聚丙烯酰胺凝胶电泳在分析与动脉粥样硬化性心血管疾病相关的脂蛋白亚组分中的应用

摘要

本方案旨在阐述一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的脂蛋白亚组分分析方法，该方法为心血管疾病风险评估提供了重要的诊断依据。该方法可将低密度脂蛋白（LDL）分为七个亚组分。其中LDL1和LDL2表现为大颗粒，而LDL3至LDL7则表现为小颗粒。

摘要

低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）是动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）发生的关键因素。LDL-C水平升高与动脉粥样硬化斑块的形成及心血管事件风险密切相关。然而，低密度脂蛋白（LDL）的异质性显著影响其促进动脉粥样硬化的能力。研究表明，LDL颗粒可进一步分为小而密低密度脂蛋白（sdLDL）和大而轻低密度脂蛋白（lbLDL）。其中，sdLDL更易穿透血管内皮，且具有更强的氧化修饰活性，与ASCVD的关联尤为密切。在代谢综合征、糖尿病和高甘油三酯血症患者中，LDL-C水平可能正常，但sdLDL比例升高，导致心血管风险被低估。因此，准确检测LDL亚组分对于ASCVD风险分层和优化干预策略至关重要。

传统的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测方法，如Friedewald公式法和直接测量法，仅能反映总胆固醇水平，无法区分亚组分。检测LDL-C亚组分的方法包括超速离心法（UC）、高效液相色谱法（HPLC）和核磁共振（NMR）技术。然而，这些方法技术要求高、操作复杂或设备昂贵，难以在临床中广泛使用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术通过分子筛效应和电荷差异来分离脂蛋白颗粒。该技术采用非变性梯度凝胶系统，结合苏丹黑等特异性染色方法，具有高分辨率、良好的重复性以及操作简便的优点。利用PAGE技术进行脂蛋白分型，可更全面、精确地评估患者的脂蛋白水平，有助于临床治疗决策。本文展示了五个代表性结果：样本A、B、C、D、E的平均低密度脂蛋白颗粒大小分别为275.3 Å、266.6 Å、258.2 Å、257.4 Å和252.9 Å，提示由于血脂异常，其心血管疾病风险分别为低度、临界、轻度、中度和重度。

引言

根据2021年世界卫生组织报告，心血管疾病 (CVD) 仍是人类疾病中导致死亡的首要原因。该报告指出，2019年全球有1790万人死于心血管疾病，约占全球总死亡人数的三分之一¹。动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是心血管疾病的一种，是中国城乡居民主导的死亡原因，占全部死亡原因的40%以上²。动脉粥样硬化是一种由传统和非传统危险因素共同驱动的慢性炎症性血管疾病³。其特征是脂质在动脉壁内沉积⁴、纤维组织增生及钙化，最终导致血管壁增厚、弹性降低和管腔狭窄。血脂异常是ASCVD最重要的危险因素，其中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）是ASCVD的致病性危险因素，在ASCVD的发生发展中起关键作用⁵。大量流行病学研究、孟德尔随机化研究和随机对照试验一致表明，血浆LDL-C水平与ASCVD风险呈正相关。降低LDL-C水平可减少ASCVD的风险⁶。

低密度脂蛋白（LDL）是体内运输内源性胆固醇的主要脂蛋白⁷。血浆LDL具有异质性，由多种不同大小、密度和化学组成的颗粒构成⁸。大而轻的LDL（LbLDL）颗粒密度较低、体积较大，而小而密的LDL（sdLDL）颗粒密度较高、体积较小。LDL的异质性决定了其生物学效应的多样性⁹。LbLDL颗粒直径较大（≥ 25.5 nm），密度较低（接近1.02 g/mL），结构疏松，主要包括LDL1和LDL2。LbLDL含有较多的胆固醇酯，不易被氧化或穿透血管内皮，因此相对较为安全。相比之下，sdLDL颗粒直径较小（< 25.5 nm）¹⁰，密度较高（接近1.06 g/mL），结构致密，主要包括LDL3至LDL7。sdLDL颗粒所含胆固醇酯较少，但甘油三酯和载脂蛋白B（ApoB）水平高于LbLDL。其物理特性使其更容易穿透动脉内皮屏障。在内皮下层，sdLDL颗粒被活性氧（ROS）氧化，形成氧化型LDL（ox-LDL）¹¹。ox-LDL可抑制内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性，减少NO生成，并诱导内皮细胞表达VCAM-1/MCP-1，促进单核细胞黏附与迁移¹²。迁移进入内皮下的单核细胞分化为巨噬细胞，通过清道夫受体无限制地摄取ox-LDL。细胞内胆固醇酯的积累使其转化为泡沫细胞，后者是动脉粥样硬化脂质条纹的核心成分。泡沫细胞分泌白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子，进一步加剧氧化应激和内皮损伤，形成正反馈循环¹³。这一过程可激活内皮细胞炎症反应，促进泡沫细胞形成，并加速斑块进展。两项大规模队列研究显示，在预测和评估动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）潜在风险方面，sdLDL-C比LDL-C具有更高的临床参考价值^14,15。然而，传统的LDL-C检测方法受限于技术原理，无法检测脂蛋白亚组分。

