本研究整合了双样本孟德尔随机化分析、基于液相色谱-质谱法（LC-MS）的代谢组学验证，以及利用系统性红斑狼疮（SLE）患者来源的淋巴细胞进行的功能实验，通过代谢物刺激后评估细胞凋亡和细胞因子反应，旨在鉴定与脂质相关的生物标志物，并探讨其在SLE中的免疫调节作用。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本研究整合了双样本孟德尔随机化分析、基于液相色谱-质谱法（LC-MS）的代谢组学验证，以及利用系统性红斑狼疮（SLE）患者来源的淋巴细胞进行的功能实验，通过代谢物刺激后评估细胞凋亡和细胞因子反应，旨在鉴定与脂质相关的生物标志物，并探讨其在SLE中的免疫调节作用。
血清代谢物成分的改变与系统性红斑狼疮（SLE）的关联日益受到关注，但这些代谢物对免疫细胞功能的直接影响仍不明确。本研究旨在鉴定与SLE相关的外周血代谢物，并评估其对SLE患者来源淋巴细胞凋亡及细胞因子分泌的影响。
我们采用双样本孟德尔随机化（MR）分析，研究了565种血清代谢物与系统性红斑狼疮（SLE）之间的关联，主要分析方法为逆方差加权模型。显著性结果通过基于液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的既往发表的非靶向代谢组学数据进行交叉验证。在功能实验中，分离自SLE患者的淋巴细胞经目标代谢物刺激后，评估其凋亡情况及细胞因子分泌水平。
MR 分析鉴定出 28 种与系统性红斑狼疮（SLE）显著相关的代谢物。其中，胆固醇（OR = 1.462，95% CI：1.100–1.940，P = 0.008）和硬脂酰胺（stearamide，OR = 0.125，95% CI：0.020–0.660，P = 0.014）通过液相色谱-质谱法（LC-MS）得到验证，并发现其在 SLE 患者中水平升高。受试者工作特征曲线分析显示其具有良好的诊断效能（胆固醇的 AUC = 0.999；硬脂酰胺的 AUC = 1.000）。功能上，这两种代谢物均可诱导 SLE 淋巴细胞凋亡增加，并促进 TNF-α、IFN-γ 和 TGF-β1 的分泌升高。
综上所述，我们整合了遗传关联分析、代谢物谱分析和功能实验的方法，揭示了胆固醇可能在系统性红斑狼疮（SLE）的免疫失调中发挥作用。尽管在孟德尔随机化分析中，十八酰胺与SLE风险呈负相关，但其体外实验效应与胆固醇相似，提示其作用可能具有复杂性并依赖于具体环境。这些发现强调了脂质代谢在SLE中的重要性，并支持进一步深入研究其免疫学影响的机制及临床意义。
系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是发病机制复杂、临床表现多样，全球有数百万人受其影响1。SLE具有高度异质性——不同个体的症状差异显著，且随时间推移不断演变——这给疾病的诊断、疾病活动度的监测以及个体化治疗方案的制定带来了重大挑战2,3。尽管2019年欧洲抗风湿病联盟与美国风湿病学会（EULAR/ACR）制定的SLE分类标准提高了诊断准确性4，但这些标准未能涵盖所有疾病表现，且常常依赖肾活检等侵入性操作，而这对患者而言可能不切实际并带来负担。
近年来，关于系统性红斑狼疮（SLE）中代谢物作为生物标志物的研究日益增多，显示出其在疾病早期诊断、分型及预后评估方面的巨大潜力5,6,7。然而，基于代谢物的SLE研究在转化应用方面仍面临若干关键挑战。首先，样本量较小是一个主要限制因素8。迄今为止，大多数代谢组学研究纳入的受试者数量相对较少，难以充分反映SLE完整的临床异质性。鉴于SLE的临床表现可从轻度皮肤受累到严重的肾脏或神经系统损害不等，样本多样性不足的研究可能缺乏可重复性和广泛适用性9。其次，机制层面的深入探索仍然缺乏。尽管既往研究已揭示特定代谢物与疾病活动度、器官损伤或特定临床特征之间的关联，但大多数发现仍停留在描述性层面10。这些研究主要集中于代谢物水平的定量差异及其与临床指标的统计学相关性，而未深入探讨代谢物在SLE免疫病理过程中的因果作用。由于免疫失调——包括淋巴细胞异常凋亡和细胞因子分泌失衡——是SLE发病机制的核心，因此阐明代谢物如何影响这些过程至关重要11。目前，极少有研究直接探讨特定代谢物在SLE背景下对免疫细胞凋亡或细胞因子产生的调控作用。
