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使用激光散斑对比成像评估大鼠足掌皮肤的阻塞后反应性充血

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DOI：

10.3791/68986

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2025年10月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1V.A. Negovsky Research Institute of General Reanimatology, Federal Research and Clinical Center of Intensive Care Medicine and Rehabilitology, 2Research and Development Center of Biomedical Photonics, Orel State University, 3College of Engineering and Physical Sciences, Aston University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种利用激光散斑对比成像和有创血压测量技术，在麻醉大鼠皮肤中评估闭塞性反应性充血参数的方法。

摘要

激光散斑对比成像（LSCI）是一种现代的、非侵入性技术，用于评估人类和实验动物的微血管灌注。将LSCI与有创血压（BP）测量及血管阻断试验相结合，可用于研究阻断后反应性充血（PORH），从而评估微血管血流储备和血管反应性。本文展示了在全身麻醉大鼠的后肢足垫上应用LSCI记录和可视化PORH的技术。使用一种特殊的气动袖带，在胫骨水平充气以造成暂时性（180秒）血管阻断。对随后发生的PORH（峰值充血及动力学指标）进行评估，可为所研究的病理过程（如循环性休克、心力衰竭、高血压等）的机制和严重程度提供额外信息，或发现新药在静息灌注评估中不明显的血管效应。有创血压监测可计算皮肤血管导纳，并考虑全身血流动力学的变化，这在危重症实验模型中尤为重要。本文还将演示该方法在出血性休克大鼠模型中识别微血管功能障碍的应用。

引言

微血管功能障碍参与多种心血管、内分泌及其他疾病的发病过程，影响组织灌注和氧合，并破坏全身血流动力学的血管运动调节机制（例如在高血压中）1。在创伤、脓毒症及各种类型休克（如失血性、脓毒性、心源性等）所致的危重症患者中，微循环障碍在器官功能障碍的病理生理机制中也具有重要意义2。

目前，多种基于激光的方法已用于临床和临床前研究，以无创评估组织灌注和微血管功能：激光多普勒血流仪（LDF）、激光多普勒成像（LDI/LDPI）以及激光散斑对比成像（LSCI）。其中，LSCI 在临床无创评估皮肤灌注方面最具前景。与 LDF 和 LDI/LDPI 相比，该方法具有明显优势，因其操作简便，并能以高空间和时间分辨率对整个检测区域进行可视化3。LSCI 是一种利用激光光生成散斑图样的技术，随后通过分析这些图样来可视化血流动力学。该技术可提供微循环的实时、高分辨率评估，这对于神经科学4、腹部外科5、皮肤科6以及其他血管研究领域7,8的临床和实验研究均至关重要。

静息状态下对皮肤灌注值的简单评估通常难以有效识别微血管功能障碍。这既与皮肤血液循环固有的功能特性（如高度变异性、对温度、应激及其他因素的依赖性）有关，也 "假性正常" 在机体代偿反应期间的组织灌注情况（例如，在脓毒性休克早期阶段心输出量增加）。结合使用标准功能性负荷可更准确地评估微循环，并识别在静息状态下被掩盖的微血管功能障碍1. 此外，已知激光散斑成像（LSCI）在评估药物刺激下皮肤微循环方面具有应用价值9.

结合激光散斑衬比成像（LSCI）与血管阻塞试验，可对阻塞后反应性充血（PORH）现象进行无创评估，该现象反映了微循环的重要功能参数，特别是血流储备和微血管的反应性。10该方法在临床研究中被广泛应用，用于识别那些仅通过基础灌注测量无法显现的功能性微循环异常11，但在临床前动物研究中对PORH的评估较为罕见12,13与临床研究相比，使用血管阻断试验在一种 体内 该实验为研究人员提供了更多机会，以评估反应性充血的机制、严重疾病的发病机制以及血管活性药物的药效动力学。当然，这些研究机会必须在现代动物实验伦理标准所规定的范围内进行，确保对动物的仁道对待。

