使用标准显微镜和视频分析对斑马鱼胚胎进行功能性心脏成像：在环境和生物医学研究中的应用

摘要

该协议描述了一种低成本的光学显微镜方法，用于评估斑马鱼胚胎的心脏形态和功能，无需先进的成像系统即可对发育性心脏毒性进行可重复的评估。

摘要

斑马鱼 （Danio rerio） 因其与人类的遗传相似性、早期发育过程中的光学透明度以及对 体内 成像的适应性而被广泛用作心血管研究中的脊椎动物模型。本手稿提出了一种标准化的、可访问的方案，用于使用明场光学显微镜评估受精后 96 小时 （hpf） 斑马鱼胚胎的心脏形态和功能。该方法包括胚胎采集、形态学筛查、琼脂糖固定、跳动心脏的视频记录以及基于图像的心脏参数分析，例如心室尺寸、每搏输出量、心率、射血分数和心输出量。计算基于使用开源软件（例如 ImageJ、Zembryo Analyzer）对心室的几何近似值进行。该协议能够使用广泛使用的设备对心脏性能进行定量评估，使其适用于资源有限和高通量筛查的实验室。在这项研究中，通过在光学显微镜下记录跳动的心脏来分析 96 hpf 斑马鱼幼虫。测量的关键心脏参数包括心室尺寸，用于计算每搏输出量和心率，由每分钟心跳数确定。由此得出射血分数和心输出量，以评估整体心脏性能。健康胚胎的代表性结果显示心室收缩一致，功能指标稳健，而暴露于镉的胚胎则显示心脏形态受损，心输出量显着降低。总体而言，该方法对于检测发育性心脏毒性非常重要，并为评估斑马鱼早期 发育过程中体内 心脏功能提供了一种可重复的非侵入性方法。

引言

斑马鱼（Danio rerio）因其与人类的遗传同源性、体外受精、胚胎的光学透明度和^{快速发育而}成为心血管研究中重要的脊椎动物模式生物^1,2。这些特征，加上成本效益和可扩展性，使斑马鱼特别适合研究早期心脏形态发生、先天性心脏缺陷和发育性心脏毒性^3。调节脊椎动物物种心脏发育的基因和信号通路的高度保守进一步加强了它们的相关性⁴。特别是，斑马鱼模型对理解正常和^{病理条件下心脏}形成、重塑和功能的遗传和生理基础做出了重大贡献^5,6。

在结构上，斑马鱼心脏由单个心房和单个心室组成，以线性方式连接，缺乏哺乳动物四腔心脏典型的隔膜。尽管如此，斑马鱼心脏概括了人类心脏生理学的关键方面，包括心内膜和心肌层的存在、心脏传导系统、节律性收缩活动以及神经激素因子的调节 ^7,8。重要的是，斑马鱼心脏表现出关键的形态发生事件，包括心管的右向环以及随后心腔的扩张和描绘，类似于人类胚胎发育中的事件⁹。此外，斑马鱼心脏保持着高等脊椎动物中的许多电生理和血流动力学特性，包括动作电位传播、收缩力调节和钙循环动力学⁷。

鉴于这些相似性，斑马鱼已成为毒理学的关键模型，特别是在评估化学品暴露如何影响心脏发育和功能方面¹⁰。然而，该领域的主要限制之一仍然是对技术要求很高的成像技术的依赖。传统的高分辨率方法，如共聚焦或光片显微镜，或表达荧光心脏标志物的转基因系，虽然功能强大，但成本高昂，并且需要大量的技术基础设施¹¹。这些限制限制了基于斑马鱼的心脏表型分析的更广泛实施，特别是在资源有限的环境中或需要高通量筛选的应用¹²。

因此，越来越需要方法学方法，以便使用广泛使用的仪器对心脏功能进行可靠的评估。现有文献确实包含此类简化方法的示例，包括基于明场或光学显微镜的成像与手动或半自动测量相结合^13,14。然而，这些技术并不总是标准化的，并且在协议、时间和图像分析参数方面通常因研究小组而异。这种变异性阻碍了可重复性并限制了跨研究的比较价值，特别是在胚胎毒理学、药理学或生态毒理学等领域，在这些领域，定量心血管终点越来越多地被用作发育安全性的指标¹⁵。

在这种情况下，斑马鱼为 筛查体内发育性心脏毒性提供了有价值的模型。监管机构和科学联盟越来越认识到斑马鱼在这一领域的相关性，特别是考虑到它们能够检测可能先于结构畸形或致死率的心脏功能的细微变化¹⁴。透明的胚胎可以直接观察跳动的心脏，无需侵入性手术即可对心脏性能进行时间解析的实时评估。此外，斑马鱼心脏解剖结构的简单性有助于使用基本成像技术量化心房和心室动力学，包括腔室尺寸和中风参数¹⁵。