本研究旨在通过整合孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）与液相色谱-质谱非靶向代谢组学分析，鉴定与系统性红斑狼疮（SLE）相关的代谢生物标志物，并利用靶向细胞实验阐明这些候选代谢物在调控淋巴细胞凋亡和炎症性细胞因子产生中的功能作用，如图1所示。
这是首个整合MR、代谢组学验证和 体外 功能实验用于研究脂质代谢物——特别是胆固醇和硬脂酰胺——在系统性红斑狼疮（SLE）发病机制中的因果关系及作用机制。通过整合遗传学、代谢组学和实验数据，本研究系统地揭示了特定脂质改变如何影响SLE中的免疫失调。这种整合性方法为发现自身免疫性疾病中潜在的代谢生物标志物和治疗靶点提供了新的框架12.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究依据2019年EULAR/ACR分类标准进行。本研究已获得深圳市人民医院伦理委员会批准（伦理审批编号 LL-KY-2019514）。
孟德尔随机化（MR）分析
GWAS 数据来源
系统性红斑狼疮（SLE）与 565 种代谢物的遗传关联数据均来自 OpenGWAS 数据库（https://gwas.mrcieu.ac.uk/）。疾病 GWAS 数据集汇总于 表 1，而代谢物 GWAS 数据的来源及样本量详见表 2。这些数据集为孟德尔随机化（MR）分析提供了基础，用于探索代谢物与 SLE 之间的因果关系13,14,15,16。
工具变量的选择
选择与血液代谢物和系统性红斑狼疮（SLE）相关的遗传变异作为孟德尔随机化（MR）分析的工具变量（IVs）。IVs 的选择基于 MR 的三个核心假设：相关性、独立性和排他性限制17。具体而言，选择在全基因组显著性水平（P < 5 × 10-8 ）上与代谢物显著相关的单核苷酸多态性（SNPs）18。为确保 IVs 之间的独立性，以欧洲人群作为参考面板，采用连锁不平衡（LD）剪枝方法，设定 r2 < 0.001 且物理距离为 10,000 kb 的阈值进行筛选19。该过程最大限度地减少了冗余，确保每个工具变量为 MR 分析提供独立的信息。
统计分析
MR 分析的主要统计方法为逆方差加权法（inverse-variance weighted, IVW），该方法通过整合多个工具变量（IV）的效应来估计代谢物对系统性红斑狼疮（SLE）的因果效应20。为校正潜在的多效性，采用 MR-Egger 回归进行敏感性分析21。每个工具变量的强度通过 F 统计量进行评估，仅保留 F > 10 的 SNP，以确保工具变量具有足够强度22。排除 F 统计量较低的 SNP，以避免弱工具变量偏倚。最终的 MR 分析仅在未检测到显著异质性或多效性时进行，以确保因果效应估计的可靠性23。
敏感性分析
采用多种敏感性分析方法以评估孟德尔随机化（MR）结果的稳健性。使用 Cochran's Q 检验评估工具变量（IVs）间的异质性，通过 MR-Egger 回归分析评估多效性24。此外，进行留一法分析，以确定任何单个 SNP 是否对 MR 结果产生不成比例的影响25。绘制森林图以直观展示各工具变量的个体效应及合并效应。这些分析共同确保了 MR 结果未受到多效性效应或异常值 SNP 的偏倚影响。
代谢组学数据来源
