需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

整合网络药理学研究肉桂醛对奥沙利铂诱导神经毒性的保护作用

469 次观看

⸱

DOI：

10.3791/69013

⸱

2025年11月28日

 ,  ,  , 
1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Medical Oncology, Cancer Hospital of China Medical University, Cancer Hospital of Dalian University of Technology, Liaoning Cancer Hospital & Institute, 2China Medical University, 3Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

本文内容

摘要

本研究探讨了肉桂醛（CA）对奥沙利铂（OXA）诱导的大鼠背根神经节（DRG）细胞损伤的保护作用。通过网络药理学分析及实验验证，揭示其潜在机制涉及抑制JAK2/STAT3信号通路以及激活SLC7A11-GSH-GPX4通路。

摘要

本研究探讨肉桂醛（CA）对奥沙利铂（OXA）诱导的大鼠背根神经节（DRG）细胞损伤的保护作用。通过传统中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、基于整合药理学的中药网络计算研究平台（TCMIP）以及PharmMapper平台，分析CA的药理活性，并鉴定其潜在作用靶点及其代谢产物的靶点。采用CCK-8法测定药物最佳浓度，利用丙二醛（MDA）检测评估脂质过氧化水平。通过检测细胞内Fe²⁺水平2+ 使用荧光探针定量活性氧（ROS）。检测了咖啡酸（CA）对奥沙利铂（OXA）处理的背根神经节（DRG）细胞中p-STAT3、XCT和GPX4等蛋白表达水平的影响 通过 免疫印迹。网络药理学分析鉴定了14个重叠靶点 "CA-神经病理性疼痛（NP）-铁死亡"实验结果表明，经 4.0 µmol/L CA 处理 24 小时后效果最佳，可显著降低 MDA 和 Fe2+，以及DRG细胞中的ROS水平（P < 0.05）。此外，CA处理下调了JAK2、STAT3、p-STAT3、TFRC、ErbB-1和核因子-κB（NF-κB）的表达（P < 0.05），同时上调XCT、GPX4和FTH1的表达（P < 0.05）。这些发现表明，CA通过抑制JAK2/STAT3信号通路并激活SLC7A11-GSH-GPX4轴，减轻OXA对DRG细胞的损伤。

引言

近年来，铁死亡作为一种非凋亡性细胞死亡方式，已被证实参与多种化疗药物诱导的组织损伤。铁死亡的核心机制是铁依赖性脂质过氧化产物的累积1。顺铂神经毒性机制的研究表明，该药物可通过多种途径诱导神经元发生铁死亡，而这一过程与神经毒性的发生发展直接相关。具体而言，顺铂可抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的活性。作为铁死亡中的关键"刹车分子"，GPX4失活后无法清除脂质氢过氧化物（L-OOH），从而导致神经元细胞膜发生氧化损伤2。同时，奥沙利铂可通过芬顿反应促进神经细胞内铁死亡的发生，并加剧活性氧（ROS）的生成，进一步放大铁死亡级联反应3。这些证据提示，靶向调控神经元变性过程可能是缓解奥沙利铂神经毒性的潜在策略。

奥沙利铂（OXA）是一种广泛用于结直肠癌治疗的第三代铂类化疗药物，具有显著的抗肿瘤疗效，但常伴随明显的神经毒性。长期使用常导致奥沙利铂诱导的神经病理性疼痛（OINP），其发生率高达60%4，临床特征表现为机械性异常性疼痛、热痛觉过敏和冷超敏5。尽管该不良反应十分常见，目前对OINP的治疗策略仍不充分，严重影响患者的生活质量。因此，阐明OINP的分子机制并发现新的治疗靶点，仍是当前研究的关键方向6。

肉桂醛（CA）是肉桂精油的主要活性成分，是一种黄色粘稠液体7,8，具有多种生物活性，包括杀虫9、抗菌10、抗真菌11、抗氧化12、抗糖尿病13、抗癌14、抗炎以及神经血管保护作用15,16。新近研究表明，CA可能抑制JAK/STAT信号通路的活化17。CA的化学式为C9H8O，其化学结构见图1。作为一种天然的中药单体，CA表现出广泛的药理活性。在神经保护方面，多项研究已证实CA可通过血脑屏障进入中枢神经系统，通过激活Nrf2/ARE信号通路促进抗氧化酶（如HO-1和NQO1）的表达，减少神经细胞内活性氧（ROS）的积累，从而缓解缺血性脑卒中、阿尔茨海默病等疾病的神经氧化损伤18,19。同时，CA还能抑制小胶质细胞的过度活化，减少炎症因子（如TNF-α、IL-1β）的释放，减轻神经炎症反应20。然而，目前尚未见报道CA是否可通过调控铁死亡通路缓解奥沙利铂诱导的神经毒性。

JAK2/STAT3 信号通路是一种重要的细胞内信号转导机制，可将细胞膜接收到的信号传递至细胞核，与细胞增殖、分化、凋亡、氧化应激以及炎症反应等关键生物学过程密切相关21。作为与炎症反应密切相关的通路，JAK3/STAT3 信号通路在激活状态下可触发炎症反应，导致组织发生炎性损伤。研究表明，抑制 JAK3/STAT3 信号通路可减轻血管性痴呆大鼠的炎症反应和氧化损伤，从而改善大鼠的认知功能22。此外，抑制 JAK3/STAT3 信号通路还可缓解癫痫大鼠的炎症反应，降低神经元凋亡速率，减轻脑损伤23。尽管咖啡酸（CA）对神经系统具有一定保护作用，但其改善作用是否与调控 JAK3/STAT3 信号通路相关，目前尚无明确结论。

本研究旨在验证 体外 JAK2/STAT3 信号通路的抑制以及 LC7A11-GSH-GPX4 轴的激活可减轻奥沙利铂（OXA）诱导的大鼠背根神经节（DRG）细胞损伤。此外，研究还探讨了咖啡酸（CA）潜在的抗铁死亡作用，并分析了通过网络药理学鉴定的关键靶点在调控 DRG 细胞炎症反应中的作用。

