本方案描述了一种低成本的光学显微镜方法，用于评估斑马鱼胚胎的心脏形态和功能，可在无需先进成像系统的情况下，对发育性心脏毒性进行可重复的评价。
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摘要
摘要
斑马鱼（斑马鱼在心血管研究中被广泛用作脊椎动物模型，因其与人类具有较高的遗传相似性，且在早期发育阶段具有光学透明性，并易于进行 体内 成像。本文提供了一种标准化且易于实施的实验方案，用于在受精后96小时（hpf）利用明场光学显微镜评估斑马鱼胚胎的心脏形态与功能。该方法包括胚胎采集、形态学筛选、琼脂糖包埋固定、心脏搏动视频录制，以及基于图像的心脏参数分析，如心室尺寸、每搏输出量、心率、射血分数和心输出量。相关计算基于对心室几何形状的近似模型，并使用开源软件（如ImageJ、Zembryo Analyzer）完成。该方案利用广泛可及的设备实现心脏功能的定量评估，适用于资源有限的实验室及高通量筛选。在本研究中，通过在光学显微镜下记录96 hpf斑马鱼幼鱼的心脏搏动进行分析。关键心脏参数包括心室尺寸，用于计算每搏输出量；心率则通过每分钟搏动次数确定。由此进一步推导出射血分数和心输出量，以评估整体心脏功能。来自健康胚胎的代表性结果显示出一致的心室收缩及稳定的功能指标，而暴露于镉的胚胎则表现出心脏形态受损及显著升高的 心输出量。总体而言，该方法对于检测发育性心脏毒性具有重要意义，并为评估心脏功能提供了一种可重复、非侵入性的方法。 体内 在斑马鱼早期发育过程中。
引言
斑马鱼（Danio rerio）由于与人类具有高度保守的基因同源性、体外受精、胚胎光学透明以及快速发育等特性，已成为心血管研究中重要的脊椎动物模式生物1,2。这些特点，加之成本低廉和实验可扩展性强，使斑马鱼特别适用于早期心脏形态发生、先天性心脏缺陷以及发育性心脏毒性的研究3。斑马鱼在该领域的重要性还体现在调控心脏发育的基因和信号通路在脊椎动物物种间高度保守4。特别是，斑马鱼模型已为理解正常和病理条件下心脏形成、重塑及功能的遗传与生理基础做出了重要贡献5,6。
从结构上看，斑马鱼心脏由一个心房和一个心室组成，呈线性连接，缺乏哺乳动物四腔心所特有的分隔结构。尽管如此，斑马鱼心脏重现了人类心脏生理学的关键特征，包括存在心内膜和心肌层、心脏传导系统、节律性收缩活动，以及受神经激素因子的调控7,8。重要的是，斑马鱼心脏表现出关键的形态发生事件，包括心脏管向右弯曲以及随后心腔的扩张与界定，这些过程类似于人类胚胎发育中的心脏形成9。此外，斑马鱼心脏保留了高等脊椎动物中的许多电生理和血流动力学特性，包括动作电位传导、收缩力调节以及钙循环动态7。
鉴于这些相似性，斑马鱼已成为毒理学研究中的关键模型，尤其适用于评估化学物质暴露对心脏发育和功能的影响10。然而，该领域的主要局限之一仍是依赖技术要求较高的成像技术。传统的高分辨率方法，如共聚焦显微镜或光片显微镜，以及表达荧光心脏标记物的转基因品系，尽管功能强大，但成本高昂且需要复杂的技術基础设施11。这些限制因素阻碍了基于斑马鱼的心脏表型分析的广泛应用，特别是在资源有限的环境中，或需要高通量筛选的应用场景中12。
因此，迫切需要采用方法学手段，利用广泛可用的仪器对心脏功能进行可靠评估。现有文献中确实存在一些简化的技术方法，包括基于明场或光学显微镜的成像结合人工或半自动测量13,14。然而，这些技术并非总是标准化的，在不同研究团队之间，其在实验方案、时间点选择和图像分析参数方面往往存在差异。这种变异性阻碍了研究结果的可重复性，并限制了不同研究之间的可比性，尤其是在胚胎毒理学、药理学或生态毒理学等领域，定量心血管终点指标正越来越多地被用作发育安全性的评价指标15。
在此背景下，斑马鱼为发育性心脏毒性筛选提供了一个有价值的模型 体内. 监管机构和科研联盟 increasingly 认识到斑马鱼在这一领域的重要性，尤其是其能够检测心脏功能的细微变化，而这些变化可能早于结构畸形或致死性效应的出现14透明的胚胎使得心跳过程可直接观察，无需侵入性操作即可实现对心脏功能的实时动态评估。此外，斑马鱼心脏解剖结构简单，利用基本的成像技术即可对心房和心室的动力学特征进行量化分析，包括心腔尺寸和搏出参数等。15.