本研究所使用的代谢组学数据来源于我们研究团队先前已发表的一项研究10。在该研究中，我们对121名系统性红斑狼疮（SLE）患者和106名健康个体的血清样本进行了代谢组学分析。采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-MS）进行非靶向代谢组学谱型分析。数据通过标准代谢组学流程进行处理，包括峰检测、对齐和归一化，以鉴定与SLE显著相关的代谢物。随后，将这些代谢物与孟德尔随机化（MR）分析结果进行交叉比对，以识别重叠的代谢物。更多详细信息可参见先前的发表文献10。在代谢组学分析中显著相关的代谢物以及在MR分析中具有显著因果关联的代谢物，均通过MetaboAnalyst平台映射至其相应的HMDB编号。通过取两组HMDB编号的交集，确定共同的代谢物。
细胞因子检测与凋亡实验
共纳入3名系统性红斑狼疮（SLE）患者（表3），均符合2019年欧洲抗风湿病联盟/美国风湿病学会（EULAR/ACR）分类标准。
外周血样本采集与淋巴细胞分离
采集参与者外周血样本（3-6 mL），使用含肝素钠抗凝剂的真空采血管。通过Ficoll-Paque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）（400-800 × g 20–30 分钟）。分离的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS，HyClone）通过低速离心（250 × g 10分钟）后重悬于添加了10%胎牛血清的完全RPMI-1640培养基中。细胞密度调整至1 × 106 细胞/mL，经自动细胞计数仪验证。将细胞悬液接种至培养板中，在37°C、5% CO₂条件下预培养2小时2 在培养箱中孵育以促进细胞贴壁。预孵育后，小心收集培养上清中未贴壁的细胞，并进行淋巴细胞分离。将收集的悬液轻柔地铺加在Ficoll-Paque分离液上，以400 × g离心20分钟，离心过程中不启用刹车。仔细吸取血浆与Ficoll界面处的单个核细胞层，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，再重悬于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中。使用自动细胞计数仪检测细胞活力与浓度，所得淋巴细胞随后用于后续实验。
细胞处理与培养
将细胞分为五组进行处理：对照组：给予等体积的DMSO处理。胆固醇处理组：用浓度为1.5 mmol/L的胆固醇处理。本研究选用1.5 mmol/L的游离胆固醇浓度，以模拟超出生理水平的脂质富集微环境。健康个体循环中的游离胆固醇浓度通常在0.9–1.3 mmol/L之间。本实验中采用的略高浓度旨在模拟系统性红斑狼疮（SLE）中炎症或代谢紊乱组织可能出现的病理性脂质积聚。硬脂酰胺处理组：分别用5 µmol/L和10 µmol/L浓度的硬脂酰胺处理。所选硬脂酰胺浓度（5 和 10 µmol/L）基于先前的一项报道26，该报道提示5–10 µmol/L范围内的硬脂酰胺水平可能模拟病理状态下升高的脂质积聚。本研究目的在于探讨高浓度脂质暴露对SLE淋巴细胞的促凋亡及免疫调节作用，以模拟炎症或代谢失调状态。胆固醇和硬脂酰胺首先溶于DMSO中配制高浓度储备液，随后用培养基稀释至目标浓度。所有组别中DMSO的终浓度均未超过0.1%（v/v）。加入相应处理剂后，将培养板轻轻振荡以确保分布均匀，并在37 °C、5% CO2 条件下孵育48小时。
细胞凋亡检测
进行细胞凋亡实验时，收集 1 × 106 至 3 × 106 个细胞，用预冷的 PBS 洗涤两次。通过将细胞重悬于 500 µL 预冷的细胞凋亡阳性对照溶液中，冰上孵育 30 分钟，随后再进行一次 PBS 洗涤，制备阳性对照组。实验组按照第 1.7 节所述进行处理，包括对照组、胆固醇（1.5 mmol/L）和硬脂酰胺（10 µmol/L）处理组。处理后，收集 1–10 × 105 个细胞（包括培养上清液中的细胞），重悬于 500 µL 1× 结合缓冲液中（通过将 5× 储存液用双蒸水稀释制备）。每个样本与等量未经处理的活细胞混合，并用预冷的 1× 结合缓冲液调整总体积至 1.5 mL。