体内 全细胞膜片钳记录斑马鱼幼鱼下丘脑肽能神经元

摘要

本文介绍了一种在完整幼年斑马鱼中利用全细胞膜片钳电生理技术进行下丘脑肽能神经元电活动体内记录的实验方案。

摘要

下丘脑是一个古老的脑区，调控着生理和行为的多个方面，包括睡眠与觉醒、食欲、能量稳态、焦虑、抑郁以及社会互动。下丘脑中特定的神经元群体通过释放神经递质和神经肽发挥其作用。via全细胞膜片钳记录是研究这些因子在突触传递和脑功能中作用的不可或缺的方法。然而，由于下丘脑神经元位于哺乳动物大脑深部，因此在完整哺乳动物中对其进行电生理记录具有挑战性。因此，我们对下丘脑神经元的内在特性和生理功能的理解仍然有限。幼年斑马鱼是一种研究下丘脑神经元的有用替代模型，因其具有透明且体积小但高度保守的脊椎动物脑。本文介绍了一种在完整幼年斑马鱼中进行in vivo全细胞膜片钳记录下丘脑神经元的实验方案。利用该技术，我们能够记录下丘脑中肽能神经元的活动，检测这些神经元对感觉刺激的反应，并探究其对下游神经元的影响。因此，该实验技术为在完整动物体内研究下丘脑神经肽能神经元的生理功能提供了一种有效的方法。

引言

斑马鱼（Danio rerio）作为一种常用的脊椎动物模型，被广泛应用于神经科学研究，并具有多种优势¹。其基因组成和脑部结构与哺乳动物高度保守，且具有丰富多样的行为表现，因此可用于研究睡眠、焦虑、抑郁及社会互动等行为背后的遗传和神经机制^2,3,4,5,6。斑马鱼体型小、饲养成本低，非常适合用于对治疗神经精神疾病相关的基因或药物进行高通量筛选^7,8。最后，斑马鱼幼体具有光学透明性，结合先进的光片显微镜技术以及多种可用的荧光报告系统，使其特别适用于在全脑范围内以单细胞分辨率监测神经元和星形胶质细胞的活动^9,10,11。

位于间脑腹侧深部的斑马鱼下丘脑在解剖结构和分子特征上与哺乳动物下丘脑保守相似，但体积小2至3个数量级，为研究下丘脑功能提供了一个更为简化的系统¹²下丘脑神经元通过与丘脑、脑干、垂体和端脑等多个脑区形成广泛的突触连接，调控生理稳态、神经内分泌信号传导及自主行为。^13,14这种行为和生理的调节在很大程度上依赖于神经肽，神经肽是一类通过与G蛋白偶联受体（GPCRs）结合而发挥作用的短链氨基酸¹⁵与突触处快速作用的氨基酸类神经递质释放不同，神经肽可能在更远的距离上扩散 通过 容积传递，并介导对突触传递和神经元兴奋性的缓慢调节作用¹⁶.

近年来，利用全脑钙成像、单细胞RNA测序、高通量行为分析以及神经环路图谱绘制等多种跨学科方法，斑马鱼研究揭示了下丘脑神经肽的多种功能^4,12,17,18。这些新兴技术极大地提升了我们大规模表征细胞多样性的能力，将分子机制与神经肽在神经环路水平的功能联系起来，并解析介导特定行为的神经环路^19,20。然而，这些方法在解析神经肽功能背后的快速生理动态过程和精确的突触机制方面仍存在局限性。

由 Neher 和 Sakmann 开发的膜片钳技术因其无与伦比的时间分辨率和生物物理精度，仍是研究神经元生理学的金标准，可直接测量膜电位波动、突触电流以及离子通道动力学^21,22。该技术在研究神经肽能细胞方面尤为宝贵，这类细胞具有特征性的簇状放电模式和神经调节作用，需通过直接的电生理测量才能充分理解其在行为和稳态中的作用^15,16,23。

本文建立了一种优化的实验方案，能够在克服下丘脑肽能神经元解剖位置较深所带来的技术挑战的前提下，实现对幼年斑马鱼下丘脑肽能神经元的稳定全细胞膜片钳记录。该方法可直接获取这些神经元的电活动信息，从而深入研究其对视觉和听觉刺激的响应（图1）。通过将膜片钳电生理技术与光遗传学相结合，我们能够精确表征下丘脑神经环路与下游神经元之间的功能连接性（图2 和 图3），进而促进对神经肽在生理稳态和行为调控中作用的研究。该方法填补了神经科学研究中的一项关键空白，实现了在生物物理、细胞和环路水平上对下丘脑神经元功能的同步机制性探索。