本文描述的方法的总体目标是为使用标准光学显微镜评估斑马鱼胚胎心脏性能的形态功能评估提供一种可访问的、可重复的方法。通过专注于简单的视频采集和事后图像分析，该技术旨在填补高分辨率成像和定性观察评分之间的方法学空白。该协议适用于不同的实验室环境和资源水平，特别适用于以心脏功能评估为重点的毒理学、药理学或遗传学研究。

除了其实际优势外，该协议还通过提供整合的分步工作流程为该领域做出了贡献，该工作流程将常用技术组合到一个可重复的管道中。虽然文献中存在类似的方法，但很少有提供这种级别的可视化文档集成，这可能支持更广泛的采用和标准化。

方案

所有涉及斑马鱼胚胎的程序均按照当地伦理委员会批准的机构动物护理和使用指南进行。斑马鱼的饲养和胚胎作是根据欧洲关于保护用于科学目的的动物的指令 2010/63/EU 进行的。本研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 斑马鱼的维护和胚胎采集

1. 将成年斑马鱼（Danio rerio）维持在28°C±1°C的循环水族箱系统中，在14小时光照/10小时黑暗循环下。
2. 每天用适合斑马鱼的高蛋白商业片状或颗粒状饲料喂鱼 3 次。
3. 下午晚些时候，将成年斑马鱼转移到配备透明网的繁殖池中，将鱼与池底分开。使用2：3的男女比例，用可拆卸的隔板隔开过夜。
4. 第二天早上，取下隔板并加入 50-100 mL 冷水族箱水以触发产卵。
5. 受精后（30-60分钟内），将成鱼从养殖池中取出，以防止胚胎捕食。
6. 使用塑料巴斯德移液器收集胚胎，并将它们转移到装有 E3 胚胎培养基的无菌培养皿中。
   注意：E3胚胎培养基是一种缓冲盐溶液，模仿斑马鱼细胞外液的离子组成。通过将 580 mg NaCl、27 mg KCl、97 mg CaCl₂·2H₂O 和 163 mg MgCl₂·6H₂O 溶解在约 800 mL 超纯蒸馏水中来制备 E3 培养基。使用 1 N NaOH 或 HCl 将 pH 值调节至 7.2。一旦 pH 值调整并稳定，用蒸馏水将总体积提高到 1,000 mL。通过0.22μm膜过滤器过滤溶液对溶液进行灭菌。每升添加 100 μL 1% 亚甲蓝以防止真菌生长。将制备好的E3培养基储存在4°C下，使用前加热至室温。
7. 在28.5°C下孵育胚胎，在具有受控的明/暗循环（14小时/ 10小时）的培养箱中孵育。
   注意：限制每个培养皿的胚胎数量（例如，每100毫米培养皿50个），以避免过度拥挤，从而导致缺氧和发育缺陷。
8. 每天更换 E3 培养基以保持最佳发育条件。

2. 形态正常胚胎的选择

1. 在受精后约6小时（hpf;受精后经过的时间），将受精胚胎转移到含有新鲜E3培养基的干净培养皿中。
2. 在立体显微镜下以 40 倍放大倍率检查胚胎。
3. 丢弃任何有发育异常迹象的胚胎，包括：
   1. 凝固胚胎：通过其不透明或白色的外观、颗粒状质地以及没有可区分的内部结构来识别。凝血是无法存活的迹象，通常发生在受精后的最初几个小时内。
   2. 发育延迟：排除尚未进展到预期形态阶段（例如，缺乏外皮或不规则的细胞排列）的胚胎，表明活力受损。
   3. 卵黄囊异常：寻找破裂、不规则或不对称的卵黄囊，这可能表明发育有缺陷或渗透失衡。
   4. 外部畸形：排除体轴扭曲、细胞质量分布不规则或绒毛膜形状异常的胚胎。
   5. 绒毛膜完整性差：避免使用绒毛膜塌陷、干瘪或破裂的胚胎，因为它们可能会受到机械或渗透应激。
4. 仅保留符合以下所有标准的胚胎：（1）透明对称的体型，（2）均匀的外胚层进行，细胞分层光滑，（3）清晰可见的胚层和完整的球形绒毛膜。
   注意：在6 hpf时，形态正常的斑马鱼胚胎呈圆顶形，卵黄顶部有一个清晰定义的囊胚层。细胞质应分布均匀，无颗粒状斑点，无碎裂或结块的迹象。

