本方案描述了一种 体外 用于建模的系统 从头合成 使用BAC16衍生的病毒颗粒对卡波西肉瘤相关疱疹病毒进行裂解性感染。该方法可用于研究病毒早期复制与扩散过程。通过基于GFP的感染单位测定法及对衣壳化病毒基因组进行实时PCR，定量检测感染性病毒的产生。
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摘要
摘要
卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）是一种与多种人类恶性肿瘤相关的γ疱疹病毒，在初次感染期间可发生裂解复制，这一过程有助于病毒扩散、免疫逃逸及疾病发生。然而，目前缺乏高效的 体外 系统用于 从头合成 裂解性感染对早期感染事件的研究具有局限性。本文介绍了一种可操作的实验方案，采用人结直肠癌HCT 116细胞作为靶细胞，以来源于KSHV细菌人工染色体16（BAC16）重激活的iSLK生产细胞所释放的游离病毒颗粒进行感染。该模型可重现原发性感染的关键步骤，包括病毒进入、基因组递送、裂解期基因表达以及子代病毒的产生。感染过程可实现同步化 通过 离心接种并进行时间进程监测。病毒产量通过双读数系统进行定量，该系统包括基于绿色荧光蛋白（GFP）的感染单位（IU）检测和对衣壳化病毒DNA的qPCR分析。这些方法可实现对病毒复制动力学的详细分析。尽管本方案目前侧重于晚期感染事件的检测，但通过调整取样时间点，该系统亦可适用于感染早期阶段的研究。该平台具有可重复性和可扩展性，适用于高效病毒生产研究。 从头合成 感染，该系统填补了KSHV研究中的方法学空白，并支持对疱疹病毒与宿主相互作用机制及抗病毒策略的深入研究。
引言
卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）是一种与卡波西肉瘤（KS）、原发性渗出性淋巴瘤（PEL）、多中心型 Castleman 病（MCD）以及 KSHV 炎症性细胞因子综合征在病因学上相关的人类 γ-疱疹病毒1,2。与其他所有疱疹病毒一样，KSHV 在宿主体内建立终身持续性感染，并在潜伏期和裂解期之间交替转换。尽管大多数感染细胞以潜伏状态为主，但部分细胞可在初次（从头）感染期间或从潜伏状态再激活时进入裂解周期3。裂解性复制涉及病毒基因表达的有序级联反应，最终实现基因组复制、病毒颗粒组装及子代病毒释放。该过程对病毒的传播和疾病进展至关重要4,5。早期关于 KSHV 裂解性复制的研究通常依赖于在异源系统中异位表达单个病毒基因。尽管这些研究提供了重要信息，但无法完全反映真实感染过程中存在的协调性基因调控及病毒-宿主相互作用。BAC-16 的开发——一种携带全长 KSHV 基因组的重组细菌人工染色体（BAC）——使得能够产生可进行遗传操作且仍具备复制能力和感染性病毒颗粒生成能力的病毒6。该系统有助于在完整基因组背景下对病毒基因进行靶向诱变和功能分析。目前，利用携带 BAC-16 或 KSHV 的潜伏感染 iSLK 或 BCBL-1 细胞建立的再激活模型已成为研究 KSHV 裂解性复制的标准方法。这些系统可通过多西环素（Dox）和丁酸钠等诱导剂实现裂解周期的同步化诱导7,8。然而，由于再激活模型绕过了感染早期步骤——包括病毒进入、细胞内运输以及潜伏与裂解复制之间的初始决策——因此无法完全重现初次感染的动态过程。
从头合成 感染模型为弥补这些不足提供了补充性研究框架。多种原代细胞模型，如人血管内皮细胞和牙龈上皮细胞，已被证实可在卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染后支持其裂解性复制 从头合成 感染3,9,10,11然而，由于其寿命有限、成本较高且难以进行遗传操作，这些因素限制了它们在机制研究中的可重复性和可扩展性。在本方案中，我们描述了一种易于操作且可扩展的KSHV模型 从头合成 使用HCT 116人结肠直肠癌细胞系进行裂解性感染。尽管HCT 116并非KSHV的天然靶细胞，但其对感染表现出高度易感性，可提供一个稳定且经济高效的平台，适用于机制研究及高通量应用。鉴于KSHV在培养中形成噬斑的能力有限，我们采用携带GFP报告基因的BAC16系统来产生游离病毒用于感染。该方法可实现对感染细胞的直接观察，并可用于感染性滴度的定量分析 通过 基于GFP的感染单位（IU）检测12为了补充这一点，通过DNase处理后采用定量实时PCR（qPCR）检测病毒颗粒相关DNA，从而灵敏地检测衣壳化病毒基因组。结合使用这些检测方法，可实现对初次感染期间裂解性复制动态进行时间分辨的定量分析。
