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用于微血管栓塞的小鼠模型 体内 使用荧光聚苯乙烯微球的双光子显微镜技术

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DOI：

10.3791/68939

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2025年11月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering and Physics, Amsterdam University Medical Center, University of Amsterdam, 2Amsterdam Neuroscience, neurovascular disorders, 3Amsterdam Cardiovascular Sciences

本文内容

摘要

本方案详细描述了一种优化的慢性颅窗结合微血管栓塞小鼠模型的逐步操作方法，适用于 体内 使用荧光聚苯乙烯微球进行双光子显微成像。

摘要

脑部微血管阻塞相对常见，但目前仍缺乏深入研究。其发生率、长期后果以及潜在的清除机制在很大程度上尚不明确。当前用于研究此类事件的模型，如光化学血栓形成和微栓子注射，各自具有优缺点。本研究建立了一种详细方案，结合慢性颅窗制备与脑微血管栓塞的诱导 通过 小鼠动脉内注射微球。该设置可实现长期 体内 使用双光子显微镜对微血管和微小阻塞进行成像。微球通过置于颈外动脉（ECA）的导管输送，随后该动脉被永久结扎。重要的是，在整个操作过程及术后，颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA）均保持完整，从而最大程度减少对脑血流的干扰。为实现即时观察 体内 成像并防止微球聚集或黏附于移液头和导管，将微球悬浮于FITC-葡聚糖与0.1% Tween 20的混合液中。该注射技术通过以下方法进行了验证： 死后原位 利用三维成像确定微球的分布。本研究进一步验证了其应用价值 体内 双光子显微镜示例。该方法为诱导和研究微血管栓塞提供了一种稳定且可靠的技术，可利用高分辨率成像来探究其影响及清除动力学过程 体内 成像

引言

由于大脑主要动脉栓塞所致的缺血性卒中是一种急性且常具破坏性的事件1。栓子也可能出现在更远端的血管中。因此，可能发生静止性脑梗死（SBIs）；顾名思义，这些梗死无症状，通常在因其他原因进行影像学检查时偶然发现2,3。SBIs较为常见，在老年人尸检中属于最常观察到的脑血管病变之一4,5。流行病学研究显示，在无卒中病史的人群中，其患病率为20%。SBIs可导致认知功能障碍和痴呆，增加总体死亡率，并是未来发生卒中的危险因素6,7,8。这些梗死灶直径通常仅数毫米，与直径约为100 µm的穿支动脉闭塞相关。这些穿支动脉进一步形成广泛的微动脉和毛细血管床。微小血栓若通过穿支动脉并嵌顿于下游微循环中，通常在血管造影上难以被检测到9。然而，在心房颤动、动脉粥样硬化斑块以及其他来源情况下，可能释放大量微血栓10,11,12,13,14。除微血栓外，其他微粒（MPs），包括脂肪颗粒、细胞聚集体，甚至微塑料，也可能引起微血管栓塞。多项研究显示，血液和大脑中存在直径超过5 µm毛细血管管径的塑料微粒15,16。

与急性卒中和脑微出血相比，微血管闭塞的研究仍相对不足。目前对微血管闭塞的事件发生率、长期后果以及可能的清除机制了解甚少。然而，随着机械取栓在卒中治疗中的成功临床应用，人们对微血管闭塞的兴趣正在迅速增加；在大血管成功再通后，微血管栓塞可能导致微循环再灌注受损17。此外，关于微塑料的研究也急剧增多，其部分效应可能正是通过微血管栓塞介导的18,19,20。

通过颅窗结合多光子显微镜等技术，可对小鼠大脑皮层的微血管阻塞进行研究。目前研究脑微血管阻塞最常用的模型包括光化学血栓模型和微球模型。光化学血栓模型利用光敏染料，通过光激活在特定血管（通常为非毛细血管）中诱导血栓形成。via然而，由于纤溶系统被激活并溶解血栓，该模型无法用于长期观察血栓的演变过程21,22。此外，光敏染料的激活会产生单线态氧，导致内皮细胞和血脑屏障（BBB）损伤23。因此，在研究脑血栓过程中内皮细胞和血脑屏障功能，以及对脑循环和脑功能的长期影响时，更倾向于采用微球模型。微球注射模型通过将微球注入脑循环，实现对脑微血管系统的阻塞9,24,25,26,27,28,29,30。该模型的潜在缺点在于无法预先确定血栓形成的位置，这与光化学血栓法不同31,32。其优势在于可使用直径明确的微球进行注射，从而特异性地阻塞特定直径的（微）血管33,34,35。

多年来，已开发出多种将微球注入啮齿类动物脑循环的方法。这些方案在进入颈动脉三角区域方面达成共识，该区域由颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）组成，是进行动脉内微球注射的通路。不同方案在动脉内微球注射的具体操作上存在若干差异。首先，研究中使用的注射装置包括注射器9,26,27,29,33,34或导管25,28,30,36。其次，注射微球的数量和尺寸存在较大差异。微球直径通常在10至50 µm之间，具体选择取决于靶血管的大小。一般而言，微球越大，注射数量应越少，因为小动脉的数量少于毛细血管25,26,30。

实现稳定的动脉内微球注射仍具挑战性。在实际操作中，尽管注入了大量微球，但仅有部分微球能够到达脑循环。这对于研究滞留微球所产生效应尤为困难 体内 双光子显微成像技术的成功依赖于在制备好的颅窗视野内，小鼠皮层外层存在微球。选择合适的微球荧光染料至关重要，因为微球的强荧光以及发射光谱的重叠问题，可能在与转基因小鼠模型和血管内染色联合使用时带来挑战。

微血管阻塞在啮齿类动物模型中进行研究，此前已证明多个微球具有协同作用 离体 啮齿类动物大脑9，以及这些颗粒明显的外渗现象，该过程称为血管吞噬作用（angiophagy）33,35,37,38. 以使其能够 体内 研究开发了用于安装颅窗小鼠的多光子显微镜技术。本研究的目的是建立并报告一种优化的小鼠动脉内微球注射详细实验方案，以更好地研究微球对脑组织的影响及其在体内的去向。该方案的主要优势在于提高了递送效率，减少微球损失，并增加微球出现在颅窗成像区域内大脑中动脉（MCA）供血区的概率。该优化的微球注射方案通过以下方法进行评估 体内 双光子显微镜与死后检查 原位 专用成像冷冻切片机的三维成像39.