本文所述方法的总体目标是利用标准光学显微镜，提供一种简便且可重复的斑马鱼胚胎心脏功能形态学评估方法。该技术通过简单的视频采集和事后图像分析，旨在填补高分辨率成像与定性观察评分之间的方法学空白。本方案可适应不同实验室条件和资源水平，尤其适用于以心脏功能评价为重点的毒理学、药理学或遗传学研究。
除了具有实际优势外，该方案还通过提供一个整合的、逐步操作的工作流程，将常用技术结合到一个可重复的流程中，从而推动了领域的发展。尽管文献中已存在类似的方法，但很少有方法能提供如此程度的整合以及可视化记录，这可能有助于更广泛的应用和标准化。
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方案
所有涉及斑马鱼胚胎的操作均按照当地伦理委员会批准的机构动物护理和使用指南进行。斑马鱼的饲养和胚胎操作均符合欧盟关于用于科学目的动物保护的指令 2010/63/EU。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 斑马鱼的饲养与胚胎收集
- 在循环水族系统中饲养成年斑马鱼（Danio rerio），水温维持在 28 °C ± 1 °C，光照周期为 14 小时光照/10 小时黑暗。
- 每天喂食三次高蛋白商业薄片或颗粒饲料，确保饲料适合斑马鱼食用。
- 在傍晚时分，将成年斑马鱼转移至配备透明网格的繁殖缸中，使鱼体与缸底隔离。按雄鱼与雌鱼 2:3 的比例放入，并使用可拆卸隔板将雌雄鱼分隔过夜。
- 次日清晨，移除隔板并加入 50–100 mL 冷的养殖用水以诱导产卵。
- 受精完成后（30–60 分钟内），将成鱼从繁殖缸中移出，以防止其捕食胚胎。
- 使用塑料巴斯德移液管收集胚胎，并将其转移至盛有 E3 胚胎培养基的无菌培养皿中。
注：E3 胚胎培养基是一种缓冲盐溶液，其离子组成模拟斑马鱼细胞外液。配制方法为：将 580 mg NaCl、27 mg KCl、97 mg CaCl2·2H2O 和 163 mg MgCl2·6H2O 溶解于约 800 mL 超纯蒸馏水中，用 1 N NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.2。待 pH 稳定后，用蒸馏水定容至 1,000 mL。通过 0.22 µm 微孔滤膜过滤灭菌。每升培养基中加入 100 µL 1% 亚甲蓝溶液以抑制真菌生长。配制好的 E3 培养基储存于 4 °C，使用前恢复至室温。 - 将胚胎置于 28.5 °C 的培养箱中孵育，光照周期控制为 14 小时光照/10 小时黑暗。
注：每培养皿中的胚胎数量应加以限制（例如，100 mm 培养皿中不超过 50 枚），避免过度拥挤，以防缺氧及发育异常。 - 每日更换 E3 培养基，以维持最佳发育条件。
2. 形态学正常胚胎的筛选
- 受精后约6小时（hpf；自受精起经过的时间），将受精胚胎转移至含有新鲜E3培养基的洁净培养皿中。
- 在40倍体视显微镜下观察胚胎。
- 弃去显示发育异常迹象的胚胎，包括：
- 凝固型胚胎：表现为外观浑浊或发白、质地呈颗粒状，且无明显可辨的内部结构。凝固是胚胎无活力的表现，通常在受精后数小时内发生。
