利用天然海水接种物和闭环呼吸计进行材料的好氧生物降解测试

摘要

本方案描述了在有氧条件下，利用天然海水接种物和自动化封闭回路呼吸测量系统，对潜在可生物降解材料（包括合成材料和天然材料）进行测试的标准操作程序。

摘要

正确评估可生物降解材料依赖于标准测试方法的广泛采用。尽管已有此类方法，但由于成本高昂以及新建实验室所需启动时间较长，测试能力仍然受限。本改良筛选方案基于美国材料与试验协会（ASTM International）标准方法 D6691-24a《通过确定的微生物群落或天然海水接种物测定塑料材料在海洋环境中需氧生物降解的标准试验方法》，用于评估材料在海洋环境中的生物降解情况，并通过与阳性对照和阴性对照的结果进行比较，采用添加了铵盐和磷酸盐的天然海水接种物，以防止营养限制。材料被暴露于这种营养富集的海水中，并在 30 °C 下培养。使用 Micro-Oxymax 呼吸仪随时间测量生物气体（二氧化碳，CO₂）的生成量。通过计算材料来源的碳转化为生物气态碳的比例，确定矿化程度（即生物降解程度）。以实测或理论碳含量的分数形式表示的 CO₂ 生成百分比，作为时间的函数进行报告。该封闭式呼吸测定系统可容纳多种反应容器，每种材料设三个平行样，同时包括阴性对照（仅含海水接种物）和阳性对照（薄层色谱级纤维素）。该方法对于评估材料在海洋环境中的降解性能具有重要意义，并有助于应对全球性污染防控问题。

引言

塑料废物对海洋生态系统和人类健康构成威胁¹。人们对塑料污染以及海洋中各类材料形成的海洋垃圾日益关注，凸显出对可持续解决方案的需求，例如改进废弃物的终端管理，以及开发可在海洋环境中快速生物降解的可生物降解材料。与传统的合成塑料不同，后者可在环境中存留数十年至数百年，并产生在食物网中累积的微塑料^2,3,4，而可生物降解材料作为含碳有机成分，可能被微生物代谢为CO₂和甲烷（CH₄），或同化为微生物生物量⁵。因此，理解材料在海水中的生物降解过程，对于量化和减轻海洋垃圾的环境影响至关重要。

海洋环境中生物降解过程受时空变量相互作用的调控，包括光照和营养物质的可利用性、压力、温度、微生物物种组成以及聚合物的理化性质与结构，这些因素共同决定了降解的速率、程度和机制⁶这些变量为模拟海洋环境的实验室生物降解研究带来了重大挑战。本标准操作程序（SOP）采用天然海水作为接种物，以捕获 原位 存在的微生物群落，并记录相关变量，包括海水中溶解性营养盐、颗粒态碳和氮、叶绿素、盐度、pH 和温度。这种受控的基于实验室的....

方案

1. 海水的采集与表征

1. 选择一个未受废水、化学品、油膜或强烈淡水影响的海水采集点。
2. 在采样点记录水源信息（位置、经纬度、采样深度、总水深和温度）、样品采集日期以及观察到的水体状况。
3. 从多个深度、不同地点及多次采样活动中收集并混合海水样品，以促进形成多样化的微生物群落组成。
4. 使用大型Niskin采水器，在20 L经酸洗处理的塑料桶中采集10 L至20 L海水，并运回实验室。
5. 从塑料桶中取出1 L未经过滤的海水子样品，转移至一个经酸洗处理的1 L棕色高密度聚乙烯（HDPE）瓶中，用于实验室测定颗粒态碳和氮，以评估初始海水条件。从该1 L样品中，使用0.2 µm低氮醋酸纤维素滤膜过滤，并收集60 mL滤后子样品至经酸洗处理的聚乙烯瓶中，用于分析溶解性无机氮和有机氮（N）以及磷（P）组分。
6. 用项目名称、样品编号和日期标记子样品。采用靛酚法（4500-NH3）^13,14测定NH₄⁺浓度，采用单溶液法（4500-P E）^13,15测定PO₄^3-浓度。采用元素分析法