方案

所有涉及动物的实验程序均遵循《实验动物护理与使用指南》。荷兰动物实验中央委员会已授予完全批准（AVD11400202316817）。

注意：使用2个月至1年大的雄性和雌性小鼠。动物到达后，需经过7天的适应期方可进行任何实验操作。每笼最多饲养4只，提供食物和饮水。 随意摄取，维持在12小时光照-12小时黑暗循环条件下。NG2-DsRed 和 TIE2-GFP 小鼠购自（见 材料表 详情见正文）并在本实验室繁育。

1. 颅窗植入

  1. 麻醉与术前护理
    1. 在颅窗手术开始前1天，将0.06 mg/mL卡洛芬加入饮用水中。
    2. 称量小鼠体重，并在手术前30分钟皮下注射5 mg/kg卡洛芬和2 mg/kg地塞米松。
    3. 通过在立体定位仪上放置带反馈系统的加热垫并覆盖无菌布，准备手术区域。
    4. 将所有无菌手术器械摆放在另一块无菌布上。
    5. 在诱导室中以1 L/min的气流（30%氧气和70%医用空气）和3-4%异氟烷对小鼠进行麻醉诱导，随后通过面罩维持1.5-2%异氟烷以维持麻醉状态。
    6. 将小鼠固定在立体定位仪上，使用润滑剂将加热垫的体温探头插入直肠。涂抹眼膏以防止角膜干燥，并将加热垫设定为37 °C。
    7. 在手术前5分钟，沿手术切口线皮下注射1.5 mg/kg罗哌卡因。
    8. 使用棉签蘸取聚维酮碘，剃除并清洁从颈部至眼睛前方的颅骨表面皮肤。
  2. 头杆与窗口固定的手术准备
    1. 使用无菌镊子和手术刀，在枕部颅骨上方皮肤做初始切口。沿中线从前囟后方的人字缝向前延伸切口至冠状缝（位于前囟稍前方）（图1A）。小心牵拉并去除皮肤，充分暴露双侧颞肌。
    2. 向颅骨表面滴加约0.1 mL的1%利多卡因，以减少出血。
    3. 去除骨膜，并使用手术刀在头杆将要固定的颅骨区域进行划痕处理。划痕方向应垂直交叉于颅骨表面，以确保头杆牢固粘附。
    4. 用棉签清除残留血液，并用压缩空气干燥颅骨。
  3. 头杆固定
    1. 在低温（4 °C）陶瓷容器中配制牙科胶：加入100 µL单体与0.1 g聚合物混合，再加入1滴催化剂以启动胶水快速固化。
    2. 将胶水涂抹于头杆底部。将头杆从矢状窦方向略向左侧倾斜后压紧至颅骨上。在头杆边缘追加胶水以封闭所有缝隙，确保牢固粘附。
    3. 通过混合100 µL牙科水泥液与0.1 g粉末制备牙科水泥。将水泥涂抹于头杆四周，注意防止水泥流入钻孔区域的颅骨表面。在头杆上方再添加一层牙科水泥形成凹槽结构，便于后续向颅窗区域施加液体（图1B）。
    4. 让牙科胶和水泥至少干燥10分钟。
    5. 通过轻轻按压即将开颅的位置检查头杆是否牢固粘附。当颅骨无移动、且牙科水泥与颅骨之间无液体渗出时，表明头杆已正确固定。
  4. 开颅
    1. 使用头杆将小鼠固定于成像支架上，或保持其在立体定位仪中，以确保开颅过程中头部稳固。
    2. 使用细头标记笔在颅骨上标出开颅钻孔目标区域（直径4 mm）。透过颅骨定位大脑中动脉（MCA），确保颅窗位置最优，尽可能覆盖更多MCA区域。为确认钻孔区域大小和位置是否正确，可将盖玻片置于标记区域上方，并根据需要调整钻孔范围。
    3. 沿标记线以无压力方式环形钻孔，避免产热（图1C）。每30秒用生理盐水冷却颅骨。冷却期间，将钻头浸入水中清洁并用纸巾擦干。定期使用压缩空气清除骨屑。通过将盖玻片置于颅骨上确认开颅尺寸，必要时调整钻孔范围。
    4. 持续环形钻孔直至颅骨充分变薄。当颅骨接近穿透时，钻孔区域会出现裂纹。通过滴加生理盐水软化变薄的颅骨，并轻压钻孔区域中央，确认颅骨是否已足够薄。当在轻微压力下整个钻孔区域的颅骨均匀下沉时，即达到所需厚度。达到此状态前不得穿透颅骨，以免损伤硬脑膜和脑组织。若硬脑膜受损或出现出血，应持续用aCSF浸泡钻孔区域。
      注意：在移除颅骨前，务必清除钻孔区域内的所有骨屑。残留在硬脑膜上的骨颗粒可能引发颅窗下方的骨再生。
    5. 使用aCSF和压缩空气彻底清除所有骨屑。向钻孔区域持续滴加aCSF直至完全浸没颅骨。使用27号（0.4 mm × 16 mm）或30号（0.3 mm × 13 mm）针头，小心地水平（约180°）穿刺变薄的颅骨，避免损伤硬脑膜和脑组织。轻柔向上推动骨片直至其脱离，施力应最小化。若骨片不易脱离，继续钻孔。使用镊子移除已脱落的颅骨，期间保持脑组织浸没于aCSF中（图1D）。
    6. 用aCSF冲洗脑组织，然后将一块无菌、可吸收的猪明胶止血海绵浸透aCSF后置于脑表面，控制局部出血2分钟。小心移除海绵，同时保持脑组织浸没于aCSF中。继续用aCSF冲洗，确保脑表面无残留骨屑或血液。若出血持续，更换新的无菌、可吸收止血海绵并浸透aCSF后再次放置于脑表面。
      注意：骨片移除过程中轻微出血较为常见。在放置盖玻片前必须确认出血已停止，否则残留出血会影响颅窗透明度。
  5. 盖玻片放置
    1. 用棉签吸除覆盖脑组织的aCSF，仅保留薄层液体。将盖玻片置于脑组织上，使用弯头显微镊轻轻将其压入颅骨开口中。确保盖玻片略低于颅骨水平，并与头杆保持平行。
      注意：应将盖玻片牢固压紧脑组织，防止空腔形成，以维持颅窗质量。保持盖玻片与头杆平行可使其垂直于显微镜物镜，从而提高成像质量。
    2. 使用环氧树脂胶将盖玻片粘附于颅骨和头杆上，涂抹胶水时需用手牢固固定盖玻片并保持其与头杆平行。
    3. 用胶水密封盖玻片所有边缘，防止脑组织暴露。在操作过程中保持一滴aCSF覆盖于脑组织表面，防止胶水渗入颅窗下方或接触硬脑膜（图1E）。
    4. 让胶水固化5分钟。