本方案介绍了一种利用激光散斑血流成像技术（LSCI）结合有创血压测量，在麻醉大鼠皮肤上评估反应性充血期血流参数（PORH）的方法。后者需对大鼠颈动脉进行插管，以测量平均动脉压（MAP）和脉搏率。此外，还可采集动脉血样进行实验室检测（如动脉血气分析）。值得注意的是，本方案主要针对无需在实验操作结束后使动物恢复清醒的急性实验（例如危重疾病模型）。我们提出的评估大鼠微循环的方法相对简便，将在比较性血管生理学与病理生理学研究中具有重要应用价值，包括内皮功能障碍的评估，以及新型血管活性药物的临床前测试。

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方案

以下所述操作步骤是根据联邦重症医学与康复学研究和临床中心伦理审查委员会批准的方案进行的。

1. 血管阻断用气动袖带的准备

  1. 使用大鼠无创血压（NIBP）测量系统的气动袖带，在大鼠后爪处建立短暂的血管阻断。
  2. 将袖带连接至无液血压计以及用于测量人体血压的常规机械式血压计的橡胶泵。使用三段透明的3 mm塑料管（其中1 m包含在NIBP系统中）和一个合适尺寸的T型连接器（图1）。
  3. 在动物实验前，检查组装好的气动系统的功能性和密封性。确认袖带充气后压力可在数分钟内维持在200–220 mmHg。

2. 动脉导管、工作站和手术器械的准备

  1. 用70%酒精处理工作区域。用无菌布单覆盖操作台。对导管和器械进行气体灭菌（适用于存活手术和慢性实验）。
  2. 进行颈动脉插管时，使用一根长度为12 cm的PE-50导管（外径0.9 mm，内径0.6 mm），在导管末端25 mm处带有锁定环。为防止动脉穿孔，应使用边缘光滑的导管。
  3. 将22 G钝头针和一支装有肝素化生理盐水（每1 mL含5 IU肝素）的2 mL注射器连接至导管外端。用肝素化生理盐水冲洗导管（0.1–0.2 mL），以确保导管通畅并防止血栓形成。

3. 麻醉与术前处理

注意：所有麻醉剂均可能抑制呼吸和循环功能。根据动物的种类、品系、年龄和健康状况进行正确给药，对于避免致死性过量至关重要。操作人员必须接受过动物麻醉以及生命体征监测方面的培训。相关操作程序必须事先获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）或同等伦理审查机构的批准。操作针头、手术刀及其他锐器时应格外谨慎。锐器须立即丢弃至锐器盒中，禁止针头回套。应警惕针刺伤风险，因其可能传播人畜共患病原体或造成物理性创伤。

  1. 通过腹腔注射（IP）给予氯胺酮（替来他明，10 mg/kg）+ 唑拉西泮（10 mg/kg）2% 盐水溶液和赛拉嗪（5 mg/kg）0.5% 盐水溶液的混合物，使大鼠麻醉。通过检查反射（如脚趾夹捏反应）是否消失来确认麻醉深度是否充分。
  2. 剃除颈部前部和后部区域（包括肩胛间区）的毛发。用皮肤消毒剂（70% 酒精）处理这些区域的皮肤。将动物仰卧位放置在加热的手术台上。
  3. 通过定期评估麻醉深度（自主运动、对疼痛刺激的反应）、呼吸模式（频率、深度、节律、哮鸣音）以及皮肤和黏膜颜色，监测麻醉动物的状态。根据需要追加腹腔注射替来他明 + 唑拉西泮 10 mg/kg。
  4. 使用加热台和保温毯维持动物直肠温度在 36.5–37.0 oC，以避免显著的低体温。