低密度脂蛋白颗粒（LDL-P）反映单位体积血液中低密度脂蛋白颗粒的数量，作为低密度脂蛋白分子的载体，每个颗粒包含一个载脂蛋白B（ApoB）分子和多个胆固醇分子。LDL-C代表这些颗粒所携带的胆固醇总质量。LDL-C水平受LDL颗粒数量和胆固醇密度的影响，可能无法完全反映实际风险¹⁶。例如，代谢综合征、糖尿病或高甘油三酯血症患者可能LDL-C水平正常，但LDL-P异常升高（由于颗粒较小且胆固醇含量较低）。即使LDL-C水平达到治疗目标，较高的LDL-P仍可能增加残余心血管风险。研究表明，LDL-P对心血管风险的预测能力优于其他任何与LDL相关的参数¹⁷。脂蛋白亚组分的分析对于理解动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的发病机制、评估残余风险以及指导精准治疗至关重要。近年来，国内指南也已推荐将LDL亚组分作为ASCVD风险评估或治疗监测的指标¹⁸。

动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是全球首要的死亡原因，其预防与控制策略在很大程度上依赖于脂质管理。目前，临床实践中对血脂异常个体的筛查主要依赖传统的四项血脂检测，包括甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。此外，其他脂质标志物如脂蛋白(a)、载脂蛋白A1（ApoA1）和载脂蛋白B（ApoB）主要用于ASCVD高危人群¹⁹，例如糖尿病患者、高血压患者、吸烟者，或LDL-C水平已得到控制但仍处于高风险状态的个体。

随着研究的深入，传统血脂检测的局限性日益凸显，尤其是在早期预警效果和残余风险解释方面。大量动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）患者初次诊断时血脂水平正常，导致低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）在初级预警中失效。流行病学数据显示，约20%的急性冠脉综合征患者入院时LDL-C水平处于正常范围（<3.4 mmol/L），提示传统血脂检测可能遗漏高危个体。此外，即使LDL-C水平已达标，ASCVD患者仍可能面临较高的残余心血管风险。在这些患者中，大多数残余冠状动脉事件无法通过LDL-C水平的降低来解释。因此，仅依赖LDL-C检测可能无法完全满足ASCVD诊疗的临床需求，因为常规血脂检测无法区分大浮LDL-C（lbLDL-C）与小密LDL-C（sdLDL-C）。

多项研究已证实脂蛋白亚组分与动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）之间存在明确的相关性。对于血脂水平正常的个体，脂蛋白亚组分检测的异常结果可作为ASCVD一级预防的预警信号，有助于识别隐匿的高危人群。在ASCVD的二级预防中，当低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平已达到目标范围时，脂蛋白亚组分检测有助于评估残余风险并指导进一步治疗²⁰。因此，相较于传统血脂检测，新型低密度脂蛋白亚组分的检测有望为血脂异常及ASCVD的防治提供新的靶点。

本实验室的检测与分析系统主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）根据脂蛋白亚组分的大小和电荷对其进行分离。由于聚丙烯酰胺基质的分子筛效应，脂蛋白颗粒主要依据其大小通过PAGE实现分离：小分子迁移速度快，而大分子因空间位阻受限，迁移速度较慢；同时，分子所带电荷越多，迁移速度越快。该方法可快速将脂蛋白分为十二个亚组分，其中低密度脂蛋白（LDL）被分为七个亚组分，标记为LDL1至LDL7。这些亚组分在粒径、密度、理化性质、代谢行为及致动脉粥样硬化潜能方面均具有明显差异。LDL1和LDL2被归类为大浮密度LDL（lbLDL），而LDL3至LDL7则被归为小密LDL（sdLDL）。脂蛋白亚组分检测技术包括超速离心法（UC）、高效液相色谱法（HPLC）和核磁共振（NMR）。然而，由于这些方法对设备要求高、操作复杂且耗时较长，其在临床上的应用相对受限²¹。相比之下，PAGE方法能够高效分离LDL的多种亚组分，操作更为简便。所用设备成本较低且便于携带，更适合在临床常规实验室中广泛推广。本研究旨在验证PAGE作为一种快速、经济有效的血清LDL亚组分分析方法，以支持临床决策。