开颅手术过程示意图与照片、手术步骤阶段、钻孔工具、实验装置。
图1：开颅手术方案概览。 开颅及头杆固定手术中关键步骤的详细示例图片与示意图。（A）去除皮肤（步骤2.2）。（B）安装头杆（步骤2.3）。（C）钻取4 mm开颅孔（步骤2.4.3）。（D）移除颅骨（步骤1.4.5）。（E）放置盖玻片（步骤1.4.7）。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 术后护理
    1. 皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬。
    2. 将动物转移至 37 °C 的恢复笼中，持续 30 分钟。然后将其放回饲养笼，饮水中含 0.06 mg/mL 卡洛芬，持续至术后最多 2 天。
    3. 提供浸泡在 0.06 mg/mL 卡洛芬溶液中的饲料，直至动物体重恢复至术前水平。
    4. 在进行微血管栓塞模型手术前，至少让动物恢复 7 天。

2. 微血管栓塞小鼠模型

  1. 导管组件
    1. 将一根20 cm长的微导管（内径0.23114 mm，外径0.27432 mm）的尖端插入一根透明导管（内径0.31 mm，外径0.64 mm）中，并使用环氧树脂胶和胶带密封连接处。确认导管的总长度足以容纳至少160 µL液体。
    2. 将27号鲁尔锁针（0.1 mm × 16 mm）插入透明导管的另一端。用环氧树脂胶和胶带密封末端。
    3. 用生理盐水填充1 mL注射器，并将其连接至导管针的鲁尔锁接口。用0.7 mL生理盐水冲洗，确保无泄漏或气泡残留。
    4. 用80 µL生理盐水填充导管，并标记导管内液面达到的位置。
  2. 麻醉与术前护理
    1. 手术前一日，为小鼠提供含有 0.06 mg/mL 卡洛芬的饮用水。
    2. 将带有反馈系统的加热垫置于无菌布下，并设置温度为 37 °C。
    3. 将所有无菌外科器械放置在第二块无菌布上。
    4. 称重小鼠，并在手术前30分钟皮下注射5 mg/kg的卡洛芬。
    5. 使用含30%氧气和70%外科空气、气体流速为1 L/min的3-4%异氟烷，在诱导室中对小鼠进行麻醉。
    6. 将小鼠转移至手术台，并维持麻醉状态 通过 面罩给予1.5-2%异氟烷，流速1 L/min，含30%氧气和70%空气。
    7. 插入润滑过的直肠温度探头，并涂抹眼膏以防止角膜干燥。
    8. 将一支2 mL注射器置于仰卧小鼠颈部下方，以方便手术区域的操作。
    9. 用胶带轻轻将前肢固定在手术台上。
    10. 剃除手术区域毛发，依次使用聚维酮碘和利多卡因。
  3. 切口
    1. 通过脚趾夹捏验证麻醉深度。
    2. 使用手术刀和解剖镊在下颌下方气管处沿中线做一条长约0.5 cm的切口。
    3. 使用显微缝合打结镊分离颈筋膜浅层的结缔组织，以暴露下方的胸骨舌骨肌。
    4. 用组织钩将右侧肩胛舌骨肌向尾外侧牵拉。轻轻撕开两侧胸骨舌骨肌之间的结缔组织，分离左侧与右侧胸骨舌骨肌。确保右侧颈动脉三角清晰可见，包括颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）。
  4. 颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉和顶后动脉（PPA）的手术准备
    注意：避免抓取或夹捏迷走神经，仅需轻柔移动，以防对动物健康造成不良影响。切勿触碰气管，以免引起呼吸问题。辨认起源于颈内动脉（ICA）中点处的枕动脉（OA），该位置位于颈内动脉Y形分叉与颈外动脉（ECA）起始点之间；同时辨认起源于颈外动脉内侧壁的甲状腺上动脉（TA）。这些动脉较为脆弱，须极度小心操作。
    1. 去除颈总动脉周围残留的筋膜和脂肪组织。
    2. 仔细分离颈总动脉与迷走神经。
    3. 在颈总动脉（CCA）上放置两根4/0丝线，每根绕两圈半，结扎时保持松紧适度，确保结扎线结不会阻碍CCA的血流。
    4. 剥离颈内动脉（ICA）和枕下动脉（PPA）周围的筋膜和脂肪组织。使用4/0 1.5缝线结扎PPA及ICA的所有侧支，包括眼动脉（OA），并暂时阻断血流。
    5. 去除颈外动脉（ECA）和甲状腺上动脉（TA）周围的筋膜和脂肪组织。使用4/0丝线在ECA和TA上打两个松结。将最远端的结尽可能远离Y形分叉处放置，并用其永久结扎ECA和TA。近端的结保持未打紧状态。
  5. 微球溶液制备与导管装载
    注意：在注射前尽快配制 FITC-葡聚糖/微球溶液，以尽量减少微球在导管上的黏附。
    1. 将10 µm微球（7.2 x 10⁶）均质并超声处理6 微球/mL）以获得均匀的单个颗粒悬浮液。
    2. 配制140 µL含0.1% Tween20的25 mg/mL 70 kDa FITC-葡聚糖溶液，然后加入20 µL匀浆后的微球，得到160 µL含1.44 × 10的FITC-葡聚糖/Tween20/微球混合液5 微球
    3. 轻轻回抽连接导管的注射器以形成气锁。
    4. 将导管尖端浸入预先配制的FITC-葡聚糖/Tween 20/微球混合液中，缓慢回抽注射器，直至混合液进入导管内。
    5. 确保导管内无气泡。若存在气泡，将混合液排入0.5 mL容器中，重复步骤2.5.3和2.5.4。