将细胞悬液均分至三个试管中：一个用于空白对照，两个用于单染补偿（Annexin V-FITC 和 PI）。向每个实验管中加入 5 µL Annexin V-FITC 和 10 µL PI 染色液，涡旋混匀后避光、室温孵育 5 分钟。采用 488 nm 激光激发，通过流式细胞术检测 Annexin V-FITC（发射波长 530 nm）和 PI（发射波长 615 nm）。空白对照管用于设定前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）及荧光通道电压，单染管用于荧光补偿。通过双参数散点图分析细胞凋亡比例27,28。
免疫因子检测
孵育48小时后，将细胞悬液离心（250 × g，5分钟）以收集培养上清液，并于-80 °C保存直至分析。细胞因子定量采用商用的人类核心免疫反应检测试剂盒，按照生产商说明书进行操作，并针对仪器进行了优化。简言之，向微孔板的每个孔中加入25 µL检测缓冲液以及25 µL标准品（浓度范围为2.4至10,000 pg/mL）或待测样本。将微珠混合物涡旋振荡30秒后加入各孔，使总反应体积达到75 µL。将微孔板置于室温下避光振荡孵育2小时（800 rpm）。经过两次自动洗涤（使用1×洗涤缓冲液，250 × g，5分钟）后，向每孔加入25 µL生物素化检测抗体，孵育1小时。随后，每孔加入25 µL链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE），孵育30分钟以放大信号。
使用配备488 nm激发激光器和575/26 nm滤光片用于PE检测的流式细胞仪进行数据采集。每次实验前，均使用校准微球优化光电倍增管电压和光谱补偿。数据采用LEGENDplex软件v8.0进行分析，细胞因子浓度通过五参数逻辑（5PL）曲线拟合确定。各细胞因子的检测限范围为0.68 pg/mL至1.97 pg/mL，实验均设复孔以确保精确性（孔间变异系数<10%）。结果以均值±±标准差表示，组间统计学差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA），并结合Tukey事后检验，通过适当的统计分析软件进行评估。选择48小时的孵育时间是基于细胞因子分泌的动态变化，以全面捕捉免疫应答。每日仪器校准及DMSO浓度控制（≤0.1%）确保了结果的可靠性和可重复性29,30,31。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
系统性红斑狼疮中关键代谢物与临床表现之间的关联
本研究通过对565种代谢物与系统性红斑狼疮（SLE）进行孟德尔随机化分析，发现了显著的因果关联。如图所示 图2共鉴定出28种与系统性红斑狼疮（SLE）显著相关的代谢物，涵盖肽类、氨基酸、能量代谢物、脂质、碳水化合物和脂肪酸等类别。其中，γ-谷氨酰苯丙氨酸和脯氨酰-羟基脯氨酸等肽类，色氨酸甜菜碱和天冬酰胺等氨基酸，以及α-酮戊二酸等能量代谢物与SLE呈负相关。相反，大多数脂质代谢物与SLE呈正相关，包括极大型高密度脂蛋白（HDL）中的游离胆固醇、中密度脂蛋白（IDL）中的总胆固醇、游离胆固醇、极大型HDL中的甘油三酯、HDL颗粒平均直径、IDL中的总脂质以及极大型HDL中的总脂质。此外，其他脂质如棕榈酰肉碱、棕榈油酸（16:1n7）、2-棕榈酰甘油磷脂酰胆碱，以及胆汁酸如熊去氧胆酸和牛磺去氧胆酸也与SLE呈正相关。值得注意的是，硬脂酰胺是唯一与SLE呈负相关的脂质。同时，乳酸和乙酸也被发现与该疾病呈负相关。Cochran's Q检验显示无异质性...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究结果表明，1.5 mmol/L 胆固醇、5 µmol/L 硬脂酰胺和 10 µmol/L 硬脂酰胺在系统性红斑狼疮（SLE）患者淋巴细胞中诱导出相似的凋亡模式和细胞因子分泌特征，尽管其效应强度存在差异。