方案

所有实验均经上海大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）（动物实验方案编号 YS 2025-169）和加州理工学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）（动物实验方案编号 1836）批准。实验使用受精后 5 至 7 天的斑马鱼，喂食轮虫后用于实验。在此发育阶段，性别尚未决定。繁殖所用成年斑马鱼为 nacre [mitfa(w2/w2)] 背景²⁴。

1. 溶液与配方

1. 配制含有 5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂ 和 0.33 mM MgSO₄ 的 E3 培养基。用 NaOH 调节溶液至 pH 7.2。室温保存，1 个月内使用。
2. 配制细胞外液，含 134 mM NaCl、2.9 mM KCl、2.1 mM CaCl₂、1.2 mM MgCl₂、10 mM HEPES 和 10 mM 葡萄糖。细胞外液的渗透压约为 290 mOsmol L^-1。用 NaOH 调节溶液至 pH 7.8。4 °C 保存，1 个月内使用。
3. 配制细胞内液，含 100 mM K-葡萄糖酸盐、10 mM KCl、2 mM CaCl₂、2 mM Mg-ATP、0.3 mM Na-GFP、10 mM HEPES 和 10 mM EGTA。细胞内液的渗透压约为 280 mOsmol L^-1。用 KOH 调节溶液至 pH 7.4。将 100 µL 细胞内液分装至微量离心管中，-20 °C 保存，1 年内使用。
   注意：建议添加 Mg-ATP 和 Na-GTP 以获得长时间且稳定的记录。细胞内液需经 0.22 µm 滤膜过滤，以去除颗粒物和微生物污染物，防止影响封接形成或导致移液管堵塞。
4. α-银环蛇毒素：将 1 mg α-银环蛇毒素溶于 1 mL E3 培养基中，终浓度为 1 mg/mL。将溶液分装为每管 20 µL 至微量离心管中，-20 °C 保存，1 年内使用。
5. 低熔点琼脂糖：在玻璃瓶中将 0.75 g 琼脂糖溶于 50 mL E3 培养基中，终浓度为 1.5%。将混合物放入微波炉加热，直至琼脂糖完全融化，溶液呈透明均一状态。将融化的琼脂糖置于 42–45 °C 水浴中保温，1 个月内使用。

2. 斑马鱼的制备与解剖

1. 将携带目标转基因的单条雄性与雌性成年鱼放置在一起，例如 Tg(hcrt:RFP) 鱼²⁵在交配箱中将鱼配对，并用透明隔板隔开过夜。第二天早晨，移除隔板以允许鱼类交配。在当天下午早些时候收集箱底的受精胚胎，并将成鱼放回其原饲养箱中。
2. 将胚胎置于含有0.0005%亚甲蓝的E3培养基中，放入直径9 cm的培养皿内。将培养皿放入28.5 °C的培养箱中，保持14小时光照:10小时黑暗的光周期。每天更换E3培养基。
   注意：在受精后3天（dpf）之前，E3培养基中的亚甲蓝用于防止真菌生长，但在3 dpf时需替换为不含亚甲蓝的E3培养基，因为亚甲蓝可能在发育后期影响细胞代谢和线粒体功能。²⁶.
3. 在约3 dpf开始，使用落射荧光体视显微镜以最大放大倍数（约115倍）筛选幼鱼。将单条幼鱼置于大于其体形的水滴中，以便分选。对于3 dpf以上的幼鱼，使用含有0.01%三卡因的3 mL E3培养基进行麻醉，以抑制其自发运动活性。收集下丘脑区域呈现明亮荧光蛋白表达的幼鱼。
   注意：处理三卡因时需佩戴腈类手套、安全护目镜和实验服。多余的三卡因必须根据动物实验规程作为化学废弃物处理。
4. 筛选后立即用E3培养基洗去三卡因，并将这些幼鱼放回培养箱中。从受精后5天开始，直至实验当天，每天在培养皿中加入约5 mL含有轮虫的喂养液。每天更换E3培养液，并用轮虫喂养鱼类。
5. 在5-7 dpf时，收集外观健康且运动活跃的幼鱼。使用玻璃移液管将其转移至小型培养皿（直径3.5 cm）中。
6. 移除鱼周围的水，并在鱼体上加入 20 µL 的 1 mg/mL α-银环蛇毒素，作用约 30 秒。随后向培养皿中加入约 3 mL E3 培养基，洗去药物。
   注意：操作 α-bungarotoxin 时需佩戴腈类手套、安全护目镜和实验服。多余的 α-bungarotoxin 必须根据动物实验规程作为化学废弃物处理。
7. 用铝箔覆盖培养皿，使鱼处于黑暗环境中，逐渐使其麻痹。
   注意：α-银环蛇毒素是一种乙酰胆碱受体阻断剂，可特异性作用于神经肌肉接头，从而在不影响神经系统的情况下使鱼类麻痹。鱼类在麻痹后仍能感知环境刺激，脑功能保持正常。^9,27.
8. 约15分钟后在体视显微镜下检查麻痹情况，选择心跳正常且脑部与身体血液循环良好的麻痹鱼。
9. 将鱼转移至定制的记录室，该记录室为底部中央带有直径10 mm孔洞的35 mm培养皿，孔洞下方用胶固定一片20 mm × 20 mm的玻璃盖玻片以封住孔洞。吸除水后，加入约200 µL的1.5%低熔点琼脂糖。
10. 用镊子（Dumont #5）将鱼背侧朝上置于琼脂糖中。待琼脂糖完全凝固后，加入细胞外溶液至浸没琼脂糖。琼脂糖完全凝固需要5–10分钟。
11. 使用微型刀具切开并移除鱼头部上方的琼脂糖。然后，使用尖端开口约 1 µm 的玻璃微量移液管，在视顶盖与小脑之间的脑室上方皮肤处做一小切口，以便下一步将移液管插入脑内。
12. 使用断裂的玻璃移液管清除解剖孔周围的组织碎片或血凝块。