方案

本研究中的所有样本均经过广东省人民医院伦理审查委员会评估并批准（批准号：KY2025-435-01）。所有参与者在实验前均签署了书面知情同意书。

1. 试剂盒准备

1. 制备 凝胶缓冲液
   1. 30%丙烯酰胺（ACR）溶液的配制：称取30 g丙烯酰胺，加入80 mL去离子水，搅拌溶解后定容至100 mL。4 °C避光保存，待用。
   2. 1% 双丙烯酰胺（BIS）溶液的配制：称取 1 g 双丙烯酰胺，加入 80 mL 去离子水，搅拌溶解后定容至 100 mL。4 °C 避光保存，待用。
   3. 25% 蔗糖溶液的配制：称取 25 g 蔗糖，加入 70 mL 去离子水，搅拌溶解后定容至 100 mL，4 °C 保存。
   4. 过硫酸铵溶液（10%）的配制：将0.1 g过硫酸铵溶解于1 mL去离子水中，现配现用。
   5. 1 M Tris（pH = 6.8）的配制：称取121.14 g三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane），加入800 mL去离子水，搅拌溶解后调节pH至6.8，最后定容至1000 mL。
   6. 1 M Tris（pH = 8.6）的配制：称取121.14 g三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane），加入800 mL去离子水，搅拌溶解后调节pH至8.6，最后定容至1000 mL。
      注意：操作丙烯酰胺时，应佩戴丁腈橡胶手套、安全护目镜、防护服，并在通风橱中进行。若发生皮肤接触，须立即用肥皂和水清洗，随后就医。若吸入，应立即转移至空气新鲜处。
2. 分离胶的制备
   1. 取一支洁净的玻璃管，用封口膜封住底部。
   2. 依次向一个洁净的烧杯中加入 8.29 mL 30% ACR、17.76 mL 1% BIS、10 mL 25% 蔗糖、1 mL 10% APS、10 mL 1M Tris（pH = 8.6）、0.1 mL 四甲基乙二胺（TEMED）和 32.85 mL 去离子水。充分混匀，得到 80 mL 母液（聚丙烯酰胺浓度为 3.3%），按每根凝胶管 1.2 mL 加入玻璃管中。室温聚合 60 分钟，并用纯化水封液，确保液面平整。
3. 浓缩胶的制备
   1. 依次向洁净烧杯中加入 4.07 mL 30% ACR、3.05 mL 1% BIS、5 mL 25% 蔗糖、0.5 mL 10% APS、5 mL 1 M Tris（pH = 6.8）、0.05 mL TEMED 和 32.33 mL 去离子水，充分混匀，得到 50 mL 母液（聚丙烯酰胺浓度为 3.05%），按每根凝胶管 0.2 mL 加入玻璃管中。室温聚合 60 分钟，并用纯化水封液，确保液面平整。
4. 保存溶液的配制
   1. 称取 6.4 g Tris、75 g 蔗糖、2.5 mL 甘油和 0.3 mL PC-300（抗菌防腐剂），加入 800 mL 去离子水，搅拌溶解，调节 pH 值至 6.8，最后定容至 1000 mL。Tris-HCl 的浓度约为 52 mM。
5. 苏丹黑染色液的配制
   1. 称取 0.03 g 苏丹黑，溶于 2 mL 乙二醇、6 mL 无水乙醇和 2 mL 二甲基亚砜的混合液中。过滤后，分装至每管 1 mL。
      注意：操作苏丹黑和二甲基亚砜时，须佩戴腈类手套和护目镜，避免直接接触。操作必须在通风环境中进行。若皮肤或眼睛接触，应立即用清水冲洗，必要时及时就医。
6. 内包装
   1. 根据试剂盒组成要求完成包装。

2. 试剂盒组成

1. 确保产品包含预制柱、保存液和苏丹黑染色液。预制柱中应含有丙烯酰胺、双丙烯酰胺、蔗糖、过硫酸铵、Tris 和四甲基乙二胺。预制柱的长度为 75 ± 0.5 mm，内径为 5.5 ± 0.02 mm，外径为 7.0 ± 0.02 mm。保存液应含有 Tris、蔗糖、甘油和防腐剂。苏丹黑染色液应含有苏丹黑、乙二醇、无水乙醇和二甲基亚砜。包装规格应根据预制柱的数量不同而有所区别。每份试剂需配备一根预制柱。请勿混合使用不同批次的试剂盒，以免影响实验结果。