结果

展示了海洋生物降解测试的结果。通过测量转化为二氧化碳的碳的比例，评估每个样品的生物降解情况。累积生物降解、降解速率和降解百分比曲线通常表现出一个滞后期，随后是增长期，最终达到平稳期。这些阶段的时间和程度取决于样品材料、实验条件以及海水接种物的组成。

全年从温带海湾采集的海水在水质组分上表现出变异性。例如，微生物群落的多样性和丰度在日际到季节尺度上均存在变化^19,20。此外，海水中接种物所含的活性有机碳可能引起重复样本间二氧化碳生成的异质性。有机碳，尤其是缓慢降解的颗粒态有机碳，可能影响微生物群落对碳的可利用性²¹。尽管这种异质性可能不会影响生物降解的程度，但它可能增加重复样本之间的变异，从而降低结果的稳健性。

表1 和 图2 展示了生物降解测试中的典型阳性结果。

讨论

阳性对照的表现决定测试的有效性。基于其理论最大产气量，易在海洋环境中生物降解的阳性对照底物（如分析级纤维素、牛皮纸等）的生物降解率必须达到至少70%。该标准用于验证孵育期间天然海水中的环境条件适宜且微生物活性充足。若未达到此阈值，则表明可能存在平行样本制备、海水接种物处理（即微生物群落失活）或呼吸测量系统功能方面的问题，需判定该测试无效。

为尽量减少重复制备过程中可能产生的变异，所有样品材料应保持相同的物理形态，且平均粒径应小于0.25 mm。物理形态的差异会导致可用于微生物降解的表面积不同，从而影响矿化程度和速率。若采用低温研磨处理样品，应使用筛分装置或粒径分析仪验证其粒径分布的一致性。当物理性质相似的材料采用标准化研磨方案（例如，固定研磨次数和频率）处理时，通常可获得一致的粒径。强烈建议不同材料之间保持粒径的一致性，以确保不同处理组和测试之间的可比性。