- 发育延迟：排除未进展至预期形态阶段的胚胎（例如缺乏原肠胚外包运动或细胞排列不规则），提示其活力受损。
- 卵黄囊异常：观察是否存在破裂、不规则或不对称的卵黄囊，这可能提示发育缺陷或渗透压失衡。
- 外部畸形：排除体轴扭曲、细胞团分布不均或绒毛膜形状异常的胚胎。
- 绒毛膜完整性差：避免使用绒毛膜塌陷、皱缩或破裂的胚胎，因其可能受到机械或渗透压应激影响。
- 仅保留满足以下所有标准的胚胎：（1）体形透明且对称，（2）外包运动均匀进展并具有平滑的细胞层结构，（3）胚盘清晰可见且绒毛膜完整呈球形。
注：在6 hpf时，形态正常的斑马鱼胚胎呈圆顶状，胚盘清晰，覆盖于卵黄顶端。细胞质应均匀分布，无颗粒状斑点，无碎片化或聚集现象。
3. 使用光学显微镜进行心脏成像
- 在96 hpf时，将胚胎 individually 置于装有E3培养基的35 mm玻璃底培养皿中。
- 制备1.2%低熔点琼脂糖溶于E3培养基中，并预热至37–38 °C。使用加热块或水浴维持该温度。
- 在琼脂糖凝固前，将每个胚胎包埋于其中，并用精细镊子轻轻将其调整为侧卧位。
注意：确保心脏清晰可见且侧向朝上，心房和心室处于同一焦平面。 - 使用配备数字相机的倒置光学显微镜，对斑马鱼胚胎的心脏区域进行高分辨率视频录制，持续30秒。以40×或100×放大倍数拍摄，以确保心脏结构和心跳的清晰可视化。
- 以每秒30帧（fps）的帧率录制视频，采用无压缩或轻微压缩格式（如AVI或MOV），以保持图像质量并允许对心脏运动动力学进行准确分析。该设置可实现对心率、收缩节律和心腔形态等功能参数的详细评估。
4. 心脏功能的图像分析与测量
- 在 ImageJ 中进行手动测量
- 导入视频。使用 ImageJ 打开视频文件 文件 > 导入 > AVI 如有需要，将视频转换为图像序列 通过 图像 > 堆叠 > 将图像转换为堆栈。
- 校准测量尺度。使用 分析 > 设定比例尺输入已知的视场直径（例如，10×物镜对应4 mm），并启用全局选项以将该比例尺应用于所有测量。
- 定义感兴趣区域（ROI）。在收缩末期和舒张末期，使用 ROI 工具（线、多边形、矩形）标记心室的长轴和短轴。图1）。管理 ROI 通过 分析 > 工具 > ROI 管理器
- 测量直径和面积以计算功能参数（补充文件 1)
- 使用公式1（通过椭圆近似法）计算心室表面积：
VA = ((D_L - D_S)/2) × π （1）
其中 DL = 长径，DS = 短径。 - 使用椭球体积公式（公式 2）估算舒张末期和收缩末期的心室容积
VV = (1/6) × π × D_L × D_S² (2) - 使用公式3和公式4计算分数面积变化率（FAC）和分数缩短率（FS）：
荧光激活细胞分选 (%) = ((VAD - VAS) / VAD) × 100 （3）
FS (%) = ((D_L - D_S) / D_L) × 100 (4)
其中，VAD = 舒张末期心室面积；VAS = 收缩末期心室面积；DDL = 舒张末期长轴直径；DSS = 收缩末期短轴直径。 - 使用公式 5 计算每搏输出量（SV）：
SV = VVD - VVS （5） - 使用公式6计算射血分数（EF）：
EF (%) = (SV / VVD) × 100 （6）
- 使用公式1（通过椭圆近似法）计算心室表面积：
