利用选择性甩鼻忘记REM的方法（SNiFFer）进行选择性REM睡眠剥夺方法

Summary

我们提出了一种针对啮齿动物快速眼动（REM）睡眠选择性剥夺的新方案。

Abstract

睡眠大致分为快速眼动（REM）和非REM阶段，并开发了多种睡眠剥夺技术来研究其功能。传统方法——如机械刺激或在快速眼动睡眠时放下动物——常常导致快速习惯化和意外的压力效应，使解读变得困难。在这里，我们介绍一种新颖、温和且温和的啮齿动物REM睡眠剥夺方法：SNiFFer。啮齿动物对鼻腔刺激极为敏感。在这种方法中，软刷在快速眼动睡眠期间轻轻抚摸动物的鼻子，可靠地触发性唤起。为了在快速眼动睡眠中有选择性地应用该技术，我们采用了基于人工智能的实时脑电图（EEG）睡眠阶段分类系统。干预仅在快速动眼期（REM）期间触发，并纳入了一组被绑定的对照组，无论睡眠状态如何，均接受相同的刺激模式。我们进一步在痕迹恐惧条件反射范式中应用SNiFFer，测试学习后6小时内的REM睡眠剥夺是否干扰记忆巩固。与有对照组相比，SNiFFer治疗动物在总REM阶段和REM持续时间显著减少，表明该方法的特异性和疗效。总之，SNiFFer技术为小鼠的REM睡眠剥夺提供了高度选择性、微创的触觉方法。它能够精确控制实验条件，并为研究快速眼动睡眠在记忆和认知中的作用开辟了新可能——但带有一种令人毛骨悚然的转折。

Introduction

快速眼动（REM）睡眠在记忆巩固等认知过程中起着关键作用 ^1,2。为了研究REM睡眠在大脑的功能意义，REM睡眠剥夺常作为实验方法被采用。目前，主要有四种方法被广泛用于诱导啮齿动物的快速动眼期睡眠剥夺：旋转盘法¹、花盆法³、气泡法⁴和物理^{刺激技术5,6}。虽然旋转盘和花盆法在消除快速眼动睡眠方面非常有效，但它们常常给动物带来大量压力，如水暴露或身体疲^劳7，这会影响行为和生理结果的解读。同样，气泡和传统物理刺激方法倾向于向身体传递宽泛且非特异性的刺激，导致刺激强度的变异和对照组选择有限 ^4,8。

我们进行了涵盖六十多年REM睡眠剥夺研究的综合文献比较，详见 补充文件1 和 补充表1。我们整合了来自主要研究方向的基础历史、机制、神经化学、激素和行为研究，包括Jouvet、Rechtschaffen、Bergmann、Tufik、Andersen和Borbély。 补充表1 按时间顺序组织了关键论文。它追溯了REM睡眠剥夺技术的方法学演变，并总结了其主要的生物学、神经化学、激素、免疫、体温调节和行为发现。由于本稿作为方法论文章而非全面的历史综述，本文作为补充信息被补充。

为解决这些局限性，我们开发了一种新方法，提供高选择性的REM睡眠剥夺。该技术旨在精确控制地选择性剥夺啮齿动物的快速眼动睡眠（REM）。在这种方法中，我们将刺激限制在动物的鼻子——啮齿动物中最敏感的区域^之一。此外，我们采用AI的实时睡眠阶段分类系统，检测并中断具有时间特异性的REM睡眠发作¹⁰。该AI系统参考过去4个时间段内单一通道的脑电信号，并评估当前小鼠的睡眠阶段。这种设置还支持实施绑定控制组，实现时间匹配干预。虽然我们的方案被归类为基于物理刺激的快速眼动睡眠剥夺技术，但与传统方法不同。首先，我们利用人工智能应用实时睡眠阶段分析，实现准确且一致的REM特异性干预。其次，它将刺激区域限制在鼻子顶部，而鼻子顶部是小鼠⁶中最敏感的区域之一，导致刺激持续时间和强度变化最小。最后，我们新设立了一个带对照组，接受相同剂量的刺激以控制混杂因素。该方案提出了一种研究REM睡眠特有功能的方法。