实验误差的一个常见来源是加入样品反应容器中的聚合物质量不准确或不一致。为减少误差，所有样品材料应在同一天由同一名技术人员使用经过适当校准的分析天平进行称量。为确保样品材料完.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 µm，47 mm 醋酸纤维素滤膜	Geotech Geofilter	83100056	过滤海水
100 mL 容量吸管	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2U	A 级；经酸浸处理并用去离子水冲洗
100–600 mL 玻璃烧杯	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	50-194-5690	A 级；经酸浸处理并用去离子水冲洗
20 mm 研磨球	Retsch	53680062	不锈钢材质。与研磨罐配合用于聚合物的低温研磨
50 mL 研磨罐	Retsch	14620216	不锈钢材质。与 Mixer Mill 400 及 20 mm 研磨球配合用于聚合物的低温研磨
75 mL 容量吸管	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-650-2T	A 级；经酸浸处理并用去离子水冲洗
空气泵与鼓泡系统	Tetra	77846	在预培养平衡期间对海水进行曝气
铝箔	Fisherbrand	01-213-100	用于高压灭菌和清洁储存的覆盖物
氯化铵（NH4Cl）	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A661-500	海水营养加标物
分析天平	Mettler	AT201	用于称量实验组和对照组底物
高压灭菌器	Tuttnauer	MFI-TTN-3870EA	用于灭菌容器及盖组件
Base Micro-Oxymax 120VAC 单通道系统	Columbus Instruments	0135-8000	用于存放阳性对照和聚合物
校准气体	Airgas	X03NI92P3000001	一级标准气体混合物；含 2.7% 二氧化碳、4.5% 甲烷，余量为氮气
计算机显示器	Dell	210-BMKK	Dell Pro 24 Plus USB-C 集线器显示器。与计算机配合运行 Micro-Oxymax 软件
低温手套	Thermo Fisher Scientific, Tempshield, Cryo Gloves	11-394-306	用于操作液氮
指针式温度计	Thermo Fisher Scientific, H-B Instrument Durac	13-201-433	用于校准采集海水时的水温
一次性移液管	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	13-711-7M	冲洗容器内壁以释放附着物质
ENC52 温度与光照控制箱	Columbus Instruments	4740-4054	维持恒定的温度和光照条件
烧瓶夹	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	S07387	用于在液氮中操作研磨罐
250 mL 锥形瓶	DWK Life Sciences	14395-250	样品反应容器
带插口式盖的玻璃小瓶	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	03-339-26D	样品储存
H22PX 手持式测深仪	West Marine, Norcross Marine	6849368	测定海水采集点的水深
手持式 GPS 73	Garmin	10-01504-00	用于确定海水采集点的位置
高密度聚乙烯（HDPE）盆	Thermo Scientific, Nalgene	13-359-26	用于在 10% HCl 溶液中对玻璃器皿进行酸浸处理
盐酸（酸性水溶液）	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	A144-212	经认证的 ACS Plus 级，浓度为 36.5% 至 38.0%。用于 CO2 传感器校准及玻璃器皿的酸浸处理
层流罩	Air Science	FLOW-48-A	在样品制备过程中最大限度减少空气中的污染物
大容量 Niskin 采水器；Beta Plus 瓶体（仅 8.2 L 水平式，PVC）	Science First	3-1980-H65	用于从码头或船上采集海水
液氮盆	Thermo Fisher Scientific, Bel Art Magic Touch 2	11-999-063	用于盛装液氮
10 L 液氮转移容器	Thermo Scientific	TY509X2	用于储存和分配液氮，以进行低温研磨
工业级液氮，22 PSI	Airgas	NI 180LT22	用于使聚合物变脆并进行研磨
机械筛分振荡器	Humbolt, Grainger	5DPL6	用于粒径分布的筛分分析
Micro-Oxymax	Columbus Instrumentts	7395-113-D64	硅胶密封 O 型圈，金属接口带 3 个接头，以及 GL45 螺口盖
Micro-Oxymax 10 通道扩展接口	Columbus Instruments	0135-8101	呼吸测定系统组件
Micro-Oxymax 呼吸测定仪（3% CO2 传感器）	Columbus Instruments	0135-8403	非色散红外检测
Mixer Mill 400	Retsch	207450001	Mixer Mill 400。用于聚合物的低温研磨
电动移液控制器	Eppendorf	4430000018	将海水转移至样品反应容器
窄口琥珀色高密度聚乙烯（HDPE）实验室级瓶，1 L	Thermo Scientific, Nalgene	02-923-5	用于采集离散的全水海水样品
20 微米尼龙筛网	ELKO Filtering Co.	41718	用于筛除原始海水中较大的异质颗粒
开放式轨道摇床	Thermo Fisher Scientific	SK4000	在孵育期间维持反应容器的轨道运动
OptiPlex 5090 小型台式计算机	Dell	C0SL03	台式计算机，用于运行 Micro-Oxymax 软件
pH/电导率仪	Mettler Toledo, SevenExcellence S470-Basic	30046252	台式 pH/电导率仪，用于测量海水接种物的初始和最终值
60 mL 聚乙烯瓶	Qorpak	PLC-03564	用于采集离散的过滤海水样品
磷酸二氢钾（KH2(PO4)）	Thermo Fisher Scientific, Fisher BioReagents	BP362-500	海水营养加标物
精密天平	Sartorius	Practum2102-1S	用于称量容器的皮重和总重
20 L 圆形大瓶	Thermo Fisher Scientific	02961A	经酸浸处理，用于储存海水
护目镜	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	19-181-513
药勺	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand, Scoopula	01-257-567	不锈钢实验室药勺
筛网	Advantech, Grainger	40PR18-40PR55	不锈钢筛网。筛网的数量和规格取决于待测材料。
Sigmacell 纤维素，101 型	Sigma-Aldrich	435236-250G	粉末状，阳性对照底物
碳酸氢钠	Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical	S233-500	用于 CO2 传感器校准
无水亚硫酸钠，98%	Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific Chemicals	AAA1793336	用于 CO2 传感器校准
温度计/热敏电阻探头	Fisherbrand	15-079-700	验证培养箱温度
可追溯精密指针式气压计	Fisherbrand	14-648-51	记录实验开始时的大气压力
Victor 中型氢气、甲烷双级减压阀，CGA-350	AirGas	VIC0781-3559	校准气体减压阀
2 L 容量瓶	Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand	FB4002000	A 级；经酸浸处理并用去离子水冲洗。用于配制营养加标海水。
称量盘	Thermo Fisher Scientific	02-202-101	聚乙烯材质