间

表2：纤维化评分。 对来自 SHIP+/+ 和 SHIP-/- 小鼠回肠横切面的Masson三色染色样本进行纤维化评分，评分依据为在 SHIP-/- 模型中观察到的肠道纤维化关键特征，包括胶原过度沉积（0-3分）以及纤维肌性增生或黏膜下层肌层破坏（0-3分）。胶原沉积的评估基于其分布范围和组织结构破坏程度，而肌层改变则根据肌肉浸润程度及黏膜下层结构扭曲情况进行评价。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案概述了在 SHIP-/- 小鼠中评估回肠炎和肠道纤维化的方法，该小鼠是具有伴随纤维化病变的克罗恩病（CD）样肠道炎症的动物模型。SHIP-/- 小鼠模型重现了克罗恩病的一些特征，而这些特征在其他肠道炎症小鼠模型中并不常见，特别是回肠部位的病变、斑片状及透壁性炎症以及纤维化病理改变19,26。结合其易于繁殖和疾病表型出现时间短的优点，SHIP-/- 模型已成为克罗恩病转化研究中的有力工具19。

在本研究中，由于 FITC-葡聚糖实验和组织学评分数据不符合单因素方差分析（one-way ANOVA）所需的正态性假设，且组织学评分属于不连续的非参数变量，因此采用 Kruskal-Wallis 检验评估统计学显著性。尽管我们的分析未在地塞米松处理组与对照溶剂处理组之间获得具有统计学意义的差异，但仍观察到明确的趋势。地塞米松可降低 SHIP-/- 小鼠的肠道通透性和组织病理学损伤，若样本量更大，这些效应可能达到统计学显著性。

在执行本方案时可能会遇到若干技术挑战。在组织处理方面，由于 SHIP-/- 回肠组织在解剖过程中容易撕裂，因此需要轻柔操作，这一点在为大体成像准备组织时尤为重要。组织固定是组织学分析的另一个关键因素。福尔马林固定的组织适用于苏木精-伊红（H&E）染色和马松三色染色，但不适用于阿利新蓝/过碘酸-雪夫（Alcian Blue/PAS）染色；相反，卡诺伊固定液（Carnoy's-fixed）固定的组织适用于 H&E 染色和 Alcian Blue/PAS 染色，但不适用于马松三色染色。卡诺伊固定会导致强烈且弥散的深蓝色染色，从而遮蔽胶原和肌层的观察。在细胞因子分析中，必须在冰上处理样本，因为细胞因子极易降解。澄清的组织匀浆液在处理后应立即分装。反复冻融循环会显著破坏细胞因子的完整性，削弱不同基因型和/或处理组之间可能存在的差异。最后，为确保定量准确，建议对每个样本进行多个稀释度检测，以确认读数落在检测标准曲线的线性范围内，并尽量减少复杂组织基质可能带来的干扰。解决这些技术问题是获得可重复且可解释结果的关键，但也必须谨慎管理 SHIP-/- 小鼠本身固有的生物学变异性。

在考虑和严格控制 SHIP-/- 小鼠的若干关键方面时，应确保实验的可重复性并尽量减少混杂因素。肠道微生物组对小鼠炎症性肠病（IBD）模型中的疾病发展和治疗反应具有深远影响27,28。我们先前的研究表明，SHIP-/- 小鼠的肠道炎症依赖于微生物群，并可通过抗生素治疗得到改善29。因此，应使用同窝出生的对照小鼠以减少由微生物组引起的变异性，且处理组必须在笼具来源上保持均衡30。此外，严格的性别匹配至关重要。尽管在 SHIP-/- 小鼠中尚未观察到疾病外显率或严重程度存在性别差异，但在其他回肠炎模型（如 SAMP1/YitFc）中，雌性小鼠的发病时间更早且疾病更严重14,31。由于性激素也可调节微生物组成32，因此在治疗研究中进行性别匹配对于最小化潜在混杂因素极为关键。此外，所评估的个别治疗方法在雄性和雌性小鼠中可能具有不同的疗效。尽管我们目前的研究结果未显示疾病或对地塞米松治疗反应存在性别相关差异，但在所有治疗研究中均应进行性别匹配。

除了上述的微生物组和性别因素外，在治疗研究中纳入 SHIP+/+ 小鼠以评估载体和治疗药物在无肠道炎症情况下的作用也非常重要。这可以确保药物或其递送方式不会在健康肠道中引发或加重病理变化，从而提高对治疗有效性和安全性的解读准确性。

治疗干预的时机也至关重要，应根据实验目标进行调整，因为小鼠在4、8和12周龄时的炎症和纤维化程度存在显著差异19,26。SHIP-/- 小鼠在4周龄时即开始出现肠道炎症，至6周龄时所有小鼠均表现出炎症，纤维化病变的标志物最早可在6周龄时检测到，并在8周龄时已明确建立19,26。因此，针对回肠炎症的治疗应从6周龄开始。抗纤维化干预可在6周龄时进行预防性给药，或在8至10周龄之间进行治疗性给药。然而，疾病的发生时间和严重程度可能因微生物环境不同而有所差异，而不同实验设施之间的微生物环境存在差别。研究人员在实施治疗方案前，必须首先确定其动物群体中疾病的动态变化特征。此外，SHIP-/- 小鼠在4至5周龄时体重可能减少最多达17%，到8至10周龄时进一步减少约5%33。出现显著体重下降的动物应从研究中剔除，因为这反映了疾病的严重表现，可能影响与肠道病理相关的治疗结果。