    6. 将装有载药导管的注射器放入注射泵中。设置泵速为10 µL/min，并运行至导管尖端出现微小的微球混合液滴为止。
  6. 导管插入与微球注射
    注意：避免将气泡注入血管系统，因为这可能导致严重不良反应或死亡。气泡可能源于导管装载不当或管路泄漏。
    1. 在颈内动脉（ICA）上放置一个血管夹，并收紧先前准备好的近端结扎线之一于颈总动脉（CCA）上（见步骤 2.4.3）。
    2. 使用显微剪刀，在颈外动脉（ECA）结扎线远端约0.5 mm处做一个小的斜向切口。确保切口大小略小于导管直径。
    3. 用无菌纱布或纸巾吸去血液，确保结扎部位和血管夹处无血液继续渗出。
      注意：颈外动脉（ECA）切开后，血管三角区域必须保持无血。残留血液可能导致血凝块形成，恢复颈动脉血流时可能引发大面积脑缺血事件，或堵塞ECA，从而阻碍微球注射。
    4. 短暂启动注射泵，使微球混合物在导管尖端形成液滴，以确认导管尖端无残留空气。
    5. 打开ECA切口，使用精细显微镊插入导管。插入过程中避免接触其他表面，以防微球混合物丢失或空气进入导管。如果插入失败或导管尖端触碰到任何表面，须在重新尝试前重复步骤2.6.4。
    6. 通过在颈外动脉（ECA）周围收紧近端缝线（见步骤2.4.5）固定导管。
    7. 以10 µL/min的流速启动注射泵，确保血管内无渗漏或气泡。若出现渗漏或气泡，应拔除导管并返回步骤2.6.4。
    8. 若未检测到渗漏或气泡，则以10 µL/min持续泵注，逐步增加导管及血管内的压力，直至观察到动脉明显扩张。在重新开放颈内动脉（ICA）和颈总动脉（CCA）之前，需建立足够的导管和血管内压力，以匹配动物的动脉压。当CCA和ICA血流恢复时，可能有部分血液进入导管，但随后将被重新注入ICA。通过观察绿色FITC染料充盈动脉的情况，直观确认微球混合物已注入颈外动脉（ECA）且压力建立成功。若未观察到染料充盈，应立即停止注射泵，取出导管，并重复步骤2.6.4至2.6.8。
    9. 移除颈内动脉（ICA）上的血管夹，然后将注射泵流速提高至20 µL/min。通过确认副甲状腺动脉（PPA）分叉远端的ICA内充满FITC染料，以验证微球注射成功。若确认成功，则进行步骤2.6.11；若未成功，则进行步骤2.6.10。
    10. 停止注射泵，松开远端颈外动脉（PPA）结扎线。将PPA结扎位置调整至距颈内动脉（ICA）-PPA分叉更远的远端，然后收紧结扎线。返回步骤2.6.9。
    11. 移除结扎颈总动脉（CCA）的缝线，以使微球混合物流入颈内动脉（ICA）。
    12. 注射微球混合物时发生反向流动的故障排除：
      1. 如果微球混合物发生向颈总动脉（CCA）的逆流，则将注射泵流速降低至10 µL/min。
      2. 如果逆向血流持续存在，使用显微镊子轻轻夹住颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）和颈总动脉（CCA），以确保血流未因血栓而受阻。
      3. 目视确认血管内无气栓存在。气栓可在血管内表现为透明区域。
      4. 如果存在空气栓子，停止注射泵，用显微镊子轻轻挤压动脉，将空气栓子移至颈外动脉（ECA）。结扎颈总动脉（CCA），并在颈外动脉（ECA）上放置血管夹。取出导管和空气栓子，返回步骤 2.6.4。
      5. 若无阻塞存在但逆向血流持续，使用血管夹闭合颈总动脉，并返回步骤 2.6.10。
        注意：微球混合物不应出现向CCA的逆流，因为这可能表明ICA再通不充分、空气栓塞或血栓形成，这些情况可能对实验结果产生不利影响。
    13. 当导管中的混合物达到 80 µL 标记时，关闭注射泵以停止微球注射（见步骤 3.1.4）。总共注入 80 µL 含 7.2 x 10 的 FITC-葡聚糖/吐温204 微球被注射。
  7. 程序的完成
    1. 使用预先准备好的剩余结扎线结（参见步骤 2.4.3）结扎 CCA，并用血管夹闭合 ICA。
    2. 移除ECA中的导管，同时保持固定导管的缝线在ECA中的位置不变。
    3. 通过拉紧固定导管的线绳，永久结扎颈外动脉。
    4. 移除颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和枕下动脉（PPA）周围的血管夹和缝线，以恢复血流。用几滴生理盐水润湿手术区域。
    5. 使用12 mm反向切割3/8弧形针和不可吸收3-0（USP）丝线缝合皮肤。
  8. 术后护理
    1. 皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬。
    2. 将动物转移至恢复笼（约33 °C）中，恢复30-60分钟。待动物完全恢复后，将其放回原饲养笼。
    3. 术后前两天，将动物饲料用 0.06 mg/mL 卡洛芬溶液浸泡 10 分钟后喂食，并在饮水中添加 0.06 mg/mL 卡洛芬。此后，继续提供经浸泡但不含卡洛芬的饲料，直至动物体重恢复至术前水平。
    4. 每天多次监测动物，持续2天，之后每周3次。若达到人道终点，则实施安乐死。
      注意：人类终点的定义依据欧洲议会指令2010/63/EU。此外，若动物出现缺血迹象（如转圈行为或瘫痪），应实施安乐死，因为微血管栓塞模型不应引起严重的缺血事件。