该方案为卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的建模提供了一个可靠且灵活的平台 从头合成 裂解性感染 体外，有助于解析病毒生命周期早期事件，实现基因功能和抗病毒活性的评估。
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方案
KSHV 被归类为生物安全二级（BSL-2）人类病原体。所有涉及感染性材料的操作均须在经认证的 BSL-2 生物安全柜中进行。每次操作前后，均须使用 70% 乙醇对工作台面进行去污处理。所有废弃物的处置须符合机构生物安全规定及世界卫生组织 BSL-2 指南。完整工作流程的示意图见图 1。该流程包括从被激活的 iSLK 细胞中产生无细胞的 BAC16 来源 KSHV、HCT 116 细胞的从头感染、通过感染单位（IU）测定法对病毒滴度进行定量，以及对病毒颗粒相关病毒 DNA 进行 qPCR 分析。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 细胞游离型BAC16来源的KSHV的制备
- 将携带野生型（WT）KSHV BAC16的Dox诱导型iSLK细胞（iSLK-BAC16）接种至五块T75培养瓶中，接种密度约为80%融合度。在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。
- 通过向每瓶中加入1 µg/mL Dox和1 mM丁酸钠诱导裂解期再激活。继续孵育72–96小时。
- 每日使用相差显微镜观察细胞状态。当>90%的细胞出现变圆、从培养瓶表面脱落和/或可见裂解现象（即细胞病变效应，CPE），表明已发生强烈的裂解反应，此时收集上清液。收集完上清液后，使用10%次氯酸钠溶液对诱导裂解的iSLK-BAC16细胞进行去污染处理并丢弃。
- 将收集的上清液在4 °C条件下以1,500 × g离心10分钟，以去除细胞碎片。将澄清后的上清液通过0.45 µm聚醚砜（PES）膜滤器过滤，注意不要扰动沉淀。
- 将过滤后的上清液转移至超速离心管中。使用SW28转子，在4 °C条件下以25,000 × g离心3小时，沉淀病毒颗粒。
- 小心将上清液弃入10%次氯酸钠溶液中。将病毒沉淀物重悬于1 mL无血清的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中。
- 将重悬的病毒液分装至无菌螺口1.5 mL微量离心管中。保存于-80 °C直至使用。利用SLK细胞中的基于GFP的感染单位（IU）检测法测定病毒储备液的感染滴度（见步骤3）。
2. 从头合成 HCT116细胞感染
注意：在 HCT116 细胞中，较高的感染复数（MOI）对于de novo KSHV 感染后有效启动裂解性复制至关重要。该条件可在无需外源性刺激的情况下实现强烈的病毒基因表达和有效的病毒复制。关于 MOI 对病毒粒子产生的依赖性影响的代表性结果见补充图 1A。
- 接种 1 × 105 HCT116 细胞接种于 12 孔组织培养板的每孔中。在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育 24 小时。 2 培养箱
- 将浓缩的病毒原液用预热的无血清DMEM稀释至终体积250 µL，使感染复数（MOI）达到10。
- 吸弃每孔中的培养基，直接向细胞中加入 250 µL 稀释后的病毒液。
- 将培养板在1,500 x g 在30 °C下离心接种1小时以同步感染（spinoculation）。立即将培养板转移至37 °C培养箱，继续孵育额外1小时。
- 吸弃接种液，用预热的PBS洗涤细胞三次，以去除残留病毒。每孔加入1 mL完全DMEM培养基。
- 在感染后36小时、60小时和96小时，通过荧光显微镜监测感染细胞中的GFP表达。在每个时间点，从每个孔中收集1 mL培养上清液。