在分析 SHIP-/- 模型疾病进展时，一个重要的考虑因素是选择合适的炎症标志物。根据我们对 SHIP-/- 小鼠的丰富经验，细胞因子谱分析通常集中于特定介质，例如在疾病进展过程中已知会上调的 IL-1β。然而，在对炎症反应进行初步表征或评估新型治疗策略时，建议采用多重细胞因子分析。这种无偏倚的方法能够更广泛地描绘炎症微环境，可能揭示与疾病发病机制或治疗反应相关的新靶点。

SHIP-/- 小鼠模型具有实用优势，能够实现可重复性和高效性。SHIP-/- 小鼠无需外源性诱导即可自发产生稳定且一致的回肠炎症和纤维化。这消除了在诱导肠道炎症过程中因试剂制备和非标准化给药方案所带来的变异性。疾病进展迅速，炎症在出生后4至6周即可显现，纤维化则在8周时出现，使该模型在时间和成本上均具高效性。此外，SHIP-/- 小鼠易于繁殖和饲养，基因型鉴定简便，无需特殊的繁育策略。这简化了品系管理，减轻了技术工作负担，并降低了引入非预期遗传变异的风险19,21,26。在大多数研究环境中，均可使用常规技术可靠地评估疾病表型，包括FITC-葡聚糖检测、H&E染色和马松三色染色以及ELISA。这些综合特性有助于高效的实验设计，降低经济与技术门槛，并促进不同实验室之间获得一致的数据结果。

尽管 SHIP-/- 模型具有独特的优点，但该模型也存在局限性。与所有临床前模型一样，它无法完全复制人类炎症性肠病（IBD）复杂的多因素特性，后者受到遗传、免疫和环境因素的影响34。DSS 和 TNBS 模型由于操作简便且成本较低，目前仍被广泛使用。当这些化学诱导模型与基因修饰相结合时，可作为研究特定基因对屏障功能作用的有效工具35。然而，它们的主要用途在于模拟急性上皮损伤；在模拟克罗恩病（CD）所特有的慢性免疫介导的病理过程方面则存在不足，且其通过缺乏直接临床相关性的化学试剂诱导上皮损伤的机制也限制了其应用36。单一依赖某一种模型可能导致对治疗潜力的评估不完整和/或产生误导，因此建议采用多种模型以确保治疗效果的可靠性。

披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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本工作得到加拿大不列颠哥伦比亚儿童医院研究所动物护理设施的支持，以及通过加拿大糖组学网络（GlycoNet，卓越中心网络）和加拿大卫生研究院（MOP-133607 至 LS）获得的加拿大自然科学与工程研究委员会的资助 。K.S. 和 W.M. 获得了胃肠道与肝脏研究新一代研究人员培训项目（TRIANGLE，TRaIning a New generation of researchers in Gastroenterology and LivEr program）博士奖学金。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.7 mL 带盖离心管 DiamedSPE155-N
1× DPBS（不含氯化钙，不含氯化镁）GibcoREF 14190-144
25G × figure-materials-1” 针头 BDREF 305122用于心脏穿刺
26G × figure-materials-2” 针头BDREF 305110肠道灌流
乙酸Sigma-AldrichA6283组织学
酸性柠檬酸葡萄糖溶液（38 mM 柠檬酸，107 mM 柠檬酸钠，136 mM 葡萄糖）Millipore SigmaC3821
动物饲喂针头，非无菌，可重复使用，304SS 型Millipore Sigma CAD7900 用于灌胃
直型
规格：24G，
长度×直径 1 英寸 × 1.25 mm，
球头
抑肽酶Cayman Chemical9087-70-1匀浆缓冲液
BD Luer-Lok 注射器，无菌，一次性使用，5 mLBDREF 309646肠道灌流
BD OptEIA 小鼠 IL-6 ELISA 试剂盒BD Biosciences555240
BD OptEIA 小鼠 TNF ELISA 试剂盒 IIBD Biosciences558534
BD® Luer Slip 尖端注射器，无菌，一次性使用，1 mLBDREF 309659
活检泡沫垫片，方形，30.2 × 25.4 × 2 mm H.Simport ScientificREF M476-1组织学
缓冲福尔马林（低气味 10% 福尔马林）Fisher ChemicalSF93-4组织学
透明平底免疫非无菌 96 孔板Thermo Scientific439454
Eppendorf 5415R 冷冻离心机 Marshall ScientificEP-5415R
无水乙醇Greenfield GlobalP016EAAN组织学
Fisherbrand TRU-FLOW 组织包埋盒Fisher Scientific15-200-403组织学
异硫氰酸荧光素标记葡聚糖，3–5 kDa（1 g）Millipore SigmaFD4-1G
CAS 编号：60842-46-8
亮抑蛋白酶肽Millipore Sigma103476-89-7匀浆缓冲液
小鼠 IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISA R&D SystemsDY401
Multiscreen 96 孔板，实底Millipore SigmaMSSWNFX40白色，非无菌，非处理
OmniPur 氯仿Millipore Sigma3150组织学
Polytron PT-MR2100 匀浆器Kinematica AG632081
Varioskan Lux 多功能微孔板读数仪Thermo ScientificVL0L00D0

参考文献

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