Carotid artery ligation and catheterization process; diagram and surgical setup; vascular surgery.
图2微血管栓塞手术 微血管栓塞手术关键步骤的详细示例图片和示意图。ACCA（2倍浓度）、ECA（2倍浓度）、TA、OA和PPA连接反应的制备（步骤2.4）。B颈总动脉（CCA）的（时间性）结扎st）和颈外动脉（ECA），随后关闭主动脉（OA）和颈后动脉（PPA），并用血管夹暂时闭合颈内动脉（ICA），从而可在无出血情况下切开ECA（步骤2.6.2）。(C) 将导管置入已游离的颈外动脉（ECA），并用第二根缝线将两者结扎固定（步骤 2.6.7）。D) 打开 CCA 周围的近端缝线，并移除 ICA 上的血管夹以恢复血流，随后将微球混合物注入 ICA（步骤 2.6.10）。CCA = 颈总动脉；ECA = 颈外动脉；TA = 甲状腺动脉；OA = 枕动脉；PPA = 翼腭动脉；ICA = 颈内动脉。 请点击此处以查看此图的放大版本。

3. 体内 成像

  1. 双光子显微镜
    1. 将动物放入显微镜的双光子成像固定装置中进行术后成像 体内 成像。使用1.2%异氟烷与30%氧气和70%空气的混合气体（流速1 L/min）维持浅麻醉，监测呼吸频率和深度。参见 补充表1 显微镜设置的详细信息。
    2. 通过颅窗使用10倍物镜（10x/0.30 DRY）和汞灯照明定位嵌顿的微球，然后切换至25倍水浸物镜（25x/0.95 WATER）进行双光子成像。参见 补充表 2 用于成像设置。
    3. 围绕目标微球记录Z轴层扫描图像。

4. 死后分析

  1. 实验终点 原位 成像
    1. 当达到实验终点时，通过颈椎脱位处死动物，并通过颈椎间隙或开胸术确认死亡，操作在 > 30% 氧气与70% 医用空气混合气体中含4% 异氟烷，流速为1 L/min。
  2. 原位 脑成像
    1. 取出脑组织，将其包埋于含0.1%黑色墨水（VWR）的3.0%羧甲基纤维素钠溶液（Sigma）中，于−20 °C冷冻至少24小时。
    2. 使用先前由 Juch R.N.S. 等人描述的定制小型三维荧光成像冷冻显微切片系统（small-3D-FICS）对脑组织进行成像40将系统设置为垂直切割脑组织，切片厚度为16 µm，并以13.66 × 13.66 µm的分辨率进行成像。参见 补充表3 和 补充表4 根据成像设置和系统参数进行操作。使用 Articulus 软件分析图像41.
  3. 原位 小鼠整体成像
    1. 去除动物的皮肤、牙齿和尾巴。
      注意：尾部切除为可选步骤，但可提高成像速度。
    2. 将动物样本包埋于含0.1%黑色墨水（VWR）的3.0%羧甲基纤维素钠溶液（Sigma）中，于−20 °C冷冻至少24小时。
    3. 使用定制的大型三维荧光成像冷冻显微切片系统（large-3D-FICS）对动物进行成像，方法如前所述 42将系统设置为切割25.9 µm的切片，平面内分辨率为26.09 µm。参见 补充表5 和 补充表6 根据成像设置和系统参数，使用 Articulus 软件分析图像41.

结果

死后 原位 成像

微血管栓塞手术的成功通过术后4天的全身及全脑原位尸检成像得以确认（图3A）。小鼠的矢状切面显示微球滞留在脑组织中。图3B、C展示了微血管栓塞手术后1天取出的小鼠脑组织示例。微球主要滞留在同侧半球，位于大脑中动脉和前动脉的血流供应区域。当在混合物中添加Tween20后，脑切片中的微球数量显著增加（图3E）。术后恢复期间的体重监测显示，注射含Tween20微球混合物的小鼠术后体重下降较少，且恢复更快（图3F）。

显示微球分布的整只小鼠矢状面图像、脑部切面图及组织微球分析。
图3：小鼠微血管栓塞手术后微球的分布情况。使用Articulus软件可视化小鼠体内10 µm微球的原位定位41。（A）微血管栓塞手术后，使用大型3D-FICS对整只小鼠成像的矢状面示例。（B-D）使用小型3D-FICS获取的小鼠脑部代表性轴向、冠状和矢状图像。（E）对照组和Tween20组在前囟±0.5 mm处每50 µm冠状脑切片中检测到的微球平均数量。柱状图表示均值±标准差，单个数据点以圆点表示。采用非配对t检验进行统计学比较；图中显示了p值。使用四分位距（IQR）方法识别并剔除异常值（两组各n = 1），最终对照组n = 3，Tween20组n = 14。（F）微血管栓塞手术后（时间点为0）随时间变化的体重归一化变化。体重数据已归一化至各动物手术时的基线值。线条表示每组均值±标准差（对照组，n = 4；Tween20组，n = 5），对照组用蓝色表示，Tween20组用深橙色表示。各时间点组间差异的统计学显著性通过非配对双尾t检验评估。（* = p < 0.05，** = p < 0.01）请点击此处查看该图的放大版本。

