本方案描述了一种低成本的光学显微镜方法，用于评估斑马鱼胚胎的心脏形态和功能，可在无需先进成像系统的情况下，对发育性心脏毒性进行可重复的评价。
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摘要
摘要
斑马鱼（斑马鱼在心血管研究中被广泛用作脊椎动物模型，因其与人类具有较高的遗传相似性，且在早期发育阶段具有光学透明性，并易于进行 体内 成像。本文提供了一种标准化且易于实施的实验方案，用于在受精后96小时（hpf）利用明场光学显微镜评估斑马鱼胚胎的心脏形态与功能。该方法包括胚胎采集、形态学筛选、琼脂糖包埋固定、心脏搏动视频录制，以及基于图像的心脏参数分析，如心室尺寸、每搏输出量、心率、射血分数和心输出量。相关计算基于对心室几何形状的近似模型，并使用开源软件（如ImageJ、Zembryo Analyzer）完成。该方案利用广泛可及的设备实现心脏功能的定量评估，适用于资源有限的实验室及高通量筛选。在本研究中，通过在光学显微镜下记录96 hpf斑马鱼幼鱼的心脏搏动进行分析。关键心脏参数包括心室尺寸，用于计算每搏输出量；心率则通过每分钟搏动次数确定。由此进一步推导出射血分数和心输出量，以评估整体心脏功能。来自健康胚胎的代表性结果显示出一致的心室收缩及稳定的功能指标，而暴露于镉的胚胎则表现出心脏形态受损及显著升高的 心输出量。总体而言，该方法对于检测发育性心脏毒性具有重要意义，并为评估心脏功能提供了一种可重复、非侵入性的方法。 体内 在斑马鱼早期发育过程中。
引言
斑马鱼（Danio rerio）由于与人类具有高度保守的基因同源性、体外受精、胚胎光学透明以及快速发育等特性，已成为心血管研究中重要的脊椎动物模式生物1,2。这些特点，加之成本低廉和实验可扩展性强，使斑马鱼特别适用于早期心脏形态发生、先天性心脏缺陷以及发育性心脏毒性的研究3。斑马鱼在该领域的重要性还体现在调控心脏发育的基因和信号通路在脊椎动物物种间高度保守4。特别是，斑马鱼模型已为理解正常和病理条件下心脏形成、重塑及功能的遗传与生理基础做出了重要贡献5,6。
从结构上看，斑马鱼心脏由一个心房和一个心室组成，呈线性连接，缺乏哺乳动物四腔心所特有的分隔结构。尽管如此，斑马鱼心脏重现了人类心脏生理学的关键特征，包括存在心内膜和心肌层、心脏传导系统、节律性收缩活动，以及受神经激素因子的调控7,8。重要的是，斑马鱼心脏表现出关键的形态发生事件，包括心脏管向右弯曲以及随后心腔的扩张与界定，这些过程类似于人类胚胎发育中的心脏形成<....
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方案
所有涉及斑马鱼胚胎的操作均按照当地伦理委员会批准的机构动物护理和使用指南进行。斑马鱼的饲养和胚胎操作均符合欧盟关于用于科学目的动物保护的指令 2010/63/EU。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 斑马鱼的饲养与胚胎收集
- 在循环水族系统中饲养成年斑马鱼（Danio rerio），水温维持在 28 °C ± 1 °C，光照周期为 14 小时光照/10 小时黑暗。
- 每天喂食三次高蛋白商业薄片或颗粒饲料，确保饲料适合斑马鱼食用。
- 在傍晚时分，将成年斑马鱼转移至配备透明网格的繁殖缸中，使鱼体与缸底隔离。按雄鱼与雌鱼 2:3 的比例放入，并使用可拆卸隔板将雌雄鱼分隔过夜。
- 次日清晨，移除隔板并加入 50–100 mL 冷的养殖用水以诱导产卵。
- 受精完成后（30–60 分钟内），将成鱼从繁殖缸中移出，以防止其捕食胚胎。
- 使用塑料巴斯德移液管收集胚胎，并将其转移至盛有 E3 胚胎培养基的无菌培养皿中。
注：E3 胚胎培养基是一种缓冲盐溶液，其离子组成模拟斑马鱼细胞外液。配制方法为：将 580 mg NaCl、27 mg KCl、97 mg CaCl2·2H2O 和 163 mg MgCl2·6H2O 溶解....