4. 左颈总动脉插管

  1. 在颈部腹侧做一条2 cm的正中皮肤切口。使用止血钳和镊子，沿纵行方向钝性分离颈部肌肉和筋膜，暴露左侧颈总动脉，并游离出5-7 mm长的一段血管。仔细将迷走神经与颈总动脉分离，避免对其造成损伤。
  2. 使用4-0丝线，在动脉的尾端打一个松结，并结扎动脉的头端。将显微外科镊的镊尖置于动脉下方，轻轻牵拉以拉伸血管，防止切开后出血。
  3. 使用头端呈45°角的显微外科剪，在两道结扎线之间的动脉上做横向切口（切口深度不超过血管直径的一半）。
  4. 在动脉上做小切口后，在镊子辅助下将导管向心脏方向插入，直至固定环处。在导管位于血管腔内时，收紧尾端结扎线，并在导管固定环上方再打数个结以加固。
  5. 通过抽吸少量血液进入注射器来检查导管是否通畅，并再次冲洗导管。用光滑的持针器在距固定环2-3 cm处夹闭导管。取下钝针和注射器。
  6. 小心将大鼠翻转为俯卧位。使用手术剪在肩胛骨之间做一条0.5-1.0 cm的正中皮肤切口。将止血钳经背部切口在皮下潜行，通向腹部切口。夹住导管的外端，小心将其经皮下隧道引出，至肩胛间区域。
  7. 在导管外端连接带有2 mL注射器的钝针。
  8. 使用无创针和4-0单股缝线缝合腹部和背部的手术切口。

5. 有创血压测量

  1. 用肝素化生理盐水（每毫升含5 IU肝素）填充有创血压测量系统的校准换能器。
  2. 将动物置于仰卧位。将2 mL注射器从钝针上断开，并将导管连接至换能器（图2）。移除导管上的夹子，并用0.1–0.2 mL肝素化生理盐水冲洗血压通路。
  3. 使用数据采集系统测量并记录血压和心率。血压波形上清晰可辨的脉动（振幅为10–15 mm Hg或更高）表明导管通畅且位置正确。
    注意：为准确测量血压，换能器必须与动物心脏处于同一水平。若血压测量管路中出现气泡，应将其清除，以避免内脏器官发生空气栓塞。
  4. 在测量平均动脉压（MAP）及其他基础生理参数前，使麻醉动物稳定15–20分钟。
  5. 打开数据采集软件程序。从文件菜单中选择新建。
  6. 确保选择正确的物理输入通道（例如输入1）。单击相应通道（例如通道1）标题处的下拉菜单箭头，然后选择通道设置。
  7. 在弹出的对话框中，调整电压范围（±100 mV），以适应预期信号。将显示单位设置为mmHg。
  8. 调整采样率：单击工具栏中的采样率按钮。对于有创血压测量，将采样率设为200 Hz（每秒200个采样点）。如果研究目标包括脉搏波形态分析，则将采样率提高至1 kHz。
  9. 单击开始按钮，以开始记录实验数据。
  10. 当获取到所需数据段后，单击停止按钮。通过文件 | 另存为…保存数据文件，并为其指定唯一的文件名。

6. 使用激光散斑衬比成像技术测量皮肤灌注

  1. 用浸水的纱布擦拭大鼠后足底面，以清洁皮肤。
    注意：请勿使用酒精或其他可能引起皮肤充血的溶液。
  2. 将气动袖带放置于大鼠后肢胫骨和腓肠肌水平的足部位置。
    注意：插入手指和踝关节时需小心，避免损坏袖带内的可充气膜或压迫膝部软组织。
  3. 将大鼠足部置于一块纱布上，并用胶带固定脚趾，以尽量减少运动伪影（图2）。
  4. 准备数据采集硬件和软件，用于通过激光散斑成像（LSCI）方法记录皮肤灌注。
    注意：本研究中使用的硬件包括高速近红外（NIR）黑白相机、相机镜头、NIR线性偏振器以及配备扩散器组的激光光源；软件包括一个视频录制工具，以指定的帧率（90帧/秒）和曝光时间（11 ms）采集图像帧。相机视场的实际尺寸为16 × 16 mm。
  5. 确保感兴趣区域（跗骨和跖骨区域）位于相机镜头的焦点位置。
  6. 调节激光光源，使整个感兴趣区域的照明均匀且不过强。
  7. 调节线性偏振器，以最小化被测物体表面的镜面反射。
  8. 确认视频录制工具中的参数设置正确后，点击采集按钮，连续记录30秒原始黑白图像（基线记录，时间可更长或更短）。利用这些图像计算散斑灌注值（见下文公式2）。
    ​注意：本研究使用了专门开发的实验装置，但任何市售的基于LSCI方法的设备均可用于按照本方案进行测量。建议在暗室中进行LSCI测量，以最大限度减少外部光照对结果的影响。