微球注射与 体内双光子显微镜成像

在微球注射过程中，涂有5% BSA的导管表面附着大量微球，流动的微球也常出现聚集现象，可能导致较大的阻塞（见补充视频1）。此外，由于注射后可能引发免疫反应，不希望在微球混合液中添加5% BSA以防止粘附和聚集43,44。为避免此问题，在微球混合液中使用了0.1% Tween20溶液，结果明显有更多微球顺利通过导管，并在成像窗口中观察到理想数量（> 20）的微球（图4 和 补充视频2）。图4A、B 显示了微血管栓塞手术后0.5小时脑皮层的荧光显微镜概览图像，每个白色斑点代表一个阻塞脑部微血管毛细血管的微球。图4C、D 展示了一个双光子z轴层扫图像的二维投影示例。微球导致脑部微血管发生栓塞，血流灌注受损，表现为微球下游管腔内染料缺失（图4E 和 补充视频3）。此外，这些栓塞还引起血脑屏障（BBB）破坏，表现为FITC-葡聚糖染料外渗（图4F、G）。

这些结果与注射微球-吐温混合物时观察到的导管上黏附的微球数量较少以及微球聚集程度极低的现象一致。然而，在导管中微球混合物最后的 20 µL 中，有大量微球发生聚集，这部分不应被注射，以避免可能引起较大梗死的发生（见 补充视频 4）。

Fluorescent microscopy showing cerebral microvascular embolization with green vessels, pink microspheres.
图4双光子 体内 嵌顿微球的显微镜检查 示例 体内 小鼠皮层中滞留微球的荧光和双光子图像。（A) 通过颅窗观察 lodges 微球的荧光概览。B选定 ROI 的荧光图像。C,D双光子显微镜图像显示脑微循环中被截留的微球，其中选定感兴趣区域（ROI）进行详细成像。通过计算Z轴堆栈中各像素强度的标准差，将Z轴堆栈图像以二维形式呈现。E-G代表性 在体 双光子显微镜图像显示三处脑微血管栓塞。红色箭头标示出FITC-葡聚糖外渗区域，提示血脑屏障破坏及染料渗漏。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充表1：双光子显微镜系统参数。 请点击此处下载该表格。

补充表 2： FITC-葡聚糖和微球成像的双光子显微镜设置。请点击此处下载该表格。

补充表3： 使用蓝色微球对小鼠脑组织成像的小型三维荧光成像冷冻切片系统设置。请点击此处下载该表格。

补充表 4： 使用蓝色微球进行小鼠脑成像的小型三维荧光成像冷冻切片系统技术参数。 请点击此处下载该表格。

补充表5： 使用红色微球对整只小鼠进行大体积三维荧光成像的冷冻切片系统设置。请点击此处下载该表格。

补充表6：用于全小鼠红微球成像的大体积三维荧光成像冷冻切片系统技术参数。 请点击此处下载该表格。

补充视频 1：在注射过程中，5% BSA 包被的导管管壁上出现微球黏附，以及在 25 mg/mL FITC-葡聚糖微球混合液中出现微球聚集现象。请点击此处下载该视频。

补充视频 2：经 0.1% Tween20 包被的导管，其管壁上有少量微球黏附，但在注射过程中，25 mg/mL FITC-葡聚糖与 0.1% Tween20 的混合液中未出现微球聚集现象。请点击此处下载该视频。

补充视频 3：通过微球对微血管阻塞进行三维分割。请点击此处下载该视频。

补充视频 4：在含有 0.1% Tween20 的 25 mg/ml FITC-葡聚糖混合液中，以高浓度微球进行注射的最终体积。请点击此处下载该视频。

补充文件1： 微球黏附移液器吸头验证。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2：通过免疫组织化学方法评估微栓塞手术后 1、7 和 28 天同侧与对侧大脑半球 CD45 的覆盖情况。请点击此处下载该文件。

讨论

为模拟微血管栓塞，已描述了一种将微球注入小鼠脑循环的方案，该方案可用于研究微栓塞 体内 双光子显微镜技术。该方法优化了微球在脑内的截留，使多个微球被截留在同侧皮层前500 µm范围内，从而实现有效的双光子成像。

脑皮质区域中微球的高数量对于体内双光子成像至关重要。在制备微球混合液过程中，通过使用5% BSA或0.1% Tween20包被移液器吸头，可最大限度减少微球的损失，从而降低微球的黏附性（见补充文件1）。尽管无法定量黏附在吸头上的微球确切数量，但平均强度测量结果反映了包被处理的效果。此外，Tween20似乎还能防止微球在导管内聚集，导致通过导管流动的单个微球数量在视觉上更高，尽管该现象尚未被量化。这降低了大血管阻塞以及形成大面积缺血和缺氧区域的风险，而后者在模拟微血管栓塞的研究目标下是不可取的。此外，当注射含有低浓度Tween20的微球混合液时，小鼠体重下降较少，并能更快恢复至术前体重。Tween20是一种常用的分散剂45,46,47，因此本研究中使用的低浓度预计不会引起任何毒性或对血脑屏障（BBB）完整性产生不良影响。此外，我们的数据显示，BBB渗漏仅发生在微球嵌顿部位附近（或微球通过之后），并非系统性发生，且未引起白细胞总覆盖面积的显著增加（见补充文件2），这支持了使用0.1% Tween20的合理性。总体而言，添加Tween20有助于减少微球聚集，并提高微球向脑循环系统的输送效率，这一点已通过脑组织切片中的微球计数得到证实，最终使双光子显微镜下可观察到足够数量的微球。尽管使用Tween20可增加滞留在脑内的微球数量，但微球注射的变异性仍然存在。多种因素可能导致这种变异：第一，导管或血管内血栓形成可导致微球黏附于血凝块上；第二，气泡的存在可能干扰微球的平稳输送；第三，颈总动脉（CCA）或颈内动脉（ICA）血流恢复不完全可能改变血流动力学，从而促进微球黏附于血管壁或在管腔内聚集。遗憾的是，这些异常情况在注射过程中无法被及时察觉。