目前针对奥沙利铂诱导的神经毒性，治疗策略主要集中在螯合游离的铂离子以减轻神经损伤，例如使用钙镁复合物，其主要目标是缓解急性周围神经病变（如手足麻木和刺痛）24。然而，其确切机制尚不明确。这些治疗方法无法逆转奥沙利铂引起的慢性病变，如轴突变性和神经纤维退化，在预防累积性神经毒性方面疗效也有限。本实验通过结合抗炎与抗铁死亡机制，探讨了在5 µM OXA处理下4 µM CA的神经保护作用。研究结果证实，该机制的激活是奥沙利铂诱导神经病变（OINP）的关键起始步骤。特异性抑制剂的发现有望替代现有的非特异性治疗手段，从而提高治疗干预的精准性和有效性。

的 体外 本实验所采用的模型涉及用于研究OINP的分离大鼠背根神经节（DRG）神经元。然而，该模型在遗传背景、代谢特征及毒性敏感性方面与人类原代细胞存在显著差异，可能导致研究结论难以直接应用于临床。此外，细胞功能的维持 体内 神经组织依赖于多细胞协调和动态微环境的精确调控——这些复杂的因素难以完全模拟 体外 模型

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：该细胞系源自大鼠细胞系。

1. 网络药理学分析

注意：链接可在材料表中找到。

  1. 寻找咖啡酸（CA）的潜在作用靶点
    1. 从 PubChem 数据库中获取结构信息，并探索 CA 的潜在生物学机制。随后利用 SwissTargetPrediction 进行靶点预测分析，充分发挥其先进的计算能力。
    2. 为提高分析的准确性和全面性，将预测得到的靶点与中医药特异性数据库（包括 TCMSP 和 TCMIP）进行交叉比对。
    3. 查阅相关文献以识别其他潜在靶点。整合所得靶点列表，构建一个全面的数据集，作为进一步开展 CA 相关生物活性研究及药物开发的重要参考依据。
  2. 神经病理性疼痛（NP）潜在靶点的鉴定
    1. 利用 GeneCards 数据库和 TTD 数据库，以“"neuropathic pain"”和“"ferroptosis"”为关键词进行广泛检索。在 GeneCards 数据库中，优先选择“"Relevance score"”高于中位数的基因靶点，因其与本研究主题的相关性更高。
    2. 将上述筛选出的基因靶点与 TTD（Therapeutic Target Database）数据库中的数据进行整合。在整合过程中，通过与 TTD 数据库条目交叉比对，确保潜在靶点的全面识别。系统性地去除整合后基因靶点数据集中的重复条目，确认最终数据集包含一组唯一的潜在靶点列表。
  3. 确定“"CA-NP-铁死亡（Ferroptosis）"”的交集靶点
    1. 通过在线生成维恩图（Venn diagram），确定 CA、NP 和铁死亡三者靶点的交集。
    2. 将这些交集靶点定义为“"CA 调控的 NP-铁死亡通路"”的潜在候选靶点。
  4. 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络
    1. 为进一步研究，将“"CA-NP-铁死亡"”、“"CA-NP"”和“"CA-铁死亡"”的共有靶点提交至 STRING 数据库。
    2. 设定相互作用评分阈值为“"最高置信度 > 0.4"”，并限制第一层和第二层相互作用蛋白的最大数量为 10。其余参数采用默认设置，构建“"CA-NP-铁死亡"”的 4.5 版本 PPI 网络。
  5. GO 与 KEGG 富集分析
    1. 将“"CA-NP-铁死亡"”的交集靶点上传至 DAVID 平台，设置参数如下：“"选择标识符：官方基因符号（official gene symbol）"”、“"列表类型：基因列表（genelist）"”以及“"物种：智人（Homo sapiens）"”。在三个类别上进行基因本体（GO）富集分析：生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。
    2. 进行 KEGG 通路富集分析，并利用 Hiplot 平台绘制柱状图对结果数据进行可视化展示。

2. 分子对接

  1. 为了阐明活性化合物与其疾病相关靶点之间的相互作用，从 PubChem 数据库获取活性物质的结构信息作为小分子，同时从蛋白质数据库（PDB）获取靶标蛋白的三维结构作为蛋白模型。
  2. 利用 PyMOL 对蛋白受体结构进行预处理，去除水分子和非必需的配体。随后使用 AutoDock Tools 1.5.7 准备靶标蛋白和活性物质，并采用 AutoDock Vina 执行半柔性分子对接。
  3. 分析受体蛋白上活性物质的结合能及结合位点。对于 JAK2 蛋白，根据X射线晶体学数据和最优分辨率，从PDB数据库中选取其结构（PDB ID: 3e64）。
  4. 使用 PyMOL 软件对 JAK2 结构进行准备，包括去除配体、移除水分子以及添加氢原子。活性化合物的小分子结构来源于 PubChem。
  5. 将蛋白和化合物结构载入 AutoDock Tools 1.5.7，定义对接盒子，并使用 AutoDock Vina 进行分子对接。