为了评估该方法的实用性，我们应用它来研究REM睡眠在痕迹恐惧记忆巩固中的作用。先前研究报告称，REM睡眠剥夺会损害海马依赖的恐惧记忆巩固，包括延迟的恐惧记忆^11,12。然而，关于REM睡眠剥夺对涉及分布式复杂脑回路的记忆过程的影响，证据存在矛盾（^5,13）。痕迹恐惧记忆巩固需要将足电击（无条件刺激）、听觉线索（条件刺激）及其间的痕迹间隔联系起来——这一过程已知会招募多个脑区，包括海马体、内侧前额叶皮层和杏仁核¹⁴。因此，我们在小鼠进行痕迹恐惧条件反射后立即剥夺了6小时的快速动眼动睡眠（^{REM sleep 15），这一}时间窗口被认为对记忆巩固至关重要。利用该方案，我们评估了REM睡眠剥夺对依赖分布式神经系统协调活动的记忆痕迹巩固的影响。本文提出了一种新颖的方法，描述了详细的实验方案以测试其效应。

Protocol

所有动物实验均由筑波大学机构动物护理与使用委员会批准。本研究使用了雄性和雌性C57BL/6J小鼠（11–13周龄，体重20–35克）。本研究所用材料和仪器的完整列表见 材料表。

1. 脑电极外科植入¹⁷

1. 麻醉与动物准备
   1. 用4%异氟醚与空气混合，3分钟内诱导麻醉。通过无足部撤退反射和肌肉张力，以及呼吸模式稳定，确认了充分的麻醉效果。
   2. 用电动剃须刀刮除背部头部和颈部，从后颈到眼中区域。当小鼠表现出清醒（如胡须移动）时，再次诱导麻醉。
2. 头部固定与颅骨暴露
   1. 将动物固定在立体定位框架中，确保鼻腔和颅骨的对齐。从此直到整个手术结束，麻醉一直通过异氟醚蒸发泵系统持续维持。
   2. 在双眼涂抹眼药膏以防止角膜干燥。用脱毛膏去除剩余的毛发。
   3. 在头皮中线切开，轻轻拉开皮肤，露出从耳后线到眼前线的头骨。用棉签取出黏膜组织。
3. 地标识别与水平化
   1. 识别bregma和lambda;调整立体转动臂，使这些点保持在±0.05毫米以内水平。确认横坐标±距离雷格玛3.0毫米）也是水平的（±0.05毫米）。
4. 钻孔与螺丝安装
   1. 标记以下相对于布雷格玛的坐标。按照这些坐标钻四个导向孔。前后侧/内侧侧：+1.5毫米 / ±1.5毫米，–3.0毫米 / ±1.7毫米。
   2. 在每个孔中植入脑电记录螺丝，并用氰基丙烯酸酯凝胶固定。用一层薄薄的牙科胶水包裹并覆盖裸露的颅骨和头骨。
5. 术后护理
   1. 给药5%葡萄糖溶液0.5毫升和布洛芬（或等效镇痛药）0.13毫升。
   2. 将老鼠放回其固定笼子，一个直径21.9厘米、高31.6厘米的圆柱形Plexiglas笼子，置于一个绝缘舱内（45.7 x 50.8 x 85.4厘米）。该舱室温度维持在23.5±2.0摄氏度，相对湿度为50.0%±10.0%，采用12小时的明暗周期（光明阶段：上午9：00至晚上9：00）。
   3. 将动物放入加热的恢复笼中。在笼子前等老鼠醒来。手术后，动物被安置在单独的饲养中，实验期间未返回群体饲养。

2. 处理与习惯化

1. 实验时间表
   1. 手术后24–48小时内在轻型阶段开始操作。连续四天。
2. 手术程序
   1. 第一天，手边放一只鼠标2分钟，每次两次。将鼠标放在实验者张开的手掌上，手指伸出，掌心朝上。手掌位置略高于前臂，因为老鼠自然会爬到高处。让老鼠自由移动，不受限制;如果老鼠试图爬上前臂，轻轻握住尾巴根部，轻轻将前臂放回掌心。每个间歇时间都超过20分钟。这应该在光相期间进行。
      注意：如果老鼠跳出手或咬伤手，第一天应用布或薄纸覆盖手部。衣物可以重复使用，且应每两周清洗一次。
   2. 第2-4天，手边放一只老鼠2分钟，每次3次。每个间歇和进行的时段与第一天相同。从行为上评估习惯性：未习惯的小鼠通常通过跳跃或强咬来逃脱，而习惯性老鼠则积极探索手掌，逃脱尝试极少，几乎没有强力咬人。
   3. 在最终操作结束时，将鼠标连接到脑电图记录线缆上。
      注意：当垫料过多以妨碍老鼠鼻子时，请手动挑取部分，并在操作过程中或连接时取下。

3. 基线脑电图记录

1. 从术后第5天和第6天开始。每天11：00到17：00连续记录脑电图。如果垫料阻碍了老鼠鼻子的通路，应逐渐移除多余的垫料，以确保鼻腔通达，同时尽量减少对动物后续处理的干扰。