聚苯乙烯微球的密度大于水，因此当微球混合物被装入导管后会导致分布不均。大多数微球会沉降在导管壁附近，此处流体摩擦力使其移动速度慢于中央较快的流速。最终导致微球在导管末端最后20 µL的区域内积聚。应避免注射这一浓缩部分，因为它可能引起较大的栓塞和缺血事件。为防止这种情况，微球混合物的制备体积应为预定注射体积的两倍。

微血管栓塞手术需要大量的训练和极高的精确度。其中技术上最具挑战性的步骤之一，是在后交通动脉（PPA）、眼动脉（OA）以及颈内动脉（ICA）的侧支周围放置缝线，以确保微球混合物能够准确输送至威尔氏环（circle of Willis）及大脑中动脉（MCA）供血区域。由于迷走神经紧邻颈总动脉（CCA），且血管直径细小、手术操作空间有限，使得在不造成神经损伤或血管损伤的情况下准确放置缝线变得尤为困难。

尽管可以考虑使用血管夹作为暂时结扎后壁动脉（PPA）的替代方法，但其会引入额外风险。血管夹可能意外脱落，导致血管重新开放。此外，在颈内动脉（ICA）已有一个夹子的情况下，若在PPA处使用第二个夹子，由于空间有限，会增加ICA夹子脱落的可能性。一旦发生这种情况，将引起严重出血，若不立即干预，可能导致实验提前终止。因此，不建议使用血管夹闭合PPA。

本方案采用导管而非注射器33进行微球注射。该方法可更精确地控制注射速度和注射体积，并支持更远距离的微球注射（例如，在显微镜或磁共振成像仪等成像设备内操作时）。

选择ECA而非CCA作为入路点，可使CCA在注射过程中保持完全开放，从而有助于在整个手术过程中维持更接近生理状态的脑灌注。此外，注射微球 通过 与CCA相比，ECA具有其他优势48：i）再灌注期间总操作时间缩短；ii）注射过程中及手术结束后出血风险降低；iii）采用颈总动脉入口法时，拔针后颈总动脉处易形成不稳定的狭窄和血栓49这将导致血流紊乱，并增加微血栓形成的风险，微血栓可能最终进入大脑。此外，进入 通过 CCA将存在永久性闭塞CCA的较大风险，可能导致术后存活期间脑部再灌注不充分，而小鼠Willis环的个体差异较大，会进一步加重这一问题50,51

尽管该方案已得到充分优化，但仍存在一些局限性。首先，观察发现微球在注射过程中沿导管壁移动较慢且分布不均匀，提示进入颈内动脉（ICA）的微球数量可能低于预期。尽管使用了Tween-20以减少黏附，部分微球仍会黏附在移液器吸头、Eppendorf管和导管上。因此，实际注入的微球数量可能低于计算值7.2 x 104 每只小鼠的微球数量。尽管如此，仍有足够数量的微球到达脑部循环，可用于成像 通过 双光子显微镜。注射方案和混合液成分已针对10 µm聚苯乙烯微球进行优化。如果所使用的材料（如吸头、管路、导管）或微球尺寸发生改变，应对溶液配方和注射程序相应地重新评估。其次，针对大血管闭塞最佳方法的研究 通过 大脑中动脉管腔内阻塞研究表明，血管系统的进入 通过 永久性结扎颈外动脉（ECA）会导致咀嚼和吞咽肌缺血52这可能导致小鼠进食量减少，从而引起过度体重下降、运动功能受损以及神经功能缺损加重。然而，这一说法已被其他研究者所质疑。48在本研究中，体重监测显示手术后体重出现预期的下降，但在数天内迅速恢复至术前水平，表明小鼠在永久性颈外动脉结扎后能够恢复并正常进食和饮水。尽管对动物体重进行了监测，但这仅是动物健康状况的间接指标，无法完全排除局部咀嚼功能或运动功能障碍等潜在功能损伤。本研究未进行功能恢复的直接评估，这是本研究的一项局限性。另一项研究比较了血管系统入口处 通过 CCA 或 ECA 并表明其进入 通过 CCA 可能导致脑循环再灌注受损，因此得出结论：应优先采用 ECA 进入法53第三，正确且安全地放置导管，避免引入气泡、血凝块或发生泄漏，同时确保颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA）血流不受阻塞，需要大量练习才能掌握。最后，与其他微栓塞方法（如通过玫瑰红染料注射进行的光化学血栓法）相比22因此，无法预测微球最终将在循环系统中的何处滞留。

本研究未特意设置阴性（假手术）或阳性（光化学血栓）对照组，因为这些对照组对于主要研究目标并无额外价值。该模型成功的标准是滞留在脑微循环内（尤其是颅窗区域）的微球数量，以实现高分辨率成像 体内 显微镜检查。根据定义，假手术组在目标区域不会产生微球，因此无法提供相关的比较依据 体内 成像终点。类似地，纳入光化学血栓模型将涉及一种根本不同的病理生理机制，因此超出了本研究的范围，因为本研究的重点是表征微血管栓塞模型，而非比较不同方法学。本研究未进一步开展针对栓塞及其对血脑屏障或局部神经组织潜在影响的更广泛组织学分析，因为实验设计优先考虑 体内 组织水平验证与三维可视化。

颅窗制备和微血管栓塞模型的详细手术方案，可支持对微血管栓塞相关的微血管改变以及同侧半球静默性脑梗死发生情况进行可靠且可重复的研究。优化的微球混合物制备与注射方法进一步提高了该实验方法的一致性和有效性。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨向 Iwan Dobbe 博士致以诚挚感谢，感谢他开发了用于原位三维图像重建的 Articulus 软件。我们还感谢 Nikolaus Plesnila 教授慷慨提供用于本单位繁育的 TIE2-GFP 小鼠（Jackson 实验室，货号 003658）。