3. 细胞培养

注意：以下步骤将在验证实验中重复使用。需严格遵守无菌操作技术。本部分实验使用低速水平转子离心机。

  1. 用75%酒精对购买的无菌细胞的外包装和培养瓶进行消毒，然后转移至超净工作台中的培养皿内进行传代培养，直至细胞铺满五个直径10 cm的培养皿，以确保有足够的细胞储备。
  2. 在 -80 °C 条件下冻存细胞，以用于后续实验。
    1. 准备DMEM、细胞培养级DMSO、胎牛血清（FBS）、15 mL离心管、移液器、冻存管和冰浴。将1 mL DMSO、1 mL FBS和8 mL DMEM混合，总体积为10 mL。将DMSO置于冰上冷却15分钟。首先将基础培养基转移至离心管中，然后在旋转条件下缓慢加入预冷的DMSO。用移液器充分混匀，再轻轻加入FBS并再次混匀。将混合液置于冰浴中保存，以备后续使用。
      注意：20%-50% 浓度的 DMSO 会导致 LDH 释放显著增加，表明高浓度 DMSO 具有细胞毒性，而 10% DMSO 相对安全。这未影响我们的实验25.
    2. 取对数生长期细胞，用 PBS 洗涤 3 次，然后按每 10 cm 培养皿加入 0.25% 胰蛋白酶 400 µL。
      注意：一旦出现细胞质回缩、连接变松或大规模漂浮迹象，应立即停止消化过程。
    3. 预消化准备：将关键试剂（0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液和DRG完全培养基）预热至37 °C。从培养箱中取出细胞培养瓶，用无菌移液管弃去旧培养基，防止残留培养基影响消化效率。用5 mL无菌PBS轻柔冲洗单层培养的细胞两次，以去除残留血清，同时避免细胞脱落。
    4. 向培养容器中加入2 mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，确保完全覆盖单层细胞。室温孵育1–3分钟。在此期间，每隔30秒在倒置显微镜下观察细胞。当大部分细胞开始收缩、变圆并出现明显的细胞间隙时，立即终止消化（以防止过度消化和细胞损伤）。
    5. 迅速向培养容器中加入 4 mL 完全预热的培养基。使用无菌移液管轻轻吹打混合物 5 次，将细胞团块分散成单细胞悬液。将全部单细胞悬液转移至无菌的 15 mL 离心管中，于 300 x g 条件下离心收集细胞沉淀。 g 25 °C 下使用低速水平转子离心机离心 5 分钟。
    6. 弃去上清液，加入5 mL预先配制的冷冻保存液。用移液器轻轻吹打使细胞均匀混合。将细胞悬液均匀分装至5支冻存管中。
    7. 用细胞名称、冻存日期和操作者标记冻存管；将其放入冻存盒中，置于 -80 °C 超低温冰箱保存，过夜后转移至液氮中。
  3. 细胞复苏
    1. 佩戴手套，从液氮容器中取出冻存管，并立即浸入37 °C温水中，期间偶尔轻轻摇动，以确保快速解冻（1分钟内）。
    2. 从37 °C水浴中取出小瓶，打开瓶盖，用移液器吸取细胞悬液，转移至离心管中，加入10倍体积的培养基，充分混匀，于300 x g 5 分钟（25 °C）。
    3. 弃去上清液，加入5 mL含10%胎牛血清的培养基（此细胞培养条件下的完全培养基），接种至培养皿中，在37 °C、95%湿度、5% CO₂条件下静置培养。2 培养箱
    4. 第二天更换培养基（以去除残留的DMSO和死亡细胞），并继续观察细胞生长状况。若细胞密度较高，应及时进行传代培养以用于后续实验。
  4. 细胞计数
    注意：本实验部分使用了低速水平转子离心机。
    1. 提前配制75%酒精，用于清洁计数室和盖玻片，然后将其晾干备用。
    2. 将消化并离心后的细胞重悬于1 mL培养基中，取50 µL细胞悬液加入150 µL培养基，于1.5 mL EP管中混匀，制成4倍稀释的细胞悬液。
    3. 均匀振荡，取10 µL样品，注入盖玻片与计数室之间，充分填充计数室并避免产生气泡。将计数板置于显微镜下进行观察和计数。计数原则：不遗漏、不重复计数；计上边界和左边界接触的细胞，不计下边界和右边界接触的细胞。
    4. 根据实验要求，依据铺板或培养皿接种所需的细胞数量及细胞计数结果计算细胞悬液体积，然后用完全培养基补足至所需总体积。

4. 细胞活力检测方案

注意：选择度洛西汀作为西药对照药物，是因为它是一种广泛使用且经临床验证的治疗周围神经病理性疼痛的药物。其在该适应症中的确切疗效（得到临床实践指南和随机对照试验的支持）可确保对照组为评估试验干预措施的相对有效性提供可靠的参考依据。

  1. 首先，弃去培养容器中的旧培养基，用 5 mL PBS 冲洗细胞表面，以去除残留的血清。然后加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在室温下孵育 1–3 分钟。当显微镜下观察到细胞收缩、变圆并脱落时，立即加入 4 mL DRG 完全培养基以终止消化，并通过吹打重悬细胞。
  2. 将细胞悬液转移至离心管中，在 25 °C 下使用低速水平转子离心机以 300 x g 离心 5 分钟收集细胞沉淀。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 15 mL 离心管中，充分吹打混匀。
  3. 取一个 1.5 mL EP 管，先加入 150 µL 培养基，再加入 50 µL 细胞悬液，充分混匀，实现 4 倍稀释。
  4. 然后用 75% 酒精清洁计数室和盖玻片，晾干后再次将 EP 管轻轻振荡混匀。
  5. 取 10 µL 细胞悬液，注入盖玻片与计数室之间，确保液体充满计数室且不产生气泡。
  6. 在显微镜下观察，并按照计数原则统计细胞数量，避免遗漏或重复计数。
    注意：若计得细胞数为 n，则离心管中细胞浓度为 n/mL。
  7. 根据实验要求，按每孔 2,000 个细胞的密度将细胞接种至 96 孔板中。
  8. 首先向 96 孔板外周各孔加入 200 µL PBS，然后根据分组加入含细胞的培养基。
  9. 在 37 °C、95% 湿度、5% CO2 培养箱中孵育 24 小时后，吸除旧培养基，用 200 µL PBS 洗涤两次。根据实验设计，将 CA 按梯度稀释（0 µM、2 µM、4 µM、8 µM、16 µM、32 µM），每孔加入 200 µL 至 96 孔板。
  10. 用 OXA（5 µM）预处理细胞 24 小时后，分别用不同浓度的 CA（0 µM、2 µM、4 µM、8 µM、16 µM、32 µM）处理 DRG 细胞 24 小时。
    注意：本部分实验旨在确定 CA 的最佳药物浓度。
  11. 用 PBS 缓冲液洗涤 96 孔板三次，每孔加入 200 µL 新鲜配制的 CCK-8 工作液。该步骤需避光操作，实验时间控制在 10 分钟内完成。将溶液在 37 °C、95% 湿度、5% CO2 培养箱中孵育 4 小时。最后使用酶标仪测定各孔吸光度值。所有实验需在相同条件下至少重复三次。