- ZembryoAnalyzer 中的自动化分析
- 启动并加载已捕获的视频。打开 ZembryoAnalyzer （可在以下网址获取：https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser），并使用 文件 > 打开视频 导入所需的视频。
- 执行自动心脏区域检测。点击 检测心脏 单击按钮，使软件能够根据视频帧间的亮度波动自动定位感兴趣区域（ROI）。如有需要，可使用矩形、椭圆或多边形工具手动调整ROI。
- 执行自动心率估测。让软件分析检测到的感兴趣区域（ROI）内的亮度变化。通过识别强度信号中的周期性峰值来计算心率。算法应用阈值滤波以去除噪声和假阳性，确保准确检测心跳。
- 导出结果。使用相应强度图导出心率数据 导出 > PDF 或导出 > Excel 可选择将原始数据保存为 CSV 或 JSON 格式，以便进行后续统计分析。
- 使用公式 7 计算心输出量（CO）：
CO = SV × HR （7）
5. 使用毒性物质评估该方案在心脏毒性测试中的适用性
- 称取氯化镉，并将其直接溶解于E3培养基中，配制终浓度为3 mg/L的工作液。
- 在受精后24小时（hpf）将胚胎转移至含有镉溶液的培养皿中。
- 将胚胎在含镉溶液中于28 °C± 1 °C条件下孵育至96 hpf，光照周期为14小时光照/10小时黑暗。
- 每天更换镉溶液，以维持稳定的暴露浓度。
- 在96 hpf时，按照先前所述方法记录胚胎的高分辨率心脏视频，用于后续心脏功能参数的测量与分析。
注：采用此镉暴露方案模拟斑马鱼胚胎发育过程中的心脏毒性，具体方法参见先前研究16。
6. 数据管理与重复实验
- 将所有测量数据记录在结构化的电子表格中，包括胚胎编号、处理组别及所有计算得到的参数。
- 每组应至少分析 20–30 个胚胎，以确保统计可靠性。
注意：心脏区域的录像可储存并在后续时间点进行分析，且不会影响形态测量或功能测量的准确性。在我们内部的比较中，即时分析与延迟分析在主要心脏参数上的结果具有一致性，表明基于录像的延迟评估具有可重复性。
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结果
本方案可对受精后96小时（hpf）斑马鱼心脏发育进行定量分析，包括心室大小、收缩力、每搏输出量和射血分数等结构与功能参数。
图2展示了斑马鱼心室在舒张末期（ED）和收缩末期（ES）的代表性明场图像，以及相应的条形图，显示平均心室面积（VA）和体积（VV）的测量结果（n = 30个胚胎）。心室呈椭球形，表现出节律性收缩，ED与ES之间存在明显的尺寸差异，可用于量化心脏功能。在ED时，平均VA和VV分别为0.017 mm² ± 0.002 mm²和0.0005 mm³ ± 0.0001 mm³。在ES时，VA和VV分别减少至0.012 mm² ± 0.002 mm²和0.0003 mm³，反映了在正常发育条件下有效的心室收缩。
图 3 展示了来自一组健康斑马鱼胚胎（n = 30）的代表性定量数据，重点关注心室输出的关键指标。平均每搏输出量（SV）为 0.213 nL ± 0.1 nL，心输出量（CO）达到 27....