3 全细胞膜片钳记录

1. 在实验当天使用硼硅酸盐毛细管制备尖端开口约 1 µm、电阻约 20 MΩ 的记录微电极。将拉制好的微电极存放在容器中，并于同一天内使用，以防止污染。
2. 开启计算机、CCD 相机、显示器、放大器、数字化仪、显微操作器及相关软件。必须在打开软件之前先开启放大器和数字化仪。
3. 小心地将鱼转移至用于进行膜片钳实验的电生理装置上。
4. 使用蠕动泵以每分钟约 2 mL 的速度向鱼灌注含氧的细胞外液，以维持鱼的健康和细胞活性。
5. 使用 X-Y 平移台（定制）移动记录腔室，使鱼位于直立显微镜下 4 倍物镜视野中央。
6. 切换至 60 倍物镜，并移动平移台以观察目标下丘脑区域。使用 900 nm 红外光调节诺马尔斯基微分干涉差（DIC）成像，以获得最佳的细胞可视化效果。
7. 打开荧光激发光源（如汞灯），用于观察下丘脑中的荧光神经元。选择荧光明亮、细胞边界清晰的健康神经元，这通常表明细胞状态良好，有助于获得高质量的电生理记录。
8. 使用精细的微量加样吸头缓慢地用细胞内液反向填充记录微电极。
9. 将电极固定在放大器的前端，并拧紧旋钮以防止漏气。通过连接电极夹持器的管路向微电极内部施加轻微的正压（约 150–200 mBar），以防止气液界面处的污染物进入电极尖端。
10. 使用显微操作器以快速模式将微电极下放至浴液中，并在 4 倍物镜下将电极尖端定位在解剖孔上方。
11. 将显微操作器切换至慢速模式，并更换为 60 倍物镜。缓慢推进玻璃电极尖端穿过解剖孔，并沿两个视顶盖半球之间的脑室行进。
12. 将电极尖端垂直对准在 DIC 与荧光成像下可见的目标荧光细胞。当电极尖端接触细胞膜时，会形成微小的压痕。
    注：为观察下丘脑等深层组织，需结合偏振片和分析器滤光片精细调节 900 nm 红外 DIC 成像。
13. 当电极尖端接触细胞时迅速释放正压，使细胞与电极之间形成封接。同时，通过连接夹持器的管路施加短暂的负压via。
    注：软件上显示的电阻值应迅速上升至> 1 GΩ，表明已形成高阻封接。当成功记录荧光下丘脑细胞时，记录电极尖端内应可见荧光细胞膜。
14. 将细胞钳制在 -60 mV，等待 1–2 分钟，直至基线和通路电阻稳定。施加短暂的电脉冲或通过口吸施加轻柔的负压，以破裂电极尖端下方的细胞膜。
15. 在电生理软件设置中补偿容性电流和串联电阻。若记录过程中串联电阻大于 100 MΩ 且变化> 20%，则舍弃该数据。
16. 在电压模式下施加 1 秒、-10 mV 的电压脉冲，以监测实验前后细胞的固有膜电阻。若膜电阻或膜电位发生显著变化，则舍弃该细胞。
17. 首先在电压钳（VC）模式下进行记录，此时细胞被钳制在负电位。建立稳定记录后，可根据需要切换至电流钳（IC）模式。
    注：膜破裂后 gigaseal 可能短暂不稳定，因此在实验初期将细胞在 VC 模式下于 -60 mV 钳制数分钟，有助于改善细胞状态。
18. 实验结束后，使用 MATLAB 离线处理电生理数据并进行动作电位检测。
19. 实验完成后，使用 1.5% 次氯酸钠（NaClO）对幼鱼实施安乐死，并根据机构动物护理规程进行处理。