注意：收集上清液后，KSHV 感染的 HCT116 细胞可 可根据实验目的保留用于后续应用，如RNA提取、蛋白质分析、免疫荧光或流式细胞术。 - 将收集的上清液在1,500 x g 4 °C下离心10分钟以去除细胞碎片。将澄清的上清液转移至新的离心管中。在液氮中速冻后于-80 °C保存，用于后续分析。
3. 感染单位检测（IU 检测）
注意：SLK 细胞允许 KSHV 入侵并支持早期裂解期基因表达。该检测通过检测感染后 SLK 细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达，对连续稀释的含病毒上清液中的感染性单位进行定量。
- 在感染前24小时，将每孔1×104个SLK细胞接种于96孔板中。确保细胞分布均匀，并在感染当天达到约60%-70%融合度。
- 标记九个1.5 mL微量离心管用于连续两倍稀释：第1管（未稀释，1:1）、第2管（1:2）、第3管（1:4）、第4管（1:8）、第5管（1:16）、第6管（1:32）、第7管（1:64）、第8管（1:128）和第9管（1:256）。
- 向第1管中加入200 µL病毒上清液。向第2至第9管中各加入100 µL预热的无血清DMEM。开始梯度稀释时，从第1管转移100 µL至第2管，并通过反复吹打充分混匀；然后从第2管转移100 µL至第3管，依此类推至第9管，每步均需充分混匀。
注意：每管最终体积应为100 µL。所有稀释操作均需设三个重复。 - 吸除SLK细胞的培养基。向指定孔中加入100 µL各病毒稀释液。共使用27个孔（每个稀释度3个孔，从1:1至1:256）。
- 将96孔板在30 °C条件下以1,500 × g离心1小时，以促进病毒吸附。随后将板转移至37 °C CO2培养箱中继续孵育1小时。
- 移除接种液，并轻轻向每孔加入100 µL完全DMEM。在37 °C下继续孵育24小时。
- 收集细胞，并通过流式细胞术分析GFP表达情况。记录每孔中GFP阳性细胞的数量。
- 使用以下公式13计算每毫升感染单位数（IU/mL）：
IU/mL = [（每孔GFP阳性细胞数）/ 接种体积（mL）] × 稀释倍数。根据可检测到GFP阳性细胞的最后一个稀释度确定最终病毒滴度。
4. 通过qPCR定量分析衣壳内病毒基因组
- 向400 µL澄清上清液中加入DNase I，使其终浓度为100 U/mL（上清液的澄清和去杂质步骤见步骤1）。在37 °C孵育15分钟，以消化未被包裹的病毒和细胞DNA。DNase处理特异性和有效性的代表性结果见补充图1B。
- 加入EDTA至终浓度50 mM，以终止DNase反应。在75 °C孵育15分钟，使DNase I失活。
- 根据试剂盒生产商的说明书，使用DNA Mini Kit从经DNase处理的上清液中提取病毒DNA。
- 用30 µL洗脱缓冲液洗脱病毒DNA。每次qPCR反应使用5 µL洗脱的DNA。
- 使用以下引物扩增KSHV开放阅读框73（ORF 73）：正向引物：5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'；反向引物：5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3'。
- 使用SYBR Green Master SuperMix制备qPCR反应，每个样本设三个重复。循环条件设置如下：初始变性：95 °C 3分钟；扩增：40个循环，95 °C 10秒，52 °C 30秒，72 °C 30秒；熔解曲线分析：标准升温程序以检测扩增子特异性。
- 使用来源于BAC-16的病毒DNA进行10倍系列稀释（每反应109至101拷贝）生成标准曲线。将Ct值对输入拷贝数的log10 作图，以评估检测的线性关系。代表性标准曲线见补充图1C。
- 通过将样品Ct值与标准曲线比较，确定病毒基因组拷贝数。结果归一化后以每毫升上清液中的病毒DNA拷贝数表示。
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结果