5. 多重置换扩增（MDA）

  1. 在15 cm培养皿中接种10 × 106个DRG细胞，于37 °C、95%湿度、5% CO2培养箱中培养过夜。移除培养基，加入药物，并在37 °C、95%湿度、5% CO2培养箱中继续孵育24小时。
  2. 移除培养基，用5 mL PBS洗涤一次。消化后，使用DMEM培养基将细胞收集至锥形管中。
  3. 将处理后的DRG细胞分别加入5 mL微量离心管中。使用低速水平转子离心机以300 x g离心5分钟，弃去上清液。然后加入1 mL PBS，用移液器吹打混匀，转移至新的1.5 mL微量离心管中。再次使用低速水平转子离心机以300 x g离心5分钟，弃去上清液。
  4. 加入100 µL抗氧化PBS溶液，用移液器吹打混匀，制备细胞悬液。制备MDA标准溶液。
    注意：参见使用荧光法配制标准MDA溶液的方法；具体操作步骤请参考试剂盒的"试剂盒组分"部分。
  5. 向样品管和标准管中分别加入100 µL裂解缓冲液，使用涡旋振荡器充分混匀。室温静置5分钟。
  6. 向每管中加入250 µL配制好的工作液，使用涡旋混合器充分混匀。在自然光环境下将水浴加热至95 °C，反应15分钟，随后立即放入冰浴中冷却5分钟。在4 °C条件下，使用高速角转子离心机以10,000 x g离心10分钟。
  7. 取100 µL上清液加入黑色96孔板中。使用荧光酶标仪测定荧光强度（激发波长：540 nm，发射波长：590 nm）。根据标准曲线计算样品中的MDA浓度。

使用 Fe2+ 检测试剂盒测定细胞内 Fe2+ 含量

  1. 提前预热水浴锅，并将温度升至 37 °C。佩戴手套，从液氮中取出 DRG 细胞，用一层塑料袋包裹后，浸入 37 °C 温水中，间歇轻轻摇动，确保在 1 分钟内完全解冻。
  2. 解冻后，将冻存管从 37 °C 水浴中取出，打开管盖，吸取细胞悬液，转移至 15 mL 离心管中，逐滴加入 10 mL 培养基，充分混匀。使用低速水平转子离心机在 300 x g 条件下离心 5 分钟（25 °C）。
  3. 离心后弃去上清液，加入 10 mL 新鲜培养基，用移液器吹打混匀，再次离心。重复此步骤 3 次，然后接种至新的培养皿中。
  4. 将细胞置于 37 °C、95% 湿度、5% CO2 的培养箱中静置培养。次日更换培养基，以去除残留的 DMSO 和死亡细胞，之后继续培养。若细胞密度较高，应及时传代。随后收集处于对数生长期的细胞，进行消化、离心和重悬。将重悬后的细胞以 70%–80% 的密度接种至 12 孔板中，再将培养板放回 37 °C、95% 湿度、5% CO2 的培养箱中继续培养。
  5. 次日观察细胞状态，根据实验设计给予相应处理，然后将培养板重新放入 37 °C、95% 湿度、5% CO2 的培养箱中继续培养。
  6. 给药 24 小时后，弃去原培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。每孔加入 300 µL 用 HBSS 稀释的 FerroOrange 探针（1 µM），在 37 °C、95% 湿度、5% 二氧化碳条件下孵育 30 分钟。
  7. 然后按 1:100 的比例向细胞板中加入 Hoechst 33342 活细胞染色液（100x），室温避光孵育 5 分钟，以染色细胞核。
  8. 在荧光显微镜下观察染色效果并拍照记录。随后使用 ImageJ 软件计算平均荧光强度，实验重复三次以进行统计分析。

7. 活性氧检测试剂盒

  1. 取对数生长期的细胞，进行消化、离心和重悬，然后以70%-80%的密度将细胞接种于12孔板中。充分混匀细胞后，置于37 °C、95%湿度、5% CO2的培养箱中继续培养。
    注意：消化、离心和重悬步骤请参考步骤4.1。
  2. 次日观察细胞状态，根据实验设计给予相应处理，然后将细胞放回37 °C、95%湿度、5% CO2的培养箱中继续培养。给药24小时后，弃去原培养基，用HBSS洗涤细胞两次。
  3. 加入200 µL高灵敏度DCFH-DA染色工作液，于37 °C、95%湿度、5% CO2的培养箱中孵育30分钟。
  4. 弃去上清液，用HBSS洗涤两次，再加入2 µL Hoechst 33342活细胞染色液（100倍稀释）染色5分钟，随后在荧光显微镜下观察。重复实验三次，并进行统计分析。

8. 通过透射电子显微镜观察细胞的线粒体形态

  1. 弃去培养良好细胞的培养基，加入1 mL 2.5%室温戊二醛固定液，在室温下避光固定细胞约5分钟。使用细胞刮刀沿单一方向轻轻将细胞刮下。
  2. 将细胞悬液转移至离心管中，使用低速水平转子离心机在25 °C、600 × g 条件下离心3分钟。
  3. 弃去固定液的上清液后，加入新鲜的电镜固定液（12孔板每孔加1 mL），在室温避光条件下固定30分钟，随后转移至4 °C保存。
  4. 脱水浸入：将样品插入包埋板中，并置于37 °C烘箱中过夜。
  5. 在60 °C烘箱中对包埋介质进行聚合，持续48秒。使用超薄切片机切割60–80 nm的超薄切片。
  6. 用2%醋酸铀饱和醇溶液染色15分钟，再用柠檬酸铅染色15分钟。染色后的切片在室温下过夜干燥。在透射电子显微镜下观察并拍照。