7. 血管阻塞试验与 PORH 评估

  1. 关闭橡胶泵的减压阀。
  2. 在获取基础皮肤灌注量（静息状态）后，迅速对动物肢体上的气动袖带充气，使其压力超过动物的收缩压（通常为 200–220 mmHg），以可靠地阻断动脉和静脉血流，同时避免肢体损伤。
  3. 继续记录皮肤激光散斑对比成像（LSCI）信号 180 秒（根据研究目的可为 30–300 秒），以确认血管闭塞，并随后确定散斑灌注的“生物学零点”。
  4. 在达到目标闭塞时间后迅速放气，并继续记录皮肤 LSCI 信号至少 180 秒（可根据需要延长或缩短），以记录反应性充血（PORH）的动态变化。
  5. 在血管闭塞前、期间和之后，同步记录有创动脉压波形与皮肤灌注评估数据。利用这些数据计算平均动脉压（MAP）和皮肤血管导纳（CVC）（见下文）。
  6. 使用在软件环境中编写的算法获取散斑灌注值。第一步是将原始单色图像转换为散斑对比图像。使用公式（1）计算平均散斑对比度：
    散斑对比度方程；光学研究中强度变化分析的公式。    (1)
    其中 Intensity 表示某一时刻每个像素的光强。
    注：用于计算对比度的图像数量会显著影响处理结果。本研究中采用了一种时间域 LSCI 算法，其平均计算基于 90 帧图像。
  7. 使用公式（2）将散斑对比值转换为散斑灌注值：
    散斑灌注方程；通过散斑对比度测量血流的公式。  (2)
  8. 选择一个包含感兴趣区域（跗骨和跖骨）的矩形区域，用于对散斑灌注值进行平均（在该矩形区域内）。利用通过此方法获得的散斑灌注随时间变化的曲线（图像）进一步计算所研究的参数。
  9. 根据测得的皮肤灌注值，计算主要的 PORH 参数（图 3）。
  10. 使用公式（3）计算皮肤血管导纳（CVC）：
    CVC 计算公式：CVC = LSCIrest/MAP，方程分析，心血管研究。   (3)  
    其中 LSCIrest 是基线期记录的皮肤散斑灌注平均值（任意单位 = AU）；MAP 是在同一时间段内记录的平均动脉压（mmHg）。
  11. 使用公式（3），将峰值高灌注状态下的相应值（LSCImax）和 MAP 代入，计算峰值皮肤血管导纳（CVCmax）。

8. 实验步骤与重复测量

  1. 在记录基线时的皮肤灌注、反应性充血（PORH）及其他感兴趣的生理变量后，根据批准的研究方案进行实验干预（例如，模拟病理过程和/或给予血管活性药物）。
  2. 在模拟病理过程建立或所给药物效应达到预期时，于下一个研究时间点重新评估PORH及其他生理变量。

9. 实验结束

  1. 急性实验结束后，在深度全身麻醉（替来他明+唑拉西泮和赛拉嗪）下通过动脉内注射2%利多卡因（2 mL）处死大鼠。根据当地法律法规和操作规程，也可采用机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的其他人道处死实验啮齿类动物的方法。
    注意：对于需要存活的操作以及计划让动物从麻醉中恢复的情况，应提供适当的护理，并定期评估动物状况，包括预防低体温和给予充分的术后镇痛（例如，肌肉注射酮洛芬 5-10 mg/kg）。