为了定量感染性病毒的滴度，将iSLK-BAC16细胞在裂解性再激活72小时后收集的上清液进行两倍系列稀释，并用于感染SLK细胞。各稀释度下GFP阳性SLK细胞的数量如图2A所示，相应的每毫升感染单位（IU）经计算后展示于图2B。为评估从头裂解复制的效率，使用iSLK-BAC16来源的病毒颗粒以MOI为10感染HCT 116细胞（图2C）。在感染后36、60和96小时收集上清液，并接种至SLK细胞以评估感染性病毒的产生。GFP荧光成像（图2D）和流式细胞术分析（图2E）显示感染性呈时间依赖性增加，在60小时达到峰值（74.4%的GFP阳性SLK细胞），至96小时略有下降。同时，对经DNase处理的上清液进行qPCR分析（...
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讨论
建模 从头合成 KSHV的裂解性感染长期以来受到该病毒在大多数许可性细胞类型中强烈倾向于建立潜伏感染的限制。尽管已有研究表明某些原代细胞（如内皮细胞和口腔上皮细胞）可在感染后支持裂解性复制 从头合成 感染9,10，其有限的寿命、高昂的成本以及培养维持的技术难度降低了实验的可重复性和可扩展性。近期研究进一步表明，原代KSHV感染的结果在很大程度上依赖于细胞和环境背景。例如，缺氧促进裂解性感染 通过 内皮细胞中HIF-1α的累积，以及上皮细胞转录因子（如FOXQ1）的表达可触发口腔上皮细胞中裂解性基因的表达10,15尽管这些发现强调了细胞环境和外界信号在调控感染命运中的重要性，但它们通常依赖于外源性刺激或基因重编程，这可能会干扰对自发性裂解复制过程中内在病毒-宿主相互作用及激活的信号通路的机制研究。为克服这些局限性，我们提出了一种可行且可重复的系统
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢克利夫兰诊所的 Jae U. Jung 博士分享用于产生重组 KSHV 的 iSLK-BAC16 细胞系。图形设计使用 BioRender.com 完成，作者拥有该平台的使用许可。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R21 DE028256、R01 CA140964 和 R01 CA262631（项目负责人：C. Liang），以及 Wistar 科学加速器博士后奖（授予 Q. Zhu）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 µm 聚醚砜（PES）滤膜 | VWR | 76479-020 | |
| Biorender | Biorender | 不适用 | 图表设计使用 BioRender.com 制作，作者已获得该平台的使用许可 |
| CFX Opus 96 实时荧光定量 PCR 系统 | Bio-Rad | 184-5072 | |
| 完全 DMEM 培养基 | 在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM；Sigma-Aldrich）中添加 10%（v/v）胎牛血清（FBS；Gibco）、2 mM L-谷氨酰胺（Gibco）和 100 U/ml 青霉素-链霉素（Pen-Strep；GenClone）配制而成。 | ||
| DNase I | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | M0303S | |
| 多西环素（doxycycline） | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| LSR II 18 流式细胞仪 | BD Bioscience | 不适用 | |
| PerfeCTa SYBR Green Master SuperMix | Quantabio | 95054-02K | |
| QIAamp DNA Mini 试剂盒 | Qiagen | 56304 | |
| 丁酸钠（NaB） | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
参考文献
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