体内 全细胞膜片钳记录斑马鱼幼鱼下丘脑肽能神经元

摘要

本文介绍了一种在完整幼年斑马鱼中利用全细胞膜片钳电生理技术进行下丘脑肽能神经元电活动体内记录的实验方案。

摘要

下丘脑是一个古老的脑区，调控着生理和行为的多个方面，包括睡眠与觉醒、食欲、能量稳态、焦虑、抑郁以及社会互动。下丘脑中特定的神经元群体通过释放神经递质和神经肽发挥其作用。via全细胞膜片钳记录是研究这些因子在突触传递和脑功能中作用的不可或缺的方法。然而，由于下丘脑神经元位于哺乳动物大脑深部，因此在完整哺乳动物中对其进行电生理记录具有挑战性。因此，我们对下丘脑神经元的内在特性和生理功能的理解仍然有限。幼年斑马鱼是一种研究下丘脑神经元的有用替代模型，因其具有透明且体积小但高度保守的脊椎动物脑。本文介绍了一种在完整幼年斑马鱼中进行in vivo全细胞膜片钳记录下丘脑神经元的实验方案。利用该技术，我们能够记录下丘脑中肽能神经元的活动，检测这些神经元对感觉刺激的反应，并探究其对下游神经元的影响。因此，该实验技术为在完整动物体内研究下丘脑神经肽能神经元的生理功能提供了一种有效的方法。

引言

斑马鱼（Danio rerio）作为一种常用的脊椎动物模型，被广泛应用于神经科学研究，并具有多种优势¹。其基因组成和脑部结构与哺乳动物高度保守，且具有丰富多样的行为表现，因此可用于研究睡眠、焦虑、抑郁及社会互动等行为背后的遗传和神经机制^2,3,4,5,6。斑马鱼体型小、饲养成本低，非常适合用于对治疗神经精神疾病相关的基因或药物进行高通量筛选^7,8。最后，斑马鱼幼体具有光学透明性，结合先进的光片显微镜技术以及多种可用的荧光报告系统，使其特别适用于在全脑范围内以单细胞分辨率监测神经元和星形胶质细胞的活动^9,10,11。

位于间脑腹侧深部的斑马鱼下丘脑在解剖结构和分子特征上与哺乳动物下丘脑保守相....

方案

所有实验均经上海大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）（动物实验方案编号 YS 2025-169）和加州理工学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）（动物实验方案编号 1836）批准。实验使用受精后 5 至 7 天的斑马鱼，喂食轮虫后用于实验。在此发育阶段，性别尚未决定。繁殖所用成年斑马鱼为 nacre [mitfa(w2/w2)] 背景²⁴。

1. 溶液与配方

1. 配制含有 5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂ 和 0.33 mM MgSO₄ 的 E3 培养基。用 NaOH 调节溶液至 pH 7.2。室温保存，1 个月内使用。
2. 配制细胞外液，含 134 mM NaCl、2.9 mM KCl、2.1 mM CaCl₂、1.2 mM MgCl₂、10 mM HEPES 和 10 mM 葡萄糖。细胞外液的渗透压约为 290 mOsmol L^-1。用 NaOH 调节溶液至 pH 7.8。4 °C 保存，1 个月内使用。
3. 配制细胞内液，含 100 mM K-葡萄糖酸盐、10 mM KCl、2 mM CaCl₂、2 mM Mg-ATP、0.3 mM Na-GFP、10 mM H....

结果

在本文中，我们介绍了一种改进的方法 体内 用于研究完整斑马鱼下丘脑神经元的全细胞膜片钳记录技术，特别关注食欲素（Hcrt）神经元。

如所示 图1，我们的方法能够在完整动物体内对深藏于脑部的这些神经元进行直接的电生理记录（图1A），克服了传统方法的局限性 体外 脑切片或解剖的脑组织标本。Hcrt神经元位于间脑腹侧深部，其轴突广泛投射至前脑、中脑和后脑图1B）。使用 体内 样本中，我们首先测量了Hcrt神经元的几项电生理参数（5个神经元，均值±标准误；静息膜电位：-53.26 ± 3.64 mV；膜电阻：2.67 ± 0.22 GΩ；动作电位基线频率：0.50 ± 0.17 Hz；动作电位峰值幅度：33.61 ± 8.49 mV；动作电位半宽：5.04 ± 0.84 ms）。随后，我们检测了Hcrt神经元对视觉和听觉刺激的反应。

讨论

本文所述方案可实现对幼年斑马鱼下丘脑中肽能神经元的膜片钳记录，该脑区是斑马鱼脑中最深且技术上最难触及的区域之一。由于该实验制备本身具有较高难度，成功的膜片钳记录需要对若干关键参数进行细致把控，包括移液管质量、进针技术、溶液纯度以及组织健康状态。这些因素共同决定了能否成功形成并维持稳定的吉欧封接记录。首先，清晰地观察到靶细胞和移液管尖端对于实现移液管与细胞接触以及形成吉欧封接至关重要。为此，必须通过调节聚光镜、孔径光阑和视场光阑，对显微镜的光路进行精细校准。

由于在本实验所用的斑马鱼标本中，解剖位置与下丘脑靶向神经元之间的距离较长，因此在移液管推进过程中施加适当的正压不仅能够清除液-气界面处的碎屑，还能在接触前清洁靶细胞表面。通过系统优化，确定了150–200 mBar为理想的压强范围，该范围可在有效清洁的同时避免靶向神经元发生位移。压强不足将无法防止移液管污染，而压强过高则可能导致细胞移位。在头段管路中集成了压力计，以实现对压力的实时监测。当下丘脑神经元的细胞膜与移液管尖端接触时，应释放正压，同时施加短暂的负压。负压可被施加 通过 通过口部精确控制压力强度，并在电.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
放大器	Axon	700B
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter	BF100-58-10
CCD相机	Dage-MTI	IR-1000
用于电生理记录的计算机	Dell	Precision 3660
Digidata	Axon	1440A
法拉第笼	定制
镊子	F.S.T.	Dumont #5
培养箱	Lonroy	GZP-150B
膜过滤器	Millipore Sigma	SLGV004SL
显微刀	F.S.T.	10318-14
物镜	Olympus	Mplan 5X/0.1; UMPlanFI/IR 60X/0.9w
蠕动泵	Longer	BT100-1L
移液器 holder	Narishige	H-7	用于解剖
拉制仪	Sutter Instrument	p-97
用于荧光筛选和解剖的体视显微镜	Olympus	SZX16
刺激器	A.M.P.I	Master8
三维微操纵器	Sutter Instrument	MPC-325
直立式红外微分干涉相差显微镜	Olympus	BX51WI
隔振台	TMC	61-541-06
视频监视器	SUNSPO	SP-717
水浴锅	Yiheng	HWS-12
X-Y 平移台	定制