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结果

我们采用上述评估微血管功能的方法，在一系列实验中对体重为250-300 g的雄性Wistar大鼠建立了失血性休克模型（失血量为计算血容量的35%）。在出血组动物（HS，n = 13）中，在完成放血后30分钟进行PORH参数的评估，同时监测有创血压（BP）。在假手术对照组动物（Sham，n = 10）中，不诱导出血，但在相似的时间段内进行相同的测量。组间差异采用Mann-Whitney U 检验进行分析。结果以中位数和四分位间距表示。

图4 显示了急性失血后与对照组动物相比，血管闭塞180秒后PORH的变化。失血后出血性休克通过动脉低血压的发展得以证实（HS组MAP为61 [49;63] mmHg，假手术组为94 [88;99] mmHg，p < 0.001）以及 HS 组的代谢性乳酸酸中毒（HCO₃⁻）3在休克组（HS）中，血乳酸水平为15.1 [...

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讨论

本文介绍了一种用于在活体啮齿类动物实验中评估皮肤微循环和血管反应性的现代化技术。为了在生理学和药理学研究中成功且标准化地应用该方法，还需考虑若干其他因素。在上述方案中，大鼠采用替来他明+唑拉西泮+赛拉嗪联合麻醉，这主要是由于当地对实验动物操作的标准以及对丁丙诺啡、氯胺酮和其他常用注射类镇痛药与麻醉药的获取受限所致。对于涉及小型手术的药理学研究，若具备合适的设备，首选异氟烷或七氟烷单一吸入麻醉。尽管不同的麻醉方案可能影响血流动力学参数，但本研究未对注射麻醉与吸入麻醉进行直接比较。为保持一致性，所有实验组均采用了相同的注射麻醉方案。

本方案所述为急性实验的实施，但如果计划进行慢性实验，即动物从麻醉中苏醒后进行后续长期观察，则必须采取一系列额外措施，以护理血管导管、评估实验操作的严重程度，并识别疼痛与痛苦的迹象15。此外，在规划延迟重复测量时，必须考虑到实验的基线条件可能受到影响，特别是由于在某些情况下，导管对颈动脉的持续阻塞可能导致脑缺血16。

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本工作由俄罗斯科学基金会项目 24-25-00310 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无创针具，带尼龙外科缝线，4C-0.5x16-4/0-NMedtekhnika，俄罗斯N/A蓝色。长度 75 cm。USP 4/0（MP1.5）。用于缝合外科伤口
大鼠颈动脉插管，配钝头注射器针头 22 GSciCat，俄罗斯 N/APE-50，长度 12 cm，外径=0.9 mm，内径=0.6 mm。带一个固定环
Deltran 一次性压力传感器Utah Medical Products，美国 606912" 电缆
DiscofixC 三通阀，用于输液治疗和监测B. Braun，德国 16494C
肝素Belmedpreparaty，白俄罗斯 N/A肝素钠 5000 IU/mL，5 mL 安瓿
利多卡因Velpharm，俄罗斯N/A注射用溶液 20 mg/mL，2 mL 安瓿
气动袖带 "Systole"Neurobotics，俄罗斯N/A用于啮齿类动物无创血压测量的组件。5–10 mm 尾套（大鼠用）
氯化钠Pharmasyntez，俄罗斯 N/A输注用溶液 0.9%，250 mL
软件 LabChart8 ADInstruments，澳大利亚N/A版本 8.1.13
软件 MATLAB The MathWorks Inc.，美国N/A 版本 R2019b
一次性无菌注射器，1 mL，三件式淮安市恒春医疗器械有限公司，中国N/A 27 G 针头
一次性无菌注射器，2（2.5）mL，三件式Vogt Medical Vertrieb GmbH，德国131052423 G 针头
缝线 SILK-SPolytechmed，俄罗斯 N/A不可吸收，编织型，由带硅涂层的天然蚕丝制成，黑色，带卡匣。USP 4/0（MP1.5）。长度 100 m。用于血管结扎
XylaInterchemie，荷兰N/A 赛拉嗪 20 mg/mL，50 mL
Zoletil 100Virbac，法国 N/A 盐酸替来他明 50 mg/mL，盐酸唑拉西泮 50 mg/mL，5 mL

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