3. 样品制备

1. 患者准备：采集血样时，确保患者处于空腹状态。
2. 使用血清分离胶采样管，并按照标准操作程序进行样本采集。血液采集后必须尽快分离血清，以避免溶血。
3. 分离后的血清样本应尽快在室温下进行检测。若无法立即检测，可将样本在2–8 °C下保存最多7天，或在-20 °C下保存最多30天。
4. 使用前将样本恢复至室温并充分混匀，尤其是冻融后的样本。禁止反复冻融，以免影响样本完整性。脂血和溶血样本均可能影响检测结果。若为轻度脂血或溶血样本，建议在室温下以14,462 × g 高速离心15分钟。对于脂血样本，使用移液器从底部吸取全部澄清层；对于溶血样本，收集上清液。随后转移至新的离心管中并进行染色。但如果脂血或溶血情况非常严重，则建议重新采血。

4. 操作步骤

1. 准备
   1. 取出预制柱和待测样本。使用移液器吸取预制柱样本孔中的残留保存液。将预制柱和样本平衡至室温，并用800 mL去离子水溶解14.3 g电泳缓冲液粉末。
2. 染色
   1. 取洁净的离心管并编号，管数与采血管顺序一致。按每50 µL样本加入10 µL苏丹黑染色液的比例加入离心管中，充分混匀后于室温静置30 min进行染色。
      注意：苏丹黑的染色原理基于其亲脂性，可与细胞内的中性脂肪、磷脂和类固醇等脂类物质发生特异性显色反应，形成棕黑色或深黑色颗粒。本体系采用单因素实验设计对染色时间和用量进行了优化 ，具体方案如下：选取三种低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）血清样本（高、中、低浓度），分别设置染色体积为5 µL、10 µL、15 µL和20 µL，染色时间设为10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、45 min和60 min，进行电泳实验后对电泳条带进行灰度分析以验证染色效果。结果确定最佳条件为染色体积10 µL，染色时间30 min ± 5 min。染色体积和时间过低会导致脂蛋白胆固醇染色过浅；而在已达到平衡的前提下，更高的染色体积和时间并无必要。
3. 电泳分离
   1. 将预平衡的预制柱插入电泳槽的橡胶插座中，凝胶柱的样本孔距离橡胶塞约2 cm，确保密封严密无泄漏。当样本凝胶柱数量不足时，用无孔橡胶塞填充空位。
   2. 随后向电泳槽上下槽加入电泳缓冲液，排除预制柱口处的气泡，向预制柱样本孔中加入25 µL染色后的样本。
   3. 盖上盖子，接通电源开关，设置电泳参数：电压（U = 100 V）、电流（I = 3 mA/管）、功率（P = 120 W）、时间（T = 70 min）进行电泳分离。
      注意：电压、功率和时间是固定参数，电流需根据检测样本数量进行设置（例如，10个样本管，I = 3 mA × 10管 = 30 mA）。
   4. 电泳完成后关闭电源，打开盖子，倒掉电泳装置上部的电泳缓冲液，依次取出凝胶柱并放置于固定架上，倒去表面多余的电泳缓冲液，随后在扫描分析系统中进行分析。
4. 扫描分析
   注意：分析仪型号为DY-03，扫描软件为KBL 3.3.9 GD。
   1. 打开扫描分析仪电源开关，双击桌面系统软件，点击采集进入软件界面。在软件界面中点击推出样本架，将凝胶柱按取样端朝向设备内部的方向放置于样本架上，确保凝胶柱置于对应的编号位置。25号和26号位置专用于质控检测。
   2. 在软件界面点击导入样本架，将样本架导入设备。点击扫描获取样本扫描图像。设备内置自动对焦系统，可自动调节扫描模块与凝胶管之间的焦距，确保成像清晰。软件自动识别电泳图谱的起始位置（VLDL）和终止位置（HDL）。当在这些位置检测到明显峰时，软件将锁定指定分析区域进行光谱分析。
   3. 输入患者信息并扫描条形码后，点击软件界面中的分析处理，系统将自动分析并生成检测报告。点击上传LIS，将检测报告传输至LIS系统。
   4. 扫描分析完成后取出预制柱，按照医疗废弃物规范进行处理。