9. 蛋白质印迹法

  1. 提取细胞总蛋白
    1. 将细胞处理并接种至6 cm培养皿中，直至细胞密度达到70%。
      注意：细胞复苏与接种操作请参见步骤3.3。
    2. 在培养皿中加入3 mL OA（5 µM），4小时后加入CA（4 µM）。
    3. 提前准备一盒冰、预冷的PBS、细胞刮刀、已配制的裂解液，以及若干标记好的EP管。
    4. 药物处理后，移除细胞培养液，用预冷的PBS洗涤细胞两次。操作全程置于冰上进行，并使用真空离心机吸除残留PBS。
    5. 标记每个培养皿，然后加入300 µL裂解液，冰上静置5分钟，并持续轻柔振荡，以防止裂解不完全或样品冻结。
    6. 使用预冷的细胞刮刀刮下贴壁细胞，每次刮取后将300 µL收集至EP管中。每次刮取均使用新的细胞刮刀，不可重复使用。
    7. 手持EP管在涡旋振荡器上充分混匀，随后继续置于冰上孵育25分钟。此时提前开启4 °C高速角转子离心机，因离心机预冷需要一定时间。
    8. 计时结束后，再次涡旋混匀，然后在4 °C离心机中以4500 x g高速角转子离心15分钟。
    9. 开启干浴加热器，并将温度设定为100 °C。
    10. 取出BCA蛋白定量试剂盒，将样品与试剂加入96孔板中，充分混匀后，在37 °C、95%湿度、5% CO2的培养箱中反应30分钟。使用多功能酶标仪测定提取的蛋白含量，然后根据结果用剩余裂解液调整，确保各样品浓度一致。
    11. 最后，根据各上清液含量，加入1/5体积的6×上样缓冲液以制备蛋白上样体系。小心吸取150 µL上清液至新的EP管中，加入30 µL 6×上样缓冲液并充分混匀（通常按1:5比例）。将混合物置于冰上保存。
    12. 随后在加热器上100 °C加热6分钟，注意压紧EP管盖以防弹开。加热后立即置于冰浴中冷却。
  2. 制备10%浓度的蛋白凝胶。
    1. 用纯水冲洗胶板，自然晾干，擦去多余水分，尽量避免水渍和灰尘。
    2. 取出制胶架，将两块玻璃板短板朝前、长板朝后放置，底部对齐，确保玻璃板之间的缝隙与制胶架底部的密封条紧密贴合，防止漏液，然后牢固夹紧，准备灌胶。
    3. 按下述配方配制下层胶：6 mL纯水、3.75 mL 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）、0.15 mL 10% SDS、5 mL 30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（Acry/bis）、75 µL 10%过硫酸铵（APS）、7.5 µL TEMED。
    4. 轻轻混匀避免产生气泡，迅速且均匀地注入两块玻璃板之间，预留上层胶空间。随后用1 mL异丙醇压平液面，静置约30分钟。
    5. 用纯水冲洗制胶用的梳子，晾干备用。当下层胶完全凝固后，倒出异丙醇，用纯水小心冲洗2–3次，吸去液体，并将胶板倒置以排尽残留液体。
    6. 按下述配方配制上层浓缩胶：6 mL纯水、2.5 mL 0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）、0.1 mL 10% SDS、1.34 mL 30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（Acry/bis）、50 µL 10%过硫酸铵（APS）、10 µL TEMED。
    7. 填充上层胶后，小心插入15孔、1.5 mm厚的梳子。1–2分钟后补充胶液填补缝隙，注意尽量减少气泡产生。使用完全聚合的凝胶。
  3. 蛋白凝胶电泳
    1. 预先配制电泳缓冲液（Running Buffer）和转膜缓冲液（Transfer Buffer），并将转膜缓冲液置于4 °C冰箱中预冷。
    2. 用超纯水冲洗蛋白胶，取出洁净的电泳槽，将蛋白胶的两块短板相对、向内夹紧，倒入电泳缓冲液，检查是否漏液。
    3. 小心拔出梳子，每孔上样10 µL，共4个样本组。每块胶上3个样本组，每组之间间隔4 µL蛋白Marker，共15孔。
    4. 上样完成后，将剩余电泳缓冲液全部倒入电泳槽，盖上盖子，设定电压为140 V，恒压电泳20分钟。
    5. 当蛋白条带在浓缩胶中进入分离胶后，将电压调整为120 V，继续恒压电泳。此过程中将NC膜浸泡于转膜缓冲液中。当溴酚蓝指示样本迁移至胶底部边缘时停止电泳，准备进行转膜。
    6. 取一泡沫盒，装入半盒冰，取出转膜夹、预冷的转膜缓冲液和已浸泡的NC膜。将一半转膜缓冲液倒入平底方形容器中。
    7. 取出蛋白胶，用超纯水充分冲洗，将黑色面朝下、透明面朝上放置。中间依次放置一层海绵、一层滤纸、蛋白胶、NC膜，再覆盖一层滤纸和海绵。
    8. 压平以去除气泡后，夹紧转膜夹，放入转膜槽中。待两块蛋白胶均完全插入后，将全部转膜缓冲液倒入转膜槽，加入两袋冰袋降温，并盖上盖子。
    9. 用冰包围转膜夹，以120 V恒压转膜90分钟。转膜过程产热显著，需冰浴降温。
    10. 取出NC膜，浸入20 mL Ponceau S染色液中染色，用铅笔标记蛋白Marker大小，并根据待检测目标蛋白的大小用铅笔裁剪膜。
    11. 回收Ponceau S染色液。用PBS洗去染色液，将NC膜加入20 mL封闭液中，在摇床上室温低速封闭1–2小时。
    12. 弃去封闭液，在脱色摇床上用PBS快速漂洗膜两次，彻底去除封闭液。然后根据各抗体在Western Blot中的使用比例，在抗体孵育盒中加入相应一抗，4 °C孵育过夜。
    13. 分别回收一抗并保存于-20 °C。在脱色摇床上用TBST缓冲液快速洗涤膜4次，每次5分钟，彻底去除一抗。然后加入含二抗的封闭液4 mL，在慢速摇床上室温孵育1小时。
    14. 用TBST缓冲液洗涤二抗4次，每次5分钟，然后更换为PBS缓冲液，充分润湿NC膜。
    15. 根据ECL化学发光试剂说明书配制发光液，滴加至膜表面，孵育1–2分钟后使用凝胶成像系统进行显影。
    16. 在Image J成像系统中处理原始数据，然后导入Photoshop软件进行图像制作。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