结果

在本文中，我们介绍了一种改进的方法 体内 用于研究完整斑马鱼下丘脑神经元的全细胞膜片钳记录技术，特别关注食欲素（Hcrt）神经元。

如所示 图1，我们的方法能够在完整动物体内对深藏于脑部的这些神经元进行直接的电生理记录（图1A），克服了传统方法的局限性 体外 脑切片或解剖的脑组织标本。Hcrt神经元位于间脑腹侧深部，其轴突广泛投射至前脑、中脑和后脑图1B）。使用 体内 样本中，我们首先测量了Hcrt神经元的几项电生理参数（5个神经元，均值±标准误；静息膜电位：-53.26 ± 3.64 mV；膜电阻：2.67 ± 0.22 GΩ；动作电位基线频率：0.50 ± 0.17 Hz；动作电位峰值幅度：33.61 ± 8.49 mV；动作电位半宽：5.04 ± 0.84 ms）。随后，我们检测了Hcrt神经元对视觉和听觉刺激的反应。

讨论

本文所述方案可实现对幼年斑马鱼下丘脑中肽能神经元的膜片钳记录，该脑区是斑马鱼脑中最深且技术上最难触及的区域之一。由于该实验制备本身具有较高难度，成功的膜片钳记录需要对若干关键参数进行细致把控，包括移液管质量、进针技术、溶液纯度以及组织健康状态。这些因素共同决定了能否成功形成并维持稳定的吉欧封接记录。首先，清晰地观察到靶细胞和移液管尖端对于实现移液管与细胞接触以及形成吉欧封接至关重要。为此，必须通过调节聚光镜、孔径光阑和视场光阑，对显微镜的光路进行精细校准。

由于在本实验所用的斑马鱼标本中，解剖位置与下丘脑靶向神经元之间的距离较长，因此在移液管推进过程中施加适当的正压不仅能够清除液-气界面处的碎屑，还能在接触前清洁靶细胞表面。通过系统优化，确定了150–200 mBar为理想的压强范围，该范围可在有效清洁的同时避免靶向神经元发生位移。压强不足将无法防止移液管污染，而压强过高则可能导致细胞移位。在头段管路中集成了压力计，以实现对压力的实时监测。当下丘脑神经元的细胞膜与移液管尖端接触时，应释放正压，同时施加短暂的负压。负压可被施加 通过 通过口部精确控制压力强度，并在电...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
放大器	Axon	700B
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter	BF100-58-10
CCD相机	Dage-MTI	IR-1000
用于电生理记录的计算机	Dell	Precision 3660
Digidata	Axon	1440A
法拉第笼	定制
镊子	F.S.T.	Dumont #5
培养箱	Lonroy	GZP-150B
膜过滤器	Millipore Sigma	SLGV004SL
显微刀	F.S.T.	10318-14
物镜	Olympus	Mplan 5X/0.1; UMPlanFI/IR 60X/0.9w
蠕动泵	Longer	BT100-1L
移液器 holder	Narishige	H-7	用于解剖
拉制仪	Sutter Instrument	p-97
用于荧光筛选和解剖的体视显微镜	Olympus	SZX16
刺激器	A.M.P.I	Master8
三维微操纵器	Sutter Instrument	MPC-325
直立式红外微分干涉相差显微镜	Olympus	BX51WI
隔振台	TMC	61-541-06
视频监视器	SUNSPO	SP-717
水浴锅	Yiheng	HWS-12
X-Y 平移台	定制