具体而言，1.5 mmol/L 胆固醇和 5 µmol/L 硬脂酰胺均显著增加了 SLE 淋巴细胞的凋亡。此外，1.5 mmol/L 胆固醇联合 5 µmol/L 或 10 µmol/L 硬脂酰胺处理可进一步增强相关免疫因子的分泌。实验结果显示，经 1.5 mmol/L 胆固醇处理的组别中，IFN-γ、TNF-α、TGF-β1、IL-1β 和 IL-4 水平升高；5 µmol/L 硬脂酰胺处理组中，TNF-α 和 TGF-β1 水平升高；而在 10 µmol/L 硬脂酰胺处理组中，TGF-β1、IFN-γ 和 IL-4 水平显著升高。
高胆固醇和硬脂酰胺浓度影响系统性红斑狼疮（SLE）淋巴细胞的潜在机制尚未完全阐明。可能的通路包括胆固醇诱导的细胞膜刚性增加，这会损害膜蛋白功能并破坏细胞内信号传导，最终触发细胞凋亡。硬脂酰胺可能通过其生物活性特性改变细胞代谢或信号通路。此外，SL...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明不存在任何竞争利益。
本研究得到安徽理工大学研究生创新基金项目的资助 & 技术（编号：2024cx2204）、安徽省院士工作站（自身免疫性疾病诊断技术）、安徽理工大学 & 技术，安徽淮南 232001，中国）（安徽省科学技术厅〔2023〕317 号文件），广东省基础与应用基础研究基金（No.2021A1515110250），国家自然科学基金（No.82271824）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒 | Multi Sciences | AP101 | 用于通过流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 胆固醇 | 上海金畔生物科技有限公司 | JP1210051 | 用于外周血单个核细胞（PBMC）的刺激实验（10 g） |
| Transwell 小室插入物 | Corning | CBG10001 | 用于共培养实验中细胞的物理分离 |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter | CytoFLEX | 流式细胞分析 |
| GraphPad Prism 软件 | GraphPad | 统计分析与作图 | |
| LEGENDplex 人源必需免疫反应检测面板 | BioLegend | 740390 | 免疫相关细胞因子的多重检测 |
| 微量移液器套装 | Eppendorf | 多种规格 | 液体操作与体积转移（0.1–10 μL，10–100 μL，100–1000 μL） |
| 外周血淋巴细胞分离液 | 国产厂家 | B1.1420A | 用于外周血单个核细胞（PBMC）的分离（200 mL） |
| RPMI-1640 培养基 | Gibco | C22400500BT | PBMC 培养用培养基 |
| 硬脂酰胺 | 上海金畔生物科技有限公司 | 1267285 | 用于 PBMC 的脂质刺激（100 g） |
| 无菌 24 孔板 | 国产厂家 | BLJ182A | 用于细胞培养 |
| CountStar | 上海睿钰生物科技 | CS200 | 自动细胞计数仪 |
| PBS | Hyclone | 10010023 | 细胞洗涤 |
| Ficoll-Paque | Cytiva | 17-5442-03 | 滑膜细胞分离 |
| LEGENDplex 软件 | BioLegend | 版本 8 | 流式细胞术数据分析 |
| GraphPad Prism 9.0 | GraphPad Software | 版本 9 | 统计分析 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
This corrects the article 10.3791/69038