3. 使用光学显微镜进行心脏成像

1. 在96 hpf下，将胚胎单独安装在装有E3培养基的35 mm玻璃底培养皿中。
2. 在E3培养基中制备1.2%的低熔点琼脂糖，预热至37-38°C。 使用热块或水浴保持温度。
3. 将每个胚胎嵌入琼脂糖中，并在琼脂糖凝固之前使用细镊子轻轻横向定向。
   注意： 确保心脏清晰可见并朝向侧面，心房和心室位于同一焦平面上。
4. 使用配备数码相机的倒置光学显微镜录制专门针对斑马鱼胚胎心脏区域的 30 秒高分辨率视频。以 40× 或 100× 的放大倍率捕获视频，以确保心脏结构和心跳的清晰可视化。
   1. 以每秒 30 帧 （fps） 的帧速率以未压缩或最小压缩格式（例如 AVI 或 MOV）录制视频，以保持图像质量并允许准确分析心脏运动动力学。这种设置可以详细评估功能参数，例如心率、收缩节律和腔室形态。

4. 心功能的图像分析和测量

1. ImageJ 中的手动测量
   1. 导入视频。使用 File > Import > AVI 在 ImageJ 中打开视频。如果需要，通过“图像>堆栈”>“将图像转换为堆栈”将视频转换为图像堆栈。
   2. 校准测量刻度。使用 “分析”>“设置刻度”，输入已知的视场直径（例如，10×物镜为 4 mm），并启用“全局”选项以将刻度应用于所有测量值。
   3. 定义感兴趣区域 （ROI）。使用ROI工具（直线、多边形、矩形）标记收缩末期和舒张末期的长心室轴和短心室轴（图1）。通过 分析>工具> ROI Manager 管理投资回报率。
2. 测量用于计算功能参数的直径和面积（补充文件 1）
   1. 使用公式 1 确定心室表面积（使用椭圆近似）：
      VA = （（D_L - D_S）/2） × π （1）
      其中 DL = 长直径，DS = 短直径。
   2. 使用椭球体积公式（公式 2）估计 ED 和 ES 的心室容积
      VV = （1/6） × π × D_L × D_S² （2）
   3. 使用公式 3 和公式 4 计算面积变化分数 （FAC） 和缩短分数 （FS）：
      FAC （%） = （（VAD - VAS） / VAD） × 100 （3）
      FS （%） = （（D_L - D_S） / D_L） × 100 （4）
      其中 VAD = 急诊室的心室面积;VAS = ES 处的心室面积;DDL = ED 处的长轴;DSS = ES 处的短轴。
   4. 使用公式 5 确定每搏输出量 （SV）：
      SV = VVD - VVS （5）
   5. 使用公式 6 计算射血分数 （EF）：
      EF （%） = （SV / VVD） × 100 （6）
3. ZembryoAnalyzer 中的自动分析
   1. 启动并加载捕获的视频。打开 ZembryoAnalyzer （可在以下位置获得：https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser），然后使用 文件>打开视频 导入所需的视频。
   2. 执行自动心脏区域检测。单击 “检测心脏 ”按钮，允许软件根据视频帧的亮度波动自动定位感兴趣区域 （ROI）。如果需要，使用矩形、椭圆或多边形工具手动调整 ROI。
   3. 执行自动心率估计。让软件分析检测到的 ROI 内的亮度变化。心率是通过识别强度的周期性峰值来计算的。该算法应用阈值滤波来消除噪声和误报，确保准确的节拍检测。
   4. 导出结果。使用 导出> PDF 或导出> Excel 导出心率数据和相应的强度图。（可选）将原始数据保存为 CSV 或 JSON 格式，以供下游统计处理。
4. 使用公式 7 计算心输出量 （CO）：
   CO = SV × HR （7）

5. 使用毒物进行心脏毒性测试的方案适用性评估

1. 称量氯化镉，直接溶解在 E3 培养基中至终浓度为 3 mg/L 来制备工作溶液。
2. 在受精后24小时（hpf）将胚胎转移到含有镉溶液的培养皿中。
3. 将胚胎在镉溶液中孵育至 96 hpf，在 28°C±1°C 下，光循环为 14 小时/黑暗循环 10 小时。
4. 每天更换镉溶液以保持一致的暴露。
5. 如前所述，在 96 hpf 下，记录胚胎的高分辨率心脏视频，以便随后测量和分析心脏功能参数。
   注意：使用此镉暴露方案来模拟斑马鱼胚胎的发育性心脏毒性，如之前的研究¹⁶中所述。