网络药理学与分子对接
CA 潜在靶点的识别：在对 CA 药理活性的综合研究中，通过系统梳理相关文献，精心筛选出 60 个潜在靶点。为进一步拓展分析范围，通过 TCMSP 数据库鉴定出另外 12 个与 CA 相关的潜在靶点。为提高准确性和全面性，采用 SwissTargetPrediction 平台的高级预测功能，进一步获得 1 个潜在靶点。在整合所有数据来源并进行严格去重后，最终确定了 60 个唯一的 CA 潜在靶点，为后续研究奠定了基础（表 1）。

疾病潜在靶点的鉴定：从 GeneCards 和 TTD 数据库中检索到与“NP”相关的潜在靶点，分别获得 1516 个和 13 个与 NP 相关的靶点。经过整合并去除重复项后，共鉴定出 1516 个独特的 NP 潜在靶点。此外，通过 GeneCards 搜索“ferroptosis”（铁死亡），鉴定出 3317 个“相关性评分”≥ 中位数阈值的潜在靶点。

“CA-NP-铁死亡”交集靶点的鉴定：在“CA”、...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

铁死亡是一种新近发现的细胞死亡方式，其特征是细胞内铁离子过度积累和脂质过氧化。形态学上，铁死亡表现为线粒体皱缩、嵴结构减少或消失以及膜密度增加，而细胞膜和细胞核形态不受影响26。从机制上看，铁死亡由谷胱甘肽（GSH）耗竭和GPX4活性受损所驱动，导致无法通过GPX4催化的谷胱甘肽还原酶反应代谢脂质过氧化物。via 亚铁离子可催化脂质氧化，产生活性氧（ROS），而铁依赖性诱导剂则通过多种途径靶向GPX4，导致ROS在细胞内积聚。由于细胞内抗氧化系统能力有限，ROS过载会损伤细胞结构，最终引发细胞死亡2，从而触发铁死亡27。越来越多的证据表明，铁死亡与神经系统疾病之间存在密切关联。Millie 等人报道，GSH可防止铂类药物在脊髓背根神经节中的蓄积，发挥神经保护作用，在缓解外周神经病变中具有关键作用28。因此，激活SLC7A11-GSH-GPX4轴以减少ROS积聚并抑制铁死亡，可能有助于防止铂类药物在背根神经节中的蓄积，减轻神经损伤。...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

不存在需要披露的经济利益冲突

致谢

我们衷心感谢医院及其各部门提供的优越条件，使我们得以取得这些成果。同时，我们也向多年来实验室众多成员的不懈努力和宝贵贡献表示诚挚谢意。每一位参与者的辛勤工作都是我们成功不可或缺的一部分，未来我们将继续携手并进，推动医学领域的进步。本研究得到中国国家自然科学基金（82104838）、中国促进基金会启明星计划（XH-D001）、辽宁省重点研发计划项目（2024JH2/102500062）和辽宁省自然科学基金（2025-MSLH-490）的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 甘氨酸Biofroxx1275KG001
 Tris碱Biofrooxx1115KG001
0.5  M  Tris-HCl 缓冲液（pH  6.8)伯乐（Bio-Rad）1610799
1 M Tris-HCl (pH 7.5)BeyotimeST775
1.5  M  Tris-HCl 缓冲液（pH  8.8)伯乐（Biorad）1610798
APSBeyotimeST005
基础电泳电源BIO-RAD PowerPac Basic
BCA 蛋白定量试剂盒BeyotimeP0012
β-肌动蛋白重组抗体Huabio81115-1-RR
二氧化碳培养箱赛默飞世尔科技150L
CCK-8 检测试剂盒ApexbioK1018
细胞活性与细胞毒性检测试剂盒BeyotimeC2015M
肉桂醛（CA）MacklinC805134纯度 98%
脱色摇床Kylin-BellTS-100
DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）基础培养基L110KJ
DMSOSigmaD2650
背根神经节（DRG）Fuheng BioFH165序列号：20211227-1
DRG完全培养基Fuheng BioFH-DRG
ECL化学发光溶液Thermo34580
ErbB-1Proteintech06-8471:2000
胎儿  牛  血清MacklinFO193
亚铁离子检测试剂 - FerroOrangeDojindoF374
FTH1细胞信号技术4393S1:1000
凝胶成像系统BIO-RAD ChemiDoc Touch
Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）SolarbioH1025
高速冷冻离心机Eppendorf5804R
Hoechst 33342 活细胞染色液BeyotimeC1028
免疫组织化学试剂盒BiosharpBS-24-PB
倒置荧光显微镜系统LeicaLeica Dmi 8
JAK2 重组兔单克隆抗体 [SY0245]HuabioET1607-351:2000
实验室倒置相差显微镜LeicaLeica Dmi 1
低速离心机Eppendorf5804
MDA 内容检测试剂盒SangonD799762
酶标仪日出 TECAN
多功能微孔板读板仪BMGLABTECH PHERAstar FS
NF-κB p65 多克隆抗体Proteintech10745-1-AP1:1000
多聚甲醛MacklinP804536
丽春红染色液BeyotimeP0022
蛋白 Marker赛默飞世尔科技26617
P-STAT3（Ser727）细胞信号技术公司9134S1:1000
P-STAT3（Tyr705）细胞信号技术公司9145S1:2000
重组抗谷胱甘肽过氧化物酶4抗体[EPNCIR144]abcamab1250661:1000
重组抗-XCT 抗体 [EPR27115-64]abcamab3076011:1000
ROS检测试剂盒DojindoR252
SDS-PAGE蛋白质上样缓冲液（6X）BeyotimeP0289
脱脂奶粉BiosharpBS102-500g
十二烷基硫酸钠 SDSBiofrooxx3250GR500
STAT3 (F-2)Santa CruzSc-80191:200
TEMEDSolarbio   T8090  
TFRCInvitrogen13-68000.5 µg/mL
Tween 80SelleckS6702
超净工作台高密度脂蛋白DL-CJ-2NDI
直立显微镜OlympusCX 31
垂直电泳BIO-RAD Mini Protean Tetra
湿转印槽BIO-RAD 小型转印印迹系统
α微管蛋白α微管蛋白ER130905
GraphPad Prism统计分析
ImageJ 软件获取蛋白印迹的灰度值