5. 质量控制

1. 在每日样本检测前，需对两个水平进行质控测试。质控测试的操作步骤与样本检测相同。A型参考标准为平均粒子直径大于268 Å；B型参考标准为平均粒子直径小于265 Å。
   注：结果分析：A型，平均LDL粒子大小>268 Å，LDL1和LDL2占比较高，提示心血管疾病风险较低；中间型（INT型），平均LDL粒子大小为265至268 Å，提示LDL3至LDL7比例超过临界值；B型，平均LDL粒子大小<265 Å，LDL3至LDL7占比较高，提示心血管疾病风险较高。

6. 技术改进

1. 为确保准确的诊断结果，应实施以下技术改进：
   1. 检查前：确保患者在采血前完全禁食。使用血清或EDTA抗凝血浆，避免使用肝素抗凝血浆。确保移液器吸液准确。避免严重乳糜或 溶血样本。
   2. 检查过程中：根据标准操作规程设置电泳参数，电压（U = 100 V）、电流（I = 3 mA/管）、功率（P = 120 W）、时间（T = 70 min）。佩戴无菌手套，防止玻璃试管污染，以免影响拍照和扫描效果。
   3. 检查后：出具报告时，应复查异常色谱图是否存在潜在干扰，并进行重新分析，以避免提供错误的诊断结论。
      1. 正常色谱图：VLDL起始位置和HDL终止位置均出现明显峰（见代表性结果部分）。
      2. 异常色谱图：VLDL起始位置或HDL终止位置无峰或出现多个峰。

结果

本研究旨在开发一种利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测受试者血清中脂蛋白亚组分的方法。目标是确定低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）亚组分主要是大颗粒（LDL1 和 LDL2）还是小颗粒（LDL3 至 LDL7）。用苏丹黑染色后，样品通过电泳装置在聚丙烯酰胺凝胶中分离。脂蛋白随后在凝胶管中分离成不同的条带，并利用扫描分析系统进行亚组分分析。

该分析仪器通过电泳扫描灰度图像计算峰形和峰面积。利用峰的迁移距离和加权峰面积，估算每个样本的平均低密度脂蛋白（LDL）颗粒大小。我们的系统可提供每种脂蛋白亚组分的相对百分比。实验室可手动输入总胆固醇浓度，以获得脂蛋白亚组分的绝对含量。在本系统中，LDL亚组分根据迁移距离进行分类，并以保留因子（Rf）表示。LDL亚组分位于极低密度脂蛋白（VLDL，Rf = 0.0）和高密度脂蛋白（HDL，Rf = 1.0）之间。LDL被分为七个区带，其Rf值范围为0.32至0.64。Rf值0.32、0.38、0.45、0.51、0.56、0.6和0.64分别对应LDL1至LDL7。本系统采用光密度分析软件，但内部算法为定制开发。该系统可自动分析谱图，操作人员无需接...

讨论

尽管研究表明小而密低密度脂蛋白（sdLDL）在动脉粥样硬化发展过程中作为心血管危险因素的作用已得到证实，但目前尚无确立的方法用于识别LDL亚组分。过去几十年来，LDL亚组分检测方法的研发取得了显著进展。超速离心法（UC）被认为是金标准，它可根据脂蛋白颗粒密度的差异实现LDL亚组分的分离，从而高分辨率地区分sdLDL与大而轻LDL（lbLDL）。然而，该方法需要昂贵的超速离心机且离心时间较长，可能破坏不稳定颗粒组分的完整性。此外，UC不仅无法定量低密度脂蛋白颗粒数（LDL-P），其检测准确性还因实验室而异，依赖于操作人员的技术水平²²。高效液相色谱法（HPLC）可在脂蛋白分离后利用HPLC设备对LDL亚组分进行鉴定与检测²³。HPLC技术具有高度的可重复性和准确性，适合大规模样本分析，是理想的选择。然而，设备成本高昂、化学沉淀可能影响检测结果以及样本处理时间较长等因素限制了其在临床中的应用效率。核磁共振（NMR）技术通过测量不同脂蛋白颗粒中末端甲基质子发射的信号来工作，NMR信号可提供有关不同颗粒亚组分浓度及其平均粒径的信息

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电泳缓冲液粉末	广西康博莱科技有限公司	25030401	用于配制缓冲溶液并提供电泳条件
高值质控产品	广西康博莱科技有限公司	25030301	用于监测检测的准确性和精密度
脂蛋白样本密度分离液（梯度凝胶电泳）	广西康博莱科技有限公司	LSS60-SB1-A1  25030301	用于从血清样本中分离脂蛋白亚组分
低值质控产品	广西康博莱科技有限公司	25030301	用于监测检测的准确性和精密度
苏丹黑染色液	广西康博莱科技有限公司	LSS60-SB1-A1  25030301	用于样本染色