聚丙烯酰胺凝胶电泳在分析与动脉粥样硬化性心血管疾病相关的脂蛋白亚组分中的应用

摘要

本方案旨在阐述一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的脂蛋白亚组分分析方法，该方法为心血管疾病风险评估提供了重要的诊断依据。该方法可将低密度脂蛋白（LDL）分为七个亚组分。其中LDL1和LDL2表现为大颗粒，而LDL3至LDL7则表现为小颗粒。

摘要

低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）是动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）发生的关键因素。LDL-C水平升高与动脉粥样硬化斑块的形成及心血管事件风险密切相关。然而，低密度脂蛋白（LDL）的异质性显著影响其促进动脉粥样硬化的能力。研究表明，LDL颗粒可进一步分为小而密低密度脂蛋白（sdLDL）和大而轻低密度脂蛋白（lbLDL）。其中，sdLDL更易穿透血管内皮，且具有更强的氧化修饰活性，与ASCVD的关联尤为密切。在代谢综合征、糖尿病和高甘油三酯血症患者中，LDL-C水平可能正常，但sdLDL比例升高，导致心血管风险被低估。因此，准确检测LDL亚组分对于ASCVD风险分层和优化干预策略至关重要。

传统的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测方法，如Friedewald公式法和直接测量法，仅能反映总胆固醇水平，无法区分亚组分。检测LDL-C亚组分的方法包括超速离心法（UC）、高效液相色谱法（HPLC）和核磁共振（NMR）技术。然而，这些方法技术要求高、操作复杂或设备昂贵，难以在临床中广泛使用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术通过分子筛效应和电荷差异来分离脂蛋白颗粒。该技术采用非变性梯度凝胶系统，结合苏丹黑等特异性染色方法，具有高分辨率、良好的重复性以及操作简便的优点。利用PAGE技术进行脂蛋白分型，可更全面、精确地评估患者的脂蛋白水平，有助于临床治疗决策。本文展示了五个代表性结果：样本A、B、C、D、E的平均低密度脂蛋白颗粒大小分别为275.3 Å、266.6 Å、258.2 Å、257.4 Å和252.9 Å，提示由于血脂异常，其心血管疾病风险分别为低度、临界、轻度、中度和重度。

引言

根据2021年世界卫生组织报告，心血管疾病 (CVD) 仍是人类疾病中导致死亡的首要原因。该报告指出，2019年全球有1790万人死于心血管疾病，约占全球总死亡人数的三分之一¹。动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是心血管疾病的一种，是中国城乡居民主导的死亡原因，占全部死亡原因的40%以上²。动脉粥样硬化是一种由传统和非传统危险因素共同驱动的慢性炎症性血管疾病³。其特征是脂质在动脉壁内沉积⁴、纤维组织增生及钙化，最终导致血管壁增厚、弹性降低和管腔狭窄。血脂异常是ASCVD最重要的危险因素，其中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）是ASCVD的致病性危险因素，在ASCVD的发生发展中起关键作用⁵。大量流行病学研究、孟德尔随机化研究和随机对照试验一致表明，血浆LDL-C水平与ASCVD风险呈正相关。降低LDL-C水平可减少ASCVD的风险⁶。

低密度脂蛋白（LDL）是体内运输内源性胆固醇的主要脂蛋白⁷。血浆LDL具有异质性，由多种不同大小、密度和化学组成的颗粒构成⁸。大而轻的LDL（LbLDL）....