参考文献

  1. Dolma, S., Lessnick, S. L., Hahn, W. C., Stockwell, B. R. Identification of genotype-selective antitumor agents using synthetic lethal chemical screening in engineered human tumor cells. Cancer Cell. 3 (3), 285-296 (2003).
  2. Ye, L. F., et al. Radiation-induced lipid peroxidation triggers ferroptosis and synergizes with ferroptosis inducers. ACS Chem Biol. 15 (2), 469-484 (2020).
  3. Huang, L., Bian, M., Zhang, J., Jiang, L. Iron metabolism and ferroptosis in peripheral nerve injury. Oxid Med Cell Longev. 2022, 5918218(2022).
  4. Hao, D., et al. Supercritical fluid extract of Angelica sinensis promotes the anti-colorectal cancer effect of oxaliplatin. Front Pharmacol. 13, 1007623(2022).
  5. Binder, A., et al. Pain in oxaliplatin-induced neuropathy: sensitisation in the peripheral and central nociceptive system. Eur J Cancer. 43 (18), 2658-2663 (2007).
  6. Finnerup, N. B., et al. Pharmacotherapy for neuropathic pain in adults: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 14 (2), 162-173 (2015).
  7. Dorri, M., Hashemitabar, S., Hosseinzadeh, H. Cinnamon (Cinnamomum zeylanicum) as an antidote or a protective agent against natural or chemical toxicities: a review. Drug Chem Toxicol. 41 (3), 338-351 (2018).
  8. Hajimonfarednejad, M., et al. Cinnamon: a systematic review of adverse events. Clin Nutr. 38 (2), 594-602 (2019).
  9. Zaio, Y. P., et al. Cinnamaldehyde and related phenylpropanoids, natural repellents, and insecticides against Sitophilus zeamais (Motsch.): a chemical structure-bioactivity relationship. J Sci Food Agric. 98 (15), 5822-5831 (2018).
  10. Thirapanmethee, K., et al. Cinnamaldehyde: a plant-derived antimicrobial for overcoming multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection. Eur J Integr Med. 48, 101376(2021).
  11. Bi, Z., et al. Improvement of mould resistance of wood with cinnamaldehyde chitosan emulsion. Wood Sci Technol. 56 (1), 187-204 (2022).
  12. Qureshi, K. A., et al. Cinnamaldehyde-based self-nanoemulsion (CA-SNEDDS) accelerates wound healing and exerts antimicrobial, antioxidant, and anti-inflammatory effects in rats' skin burn model. Molecules. 27 (16), 5225(2022).
  13. Safaei, F., Tamaddonfard, E., Nafisi, S., Imani, M. Effects of intraperitoneal and intracerebroventricular injection of cinnamaldehyde and yohimbine on blood glucose and serum insulin concentrations in ketamine-xylazine-induced acute hyperglycemia. Vet Res Forum. 12 (2), 149-156 (2021).
  14. Al Tbakhi, B., et al. Cinnamaldehyde-cucurbituril complex: investigation of loading efficiency and its role in enhancing cinnamaldehyde in vitro anti-tumor activity. RSC Adv. 12 (12), 7540-7549 (2022).
  15. Zhu, R., et al. Cinnamaldehyde in diabetes: a review of pharmacology, pharmacokinetics and safety. Pharmacol Res. 122, 78-89 (2017).
  16. Yang, D., et al. Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of cinnamaldehyde on protecting high glucose-induced damage in cultured dorsal root ganglion neurons of rats. Chin J Integr Med. 22 (1), 19-27 (2016).
  17. Malemud, C. J. Negative regulators of JAK/STAT signaling in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Int J Mol Sci. 18 (3), 484(2017).
  18. Zhang, Q., et al. Activation of Nrf2/HO-1 signaling: an important molecular mechanism of herbal medicine in the treatment of atherosclerosis via the protection of vascular endothelial cells from oxidative stress. J Adv Res. 34, 43-63 (2021).
  19. Bagheri-Mohammadi, S., Askari, S., Alani, B., Moosavi, M., Ghasemi, R. Cinnamaldehyde regulates insulin and caspase-3 signaling pathways in the sporadic Alzheimer's disease model: involvement of hippocampal function via IRS-1, Akt, and GSK-3β phosphorylation. J Mol Neurosci. 72 (11), 2273-2291 (2022).
  20. Fu, Y., et al. Trans-cinnamaldehyde inhibits microglial activation and improves neuronal survival against neuroinflammation in BV2 microglial cells with lipopolysaccharide stimulation. Evid Based Complement Alternat Med. 2017, 4730878(2017).
  21. Guo, B., et al. Targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway with natural plants and phytochemical ingredients: a novel therapeutic method for combatting cardiovascular diseases. Biomed Pharmacother. 172, 116313(2024).
  22. Gao, Y., et al. Modified Erchen decoction ameliorates cognitive dysfunction in vascular dementia rats via inhibiting JAK2/STAT3 and JNK/BAX signaling pathways. Phytomedicine. 114, 154797(2023).
  23. Hu, Q. P., et al. Genistein protects epilepsy-induced brain injury through regulating the JAK2/STAT3 and KEAP1/NRF2 signaling pathways in developing rats. Eur J Pharmacol. 912. 912, 174620(2021).
  24. Kang, L., Tian, Y., Xu, S., Chen, H. Oxaliplatin-induced peripheral neuropathy: clinical features, mechanisms, prevention and treatment. J Neurol. 268 (9), 3269-3282 (2021).
  25. Brayton, C. F. Dimethyl sulfoxide (DMSO): a review. Cornell Vet. 76 (1), 61-90 (1986).