6. 数据管理和复制

1. 在结构化电子表格中记录所有测量结果。包括胚胎 ID、治疗组和所有计算参数。
2. 确保每组至少分析 20-30 个胚胎以获得统计可靠性。
   注意：心脏区域的视频记录可以在以后的时间点存储和分析，而不会影响形态测量或功能测量的准确性。在我们的内部比较中，即时和延迟分析的结果在关键心脏参数上是一致的，支持基于延迟视频的评估的可重复性。

结果

该协议允许定量分析受精后96小时（hpf）斑马鱼的心脏发育，包括结构和功能参数，如心室大小，收缩力，每搏输出量和射血分数。

图 2 显示了斑马鱼心室在舒张末期 （ED） 和收缩末期 （ES） 的代表性明场图像，以及相应的条形图，显示平均心室面积 （VA） 和体积 （VV） 测量值（n = 30 个胚胎）。心室呈椭圆形，表现出有节律的收缩，ED 和 ES 之间有明显的尺寸差异，能够量化心脏功能。在ED时，平均VA和VV分别为0.017 mm²±0.002 mm²和0.0005 mm²±0.0001 mm³。在 ES 时，VA 和 VV 降至 0.012 mm²±0.002 mm² 和 0.0003 mm³，反映了正常发育条件下的有效心室收缩。

图 3显示了来自一组健康斑马鱼胚胎（n = 30）的代表性定量数据，重点关注心室输出量的关键指...

讨论

该协议中的重要步骤之一是在受精后6小时（hpf）准确识别和选择形态正常的胚胎。表现出凝血、发育迟缓或结构异常迹象的胚胎会严重损害心血管测量的一致性和可解释性。早期切除无法存活或畸形的胚胎可确保评估心脏发育和功能的可靠基线。在成像过程中正确定位胚胎，确保心脏清晰可见的横向定位，对于获得可重复和可解释的结果同样重要。

该协议依赖于心动周期的高对比度、高帧率成像，然后使用免费提供的软件（如Zembryo Analyzer¹⁶）进行基于图像的形态学分析。虽然该平台允许对功能性心脏参数进行稳健和无创的量化，包括心室尺寸、收缩指数、每搏输出量、射血分数和心输出量，但它需要在舒张末期和收缩末期精确同步图像采集。故障排除通常涉及调整照明、放大倍率或帧时间，以避免运动模糊或错误识别心相。可以集成替代软件解决方案或自定义图像分析管道（例如，FIJI/ImageJ 宏或 AI 辅助跟踪工具）以克服标准工具的局限性，特别是在高通量设置中^17,18

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 和微型;m 膜过滤器	米利波尔	SLGP033RS	0.22 和微型;m 膜过滤器
1 N HCl溶液	西格玛-奥尔德里奇	320331	盐酸溶液用于pH调节
1 N NaOH 溶液	西格玛-奥尔德里奇	72068	用于pH调节的氢氧化钠溶液
成年斑马鱼（Danio rerio）	本地繁殖设施	无	模式生物
带网状的繁殖缸	/	/	成虫分离产卵
CaCl？·2H？O	西格玛-奥尔德里奇	C5670	氯化钙二水合物，试剂级
氯化镉	西格玛-奥尔德里奇	202908	用于暴露的有毒物质，剂量为3毫克/升
商业斑马鱼饲料	迷你奶奶，营养宠物，戈尔尼·米拉诺瓦茨	/	适合斑马鱼的高蛋白片状或颗粒饲料
数码相机（显微镜）	滨松光子学	ORCA-Flash4.0 V3	用于30帧/秒视频录制的摄像机
加热块	埃彭多夫	5382000010	温控加热装置
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	https://imagej.nih.gov/ij/	开源图像处理软件
倒置光学显微镜	尼康	Ti2-E	带数码相机的显微镜，40次以上;以及100&次;目标
KCl	西格玛-奥尔德里奇	P3911	氯化钾，试剂级
低熔点琼脂糖（1.2%）	赛莫飞世尔科学	16520050	用于胚胎植入
亚甲蓝（1%）	西格玛-奥尔德里奇	M9140	向E3培养基添加抗真菌剂
MgCl？·6H？O	西格玛-奥尔德里奇	M9272	六水合氯化镁，试剂级
氯化钠	西格玛-奥尔德里奇	S9888	氯化钠，试剂级
无菌培养皿（100毫米）	科宁	430167	用于胚胎培养的塑料培养皿
无菌培养皿（35毫米）	MatTek公司	P35G-1.5-14-C	用于装载胚胎的玻璃底培养皿
超纯蒸馏水	米利波尔	Milli-Q参考	制备溶液的水
Zembryo分析软件	GitHub （Darko Puflovic）	https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser	心脏功能分析软件