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结果
本方案可对受精后96小时（hpf）斑马鱼心脏发育进行定量分析，包括心室大小、收缩力、每搏输出量和射血分数等结构与功能参数。
图2展示了斑马鱼心室在舒张末期（ED）和收缩末期（ES）的代表性明场图像，以及相应的条形图，显示平均心室面积（VA）和体积（VV）的测量结果（n = 30个胚胎）。心室呈椭球形，表现出节律性收缩，ED与ES之间存在明显的尺寸差异，可用于量化心脏功能。在ED时，平均VA和VV分别为0.017 mm² ± 0.002 mm²和0.0005 mm³ ± 0.0001 mm³。在ES时，VA和VV分别减少至0.012 mm² ± 0.002 mm²和0.0003 mm³，反映了在正常发育条件下有效的心室收缩。
图 3 展示了来自一组健康斑马鱼胚胎（n = 30）的代表性定量数据，重点关注心室输出的关键指标。平均每搏输出量（SV）为 0.213 nL ± 0.1 nL，心输出量（CO）达到 27........
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讨论
本方案中的一个重要步骤是在受精后6小时（hpf）准确识别并筛选出形态正常的胚胎。出现凝集、发育迟缓或结构异常迹象的胚胎会显著影响心血管测量结果的一致性和可解释性。早期剔除不可存活或畸形的胚胎，可为评估心脏发育和功能提供可靠的基线。在成像过程中正确摆放胚胎方向，确保胚胎呈侧位且心脏清晰可见，对于获得可重复且易于解读的结果同样至关重要。
该方案依赖于对心动周期进行高对比度、高帧率的成像，随后使用免费软件（如 Zembryo Analyzer16）进行基于图像的形态计量分析。尽管该平台能够对包括心室尺寸、收缩力指数、每搏输出量、射血分数和心输出量在内的功能参数进行稳健且非侵入性的定量分析，但其需要在舒张末期和收缩末期精确同步图像采集。常见问题的排查通常涉及调整照明、放大倍数或帧时间，以避免运动模糊或心脏时相的误判。可整合替代软件方案或自定义图像分析流程（例如 FIJI/ImageJ 宏或人工智能辅助追踪工具），以克服标准工具的局限性，尤其适用于高通量实验设置17,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由塞尔维亚共和国科学、技术发展与创新部资助，通过与贝尔格莱德大学医学院签订的机构资助协议，用于实施和资助2025年的研究活动。2025年机构资助的合同注册编号为451-03-137/2025-03/200110。我们恳请在所有由获批子项目产生的出版物致谢部分中包含此编号。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 膜过滤器 | Millipore | SLGP033RS | 0.22 µm 膜过滤器 |
| 1 N HCl 溶液 | Sigma-Aldrich | 320331 | 用于 pH 调节的盐酸溶液 |
| 1 N NaOH 溶液 | Sigma-Aldrich | 72068 | 用于 pH 调节的氢氧化钠溶液 |
| 成年斑马鱼（Danio rerio） | 本地繁殖设施 | N/A | 模式生物 |
| 带网隔的繁殖缸 | / | / | 用于产卵时成鱼的分离 |
| CaCl?·2H?O | Sigma-Aldrich | C5670 | 二水合氯化钙，试剂级 |
| 氯化镉 | Sigma-Aldrich | 202908 | 用于 3 mg/L 浓度暴露的有毒物质 |
| 商用斑马鱼饲料 | Mini Gran, Nutri Pet, Gornji Milanovac | / | 适合斑马鱼的高蛋白薄片或颗粒饲料 |
| 数码相机（显微镜用） | Hamamatsu Photonics | ORCA-Flash4.0 V3 | 用于 30 fps 视频录制的相机 |
| 加热金属块 | Eppendorf | 5382000010 | 温度可控的加热装置 |
| ImageJ 软件 | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | 开源图像处理软件 |
| 倒置光学显微镜 | Nikon | Ti2-E | 配备数码相机，具有 40× 和 100× 物镜的显微镜 |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | 氯化钾，试剂级 |
| 低熔点琼脂糖（1.2%） | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | 用于胚胎包埋 |
| 亚甲蓝（1%） | Sigma-Aldrich | M9140 | 添加至 E3 培养基中的抗真菌剂 |
| MgCl?·6H?O | Sigma-Aldrich | M9272 | 六水合氯化镁，试剂级 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | 氯化钠，试剂级 |
| 无菌培养皿（100 mm） | Corning | 430167 | 用于胚胎培养的塑料培养皿 |
| 无菌培养皿（35 mm） | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 玻璃底培养皿，用于胚胎封片 |
| 超纯去离子水 | Millipore | Milli-Q Reference | 用于溶液配制的水 |
| ZembryoAnalyzer 软件 | GitHub (Darko Puflovic) | https://github.com/darkopuflovic/ZembryoAnalyser | 心脏功能分析软件 |
参考文献
- Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat RevDrug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
- Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in ....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Functional Cardiac Imaging in Zebrafish Embryos Using Standard Microscopy and Video Analysis: Applications in Environmental and Biomedical Research
Posted by JoVE Editors on 2/09/2026. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/68941
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