  26. Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-RAS-harboring cancer cells. Chem Biol. 15 (3), 234-245 (2008).
  27. Xiao, Z., La Fontaine, S., Bush, A. I., Wedd, A. G. Molecular mechanisms of glutaredoxin enzymes: versatile hubs for thiol-disulfide exchange between protein thiols and glutathione. J Mol Biol. 431 (2), 158-177 (2019).
  28. Georgiadis, M. M., et al. Small-molecule activation of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 reduces DNA damage induced by cisplatin in cultured sensory neurons. DNA Repair (Amst). 41, 32-41 (2016).
  29. Wei, G., et al. Platinum accumulation in oxaliplatin-induced peripheral neuropathy. J Peripher Nerv Syst. 26 (1), 35-42 (2021).
  30. Maung, K., Chu, E., Rothenberg, M. Oxaliplatin combinations as first-line therapy in advanced colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer. 2 (2), 78-80 (2002).
  31. Egashira, N., et al. Mexiletine reverses oxaliplatin-induced neuropathic pain in rats. J Pharmacol Sci. 112 (4), 473-476 (2010).
  32. Lainez, S., Tsantoulas, C., Biel, M., McNaughton, P. A. HCN3 ion channels: roles in sensory neuronal excitability and pain. J Physiol. 597 (17), 4661-4675 (2019).
  33. Siau, C., Bennett, G. J. Dysregulation of cellular calcium homeostasis in chemotherapy-evoked painful peripheral neuropathy. Anesth Analg. 102 (5), 1485-1490 (2006).
  34. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neurosci Lett. 458 (2), 93-95 (2009).
  35. Carozzi, V. A., Canta, A., Chiorazzi, A. Chemotherapy-induced peripheral neuropathy: what do we know about mechanisms. Neurosci Lett. 596, 90-107 (2015).
  36. Di Cesare Mannelli, L., et al. Glial role in oxaliplatin-induced neuropathic pain. Exp Neurol. 261, 22-33 (2014).
  37. Ta, L. E., Espeset, L., Podratz, J., Windebank, A. J. Neurotoxicity of oxaliplatin and cisplatin for dorsal root ganglion neurons correlates with platinum-DNA binding. Neurotoxicology. 27 (6), 992-1002 (2006).
  38. Bobylev, I., Joshi, A. R., Barham, M., Neiss, W. F., Lehmann, H. C. Depletion of mitofusin-2 causes mitochondrial damage in cisplatin-induced neuropathy. Mol Neurobiol. 55 (2), 1227-1235 (2018).
  39. Nassini, R., et al. Oxaliplatin elicits mechanical and cold allodynia in rodents via TRPA1 receptor stimulation. Pain. 152 (7), 1621-1631 (2011).
  40. Lee, J. H., Kim, W. The role of satellite glial cells, astrocytes, and microglia in oxaliplatin-induced neuropathic pain. Biomedicines. 8 (9), 324(2020).
  41. Makker, P. G., et al. Characterisation of immune and neuroinflammatory changes associated with chemotherapy-induced peripheral neuropathy. PLoS One. 12 (1), e0170814(2017).
  42. Holmes, J., et al. Comparative neurotoxicity of oxaliplatin, cisplatin, and ormaplatin in a Wistar rat model. Toxicol Sci. 46 (2), 342-351 (1998).
  43. Podratz, J. L., et al. Cisplatin-induced mitochondrial DNA damage in dorsal root ganglion neurons. Neurobiol Dis. 41 (3), 661-668 (2011).
  44. Trecarichi, A., et al. Preclinical evidence for mitochondrial DNA as a potential blood biomarker for chemotherapy-induced peripheral neuropathy. PLoS One. 17 (1), e0262544(2022).
  45. Mao, Y. F., et al. Edaravone, a free radical scavenger, is effective on neuropathic pain in rats. Brain Res. 1248, 68-75 (2009).
  46. Kim, H. K., Zhang, Y. P., Gwak, Y. S., Abdi, S. Phenyl N-tert-butylnitrone, a free radical scavenger, reduces mechanical allodynia in chemotherapy-induced neuropathic pain in rats. Anesthesiology. 112 (2), 432-439 (2010).
  47. Han, R., Li, X., Gao, X., Lv, G. C. Cinnamaldehyde: pharmacokinetics, anticancer properties and therapeutic potential. Mol Med Rep. 30 (3), 163(2024).
  48. Liao, J. C., et al. Anti-inflammatory activities of Cinnamomum cassia constituents in vitro and in vivo. Evid Based Complement Alternat Med. 2012, 429320(2012).
  49. Liu, P., et al. Cinnamaldehyde suppresses NLRP3-derived IL-1β via activating succinate/HIF-1 in rheumatoid arthritis rats. Int Immunopharmacol. 84, 106570(2020).
  50. Li, X., Wang, Y. Cinnamaldehyde attenuates the progression of rheumatoid arthritis through down-regulation of PI3K/AKT signaling pathway. Inflammation. 43 (5), 1729-1741 (2020).
  51. Dai, X. Y., et al. Targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway for chronic pain. Aging Dis. 15 (1), 186-200 (2024).
  52. Reddy, A. M., et al. Cinnamaldehyde and 2-methoxycinnamaldehyde as NF-κB inhibitors from Cinnamomum cassia. Planta Med. 70 (9), 823-827 (2004).
  53. Youn, H. S., et al. Cinnamaldehyde suppresses toll-like receptor 4 activation mediated through the inhibition of receptor oligomerization. Biochem Pharmacol. 75 (2), 494-502 (2008).
  54. Chen, X., Kang, R., Kroemer, G., Tang, D. Ferroptosis in infection, inflammation, and immunity. J Exp Med. 218 (6), e20210518(2021).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

肉桂醛神经保护奥沙利铂神经毒性背根神经节铁死亡通路JAK2 STAT3信号通路GPX4表达脂质过氧化检测活性氧蛋白质表达分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。