本研究由阿姆斯特丹神经科学研究所（项目编号：813294，资助对象：I.M.）、阿姆斯特丹心血管科学研究所（2021年和2023年设备资助项目，资助对象：I.M.）以及荷兰心脏基金会（项目编号：03-006-2021-T019，资助对象：I.M.）提供资金支持。 

本研究还由荷兰心脏基金会和荷兰脑基金会资助，并与荷兰心血管联盟合作开展，项目编号为01-002-2022-0126 CONTRAST 2.0。此外，部分研究经费来自Stryker、Medtronic和Penumbra的无限制资助。资助方未参与研究设计、监测、数据收集、统计分析、结果解释或论文撰写。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
27号针头（0.1×16 mm）Terumo-27号针头（步骤2.1.2）
Articulus 软件--3D分析软件（步骤4.2.2） && 4.3.3)
聚维酮碘 30 ml（100 mg/ml）Mylan8712207037612聚维酮碘/碘（步骤 1.1.8） && 2.2.10.)
C&B 单体Sun Medical7111超级胶水的组分（步骤 1.3.1）
碳素钢手术刀片（编号15）Swann-Morton205用于刮擦颅骨的刀片（步骤 1.2.4）
卡洛芬（50 mg/ml）硕腾-镇痛药物（步骤 1.1、1.6、2.2） && 2.8)
催化剂Sun Medical7110超级胶水的组分（步骤 1.3.1.）
导管（内径 0.31，外径 0.64 mm）Freudenberg228-0661透明导管（步骤 2.1.1.）
定制组织钩--组织钩（步骤 2.3.4.）
棉签--棉签（步骤 1.1.8，1.2.4） && 1.5.1.)
盖玻片Warner Instruments64-0724颅窗盖玻片（步骤 1.4.2.）
定制小鼠头部固定杆--用于成像固定装置的头杆（步骤 1.3.2） 
定制小鼠成像固定装置 --小鼠成像固定装置（步骤 1.4.1. && 3.1.1.)
定制立体定位仪框架--立体定向框架（步骤 1.1.7.）
牙骨质液Kulzer64707937牙科水泥组分（步骤 1.3.3.）
牙科粘固粉粉末Kulzer64707945牙科水泥组分（步骤 1.3.3.）
牙科钻头 Saeshin L-206钻孔（步骤 1.4.3.）
地塞米松（4 mg/ml）Centrafarm-术前用药（步骤1.1.4）
解剖镊Braun-AesculapBD023R镊子（步骤 1.2.2. && 2.3.2.)
钻头 PK/100,5（0.5 mm）精细科学19007-05钻头（步骤 1.4.3.）
Duratears（3.5 克）爱尔康-眼膏（步骤 1.1.8） && 2.2.7.)
环氧树脂胶（1g）Pattex9H PSMG3X环氧胶（步骤 1.5.2. && 2.1.1.)
精细微型镊子 直头精细科学工具Dumont #5精细微型镊子（步骤 2.6.6.）
FITC-葡聚糖（70 KDa）Sigma-AldrichFD70SFITC-葡聚糖溶液（步骤 2.5.2.）
异氟烷（1000 mg/g）Laboratorios Karizoo S.A.118938麻醉（步骤 1.1.6） && 2.2.5.)
大型三维荧光成像冷冻切片机 定制-大型3D-FICS（步骤4.3.3）
利多卡因（100 mg/ml）杨树-局部麻醉药（步骤 1.2.3. && 2.2.10)
微型剪刀 Vannas 3-3/8 英寸Braun-AesculapOC498R微型剪刀（步骤 2.6.2）
带圆柄微型缝合打结镊Braun-AesculapFD280R微型持针器（步骤 2.3.3）
带圆柄弯头微型持针钳Braun-AesculapFD281R微持针器弯曲（步骤 1.5.1. && 2.3.3.)
微型血管夹Braun-AesculapFD562R血管夹（步骤 2.6.1.）
微导管（内径 0.23114 mm，外径 0.27432 mm）微腔微导管（步骤 2.1.1.）
小鼠加热垫与直肠探头斯托尔廷53800R加热垫（步骤 1.1.2. && 2.2.2.)
NG2-DsRed 小鼠美国巴港杰克逊实验室，货号 008241
聚乙二醇单月桂酸山梨醇酯Sigma-Aldrich9005-64-5Tween20（步骤 2.5.2.）
聚苯乙烯荧光微球 蓝色（365/415）InvitrogenF8829蓝色微球（步骤 2.5.1.）
聚苯乙烯FluorSpheres红色（580/605）InvitrogenF8834红色微球（步骤 2.5.1.）
恢复笼--恢复笼（步骤 1.6.2. && 2.8.2.)
反向切割3/8弧形针（12毫米）带缝线Bbraun0762067缝合（步骤 2.7.5）
罗哌卡因ïne（2 mg/ml）--药物  （步骤 1.1.5）
小型三维荧光成像冷冻切片机  定制小规模3D-FICS（步骤4.2.2）
SpongostanEthiconMS0005Spongostan（步骤 1.4.6）
手术显微镜Euromex Microscopen B.V.NZ.1903-B手术显微镜（步骤 1.2.2.1.1.）
手术剪Braun-AesculapBC303R手术剪（步骤 1.2.2. && 2.3.2.)
注射泵（适用于1 ml注射器）哈佛仪器70-22081 ml 注射泵（步骤 2.5.6）
线，100米  4/0 1.5  BbraunF11340354/0.15 螺纹（步骤 2.4.3）
TIE2-GFP 小鼠美国巴港杰克逊实验室，货号 003658
超纯除尘刷ThorlabsCA6-EU压缩空气（步骤 1.2.5）
通用聚合物透明剂Sun MedicalT058E超级胶水的组分（步骤 1.3.1.）

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