方案

本研究中的所有样本均经过广东省人民医院伦理审查委员会评估并批准（批准号：KY2025-435-01）。所有参与者在实验前均签署了书面知情同意书。

1. 试剂盒准备

1. 制备 凝胶缓冲液
   1. 30%丙烯酰胺（ACR）溶液的配制：称取30 g丙烯酰胺，加入80 mL去离子水，搅拌溶解后定容至100 mL。4 °C避光保存，待用。
   2. 1% 双丙烯酰胺（BIS）溶液的配制：称取 1 g 双丙烯酰胺，加入 80 mL 去离子水，搅拌溶解后定容至 100 mL。4 °C 避光保存，待用。
   3. 25% 蔗糖溶液的配制：称取 25 g 蔗糖，加入 70 mL 去离子水，搅拌溶解后定容至 100 mL，4 °C 保存。
   4. 过硫酸铵溶液（10%）的配制：将0.1 g过硫酸铵溶解于1 mL去离子水中，现配现用。
   5. 1 M Tris（pH = 6.8）的配制：称取121.14 g三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane），加入800 mL去离子水，搅拌溶解后调节pH至6.8，最后定容至1000 mL。
   6. 1 M Tris（pH = 8.6）的配制：称取121.14 g三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane），加入800 mL去离子水，搅拌溶解后调节....

结果

本研究旨在开发一种利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测受试者血清中脂蛋白亚组分的方法。目标是确定低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）亚组分主要是大颗粒（LDL1 和 LDL2）还是小颗粒（LDL3 至 LDL7）。用苏丹黑染色后，样品通过电泳装置在聚丙烯酰胺凝胶中分离。脂蛋白随后在凝胶管中分离成不同的条带，并利用扫描分析系统进行亚组分分析。

该分析仪器通过电泳扫描灰度图像计算峰形和峰面积。利用峰的迁移距离和加权峰面积，估算每个样本的平均低密度脂蛋白（LDL）颗粒大小。我们的系统可提供每种脂蛋白亚组分的相对百分比。实验室可手动输入总胆固醇浓度，以获得脂蛋白亚组分的绝对含量。在本系统中，LDL亚组分根据迁移距离进行分类，并以保留因子（Rf）表示。LDL亚组分位于极低密度脂蛋白（VLDL，Rf = 0.0）和高密度脂蛋白（HDL，Rf = 1.0）之间。LDL被分为七个区带，其Rf值范围为0.32至0.64。Rf值0.32、0.38、0.45、0.51、0.56、0.6和0.64分别对应LDL1至LDL7。本系统采用光密度分析软件，但内部算法为定制开发。该系统可自动分析谱图，操作人员无需接.......

讨论

尽管研究表明小而密低密度脂蛋白（sdLDL）在动脉粥样硬化发展过程中作为心血管危险因素的作用已得到证实，但目前尚无确立的方法用于识别LDL亚组分。过去几十年来，LDL亚组分检测方法的研发取得了显著进展。超速离心法（UC）被认为是金标准，它可根据脂蛋白颗粒密度的差异实现LDL亚组分的分离，从而高分辨率地区分sdLDL与大而轻LDL（lbLDL）。然而，该方法需要昂贵的超速离心机且离心时间较长，可能破坏不稳定颗粒组分的完整性。此外，UC不仅无法定量低密度脂蛋白颗粒数（LDL-P），其检测准确性还因实验室而异，依赖于操作人员的技术水平²²。高效液相色谱法（HPLC）可在脂蛋白分离后利用HPLC设备对LDL亚组分进行鉴定与检测²³。HPLC技术具有高度的可重复性和准确性，适合大规模样本分析，是理想的选择。然而，设备成本高昂、化学沉淀可能影响检测结果以及样本处理时间较长等因素限制了其在临床中的应用效率。核磁共振（NMR）技术通过测量不同脂蛋白颗粒中末端甲基质子发射的信号来工作，NMR信号可提供有关不同颗粒亚组分浓度及其平均粒径的信息

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电泳缓冲液粉末	广西康博莱科技有限公司	25030401	用于配制缓冲溶液并提供电泳条件
高值质控产品	广西康博莱科技有限公司	25030301	用于监测检测的准确性和精密度
脂蛋白样本密度分离液（梯度凝胶电泳）	广西康博莱科技有限公司	LSS60-SB1-A1  25030301	用于从血清样本中分离脂蛋白亚组分
低值质控产品	广西康博莱科技有限公司	25030301	用于监测检测的准确性和精密度
苏丹黑染色液	广西康博莱科技有限公司	LSS60-SB1-A1  25030301	用于样本染色