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讨论
本方案中的一个重要步骤是在受精后6小时（hpf）准确识别并筛选出形态正常的胚胎。出现凝集、发育迟缓或结构异常迹象的胚胎会显著影响心血管测量结果的一致性和可解释性。早期剔除不可存活或畸形的胚胎，可为评估心脏发育和功能提供可靠的基线。在成像过程中正确摆放胚胎方向，确保胚胎呈侧位且心脏清晰可见，对于获得可重复且易于解读的结果同样至关重要。
该方案依赖于对心动周期进行高对比度、高帧率的成像，随后使用免费软件（如 Zembryo Analyzer16）进行基于图像的形态计量分析。尽管该平台能够对包括心室尺寸、收缩力指数、每搏输出量、射血分数和心输出量在内的功能参数进行稳健且非侵入性的定量分析，但其需要在舒张末期和收缩末期精确同步图像采集。常见问题的排查通常涉及调整照明、放大倍数或帧时间，以避免运动模糊或心脏时相的误判。可整合替代软件方案或自定义图像分析流程（例如 FIJI/ImageJ 宏或人工智能辅助追踪工具），以克服标准工具的局限性，尤其适用于高通量实验设置17,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由塞尔维亚共和国科学、技术发展与创新部资助，通过与贝尔格莱德大学医学院签订的机构资助协议，用于实施和资助2025年的研究活动。2025年机构资助的合同注册编号为451-03-137/2025-03/200110。我们恳请在所有由获批子项目产生的出版物致谢部分中包含此编号。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 膜过滤器 | Millipore | SLGP033RS | 0.22 µm 膜过滤器 |
| 1 N HCl 溶液 | Sigma-Aldrich | 320331 | 用于 pH 调节的盐酸溶液 |
| 1 N NaOH 溶液 | Sigma-Aldrich | 72068 | 用于 pH 调节的氢氧化钠溶液 |
| 成年斑马鱼（Danio rerio） | 本地繁殖设施 | N/A | 模式生物 |
| 带网隔的繁殖缸 | / | / | 用于产卵时成鱼的分离 |
| CaCl?·2H?O | Sigma-Aldrich | C5670 | 二水合氯化钙，试剂级 |
| 氯化镉 | Sigma-Aldrich | 202908 | 用于 3 mg/L 浓度暴露的有毒物质 |
| 商用斑马鱼饲料 | Mini Gran, Nutri Pet, Gornji Milanovac | / | 适合斑马鱼的高蛋白薄片或颗粒饲料 |
| 数码相机（显微镜用） | Hamamatsu Photonics | ORCA-Flash4.0 V3 | 用于 30 fps 视频录制的相机 |
| 加热金属块 | Eppendorf | 5382000010 | 温度可控的加热装置 |
| ImageJ 软件 | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | 开源图像处理软件 |
| 倒置光学显微镜 | Nikon | Ti2-E | 配备数码相机，具有 40× 和 100× 物镜的显微镜 |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | 氯化钾，试剂级 |
| 低熔点琼脂糖（1.2%） | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | 用于胚胎包埋 |
| 亚甲蓝（1%） | Sigma-Aldrich | M9140 | 添加至 E3 培养基中的抗真菌剂 |
| MgCl?·6H?O | Sigma-Aldrich | M9272 | 六水合氯化镁，试剂级 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | 氯化钠，试剂级 |
| 无菌培养皿（100 mm） | Corning | 430167 | 用于胚胎培养的塑料培养皿 |
| 无菌培养皿（35 mm） | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 玻璃底培养皿，用于胚胎封片 |
| 超纯去离子水 | Millipore | Milli-Q Reference | 用于溶液配制的水 |
| ZembryoAnalyzer 软件 | GitHub (Darko Puflovic) | https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser | 心脏功能分析软件 |
参考文献
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勘误
Formal Correction: Erratum: Functional Cardiac Imaging in Zebrafish Embryos Using Standard Microscopy and Video Analysis: Applications in Environmental and Biomedical Research
Posted by JoVE Editors on 2/09/2026. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/68941