4. 恐惧条件反射^18,19

1. 术后第7天（或第8天）开始，时间为10：00至11：00之间。作为准备，向调节室（30 x 25 x 24厘米）喷洒70%乙醇，该腔体由透明丙烯酸墙体和不锈钢网格地板（直径2.0毫米的杆子间距6.0毫米）组成。
2. 训练方案（总训练1100秒）
   1. 在180秒、400秒、620秒、840秒和1060秒时传递五个听觉提示（20秒上升声，5–20kHz，1.25赫兹，0.8秒时长）。每个声源与脚震（1.0毫安，2秒）配合，分别在218秒、438秒、658秒、878秒和1098秒时发出。

5. 快速眼动睡眠剥夺

1. 快速眼动睡眠剥夺组（RSD组）
   1. 在恐惧条件反射（ZT2-ZT8）之后，通过激活基于人工智能的睡眠阶段分类系统实时监测脑电图，实现对REM睡眠的实时检测。检测到REM睡眠后，用软画笔轻轻挠动物鼻子，直到其重新唤醒，从刺激开始到觉醒的平均潜伏期为0.89±0.063秒（平均扫描显微仪±0.063秒）。
   2. 实验中，唤起被定义为对触觉刺激的行为反应，特别是刺激后胡须的移动。记录每个挠痒的时间戳以便后续分析。
      注意：挠痒动作没有固定方向模式（如来回、向上或圆形），同时保持持续的轻微触觉刺激，仅限于鼻尖顶部。如果鼻子受阻，应直接刺激振动（胡须）区域，通常该区域暴露。如果老鼠背对画笔，可以根据需要旋转笼子，确保能畅通无阻地进入鼻腔区域。使用顶部开放式笼子时，也可以从上方施加刺激，以确保鼻腔或振动器的持续接触。
2. 有对照组（有对照组）
   1. 将每只被绑的老鼠配对到一个REM睡眠不足的对应体。与被绑鼠的REM发作同步，同时对其进行鼻痒，同时匹配起始时间和持续时间。每只老鼠在REM睡眠剥夺实验中都使用同一把专用画笔。每次使用后，用弱酸性水喷刷，然后用纸巾擦拭。使用间隔至少24小时，确保清洁过的画笔完全干燥。

6. 记忆回忆测试

1. 情境回忆测试（测试A）
   1. 睡眠剥夺后24小时（±3小时）开始。将老鼠放回原始调温室（带有70%乙醇气味）。记录5分钟的冻结行为。
2. 声音提示回忆测试（测试B）
   1. 考试A后3小时进行课程。
   2. 情境准备：在情境B（三棱柱（高30厘米））中喷水，由三面墙组成，边长分别为31厘米、24厘米和24厘米。其中两面墙覆盖着白纸，第三面墙由透明丙烯漆制成，背景中可见一个蓝色矩形。该结构采用塑料地板和透明亚克力天花板。
   3. 记录6分钟的冻结行为。发出一个180秒的听觉提示，与180秒训练相同。

7. 数据分析

1. 睡眠阶段评分（图1C-G）¹⁷
   1. 对于每个醒来/非REM/REM，计算总次数、发作次数、平均发作时长和睡眠转换次数，基于人类专家评分数据。每个阶段的标准如下。
      尾流：低幅度，高频（β/γ）
      NREM：高振幅低频（δ）
      REM：低振幅，θ主导
2. 剥夺质量（图1B）
   1. 通过比较每个挠痒刺激的时间戳与人类专家注释的脑电图数据，评估其施加的睡眠阶段。
3. 冻结行为（图1H，J-K）
   1. 使用FreezeFrame4（时效学）来量化恐惧条件反射和回忆测试中的不动（不包括呼吸）。
      1. 启动FreezeFrame 4软件，选择 录制 模式。在文件菜单（左上角）中，指定保存录制文件的目标文件夹。在左侧面板的四个白色输入字段中，输入对应每个鼠标的唯一标识符，确保与屏幕右侧四个文件显示窗口对齐。
      2. 点击界面底部的 “协议 ”面板，定义录音参数，包括总录音时长以及根据实验设计的听觉提示和脚部电击的时间。
      3. 点击屏幕中央的 “参考 ”以获取背景参考图像。把鼠标放进调节室，然后点击 开始 录制。
4. 辨别指数分析（图1L）
   1. 通过以下公式计算辨别指数：
      测试A平均5分钟就冻结——测试B平均前3分钟就冻结/测试A平均5分钟就冻结，B测试平均前3分钟就冻结。
5. 冲击反应性指数分析（图1I）
   1. 使用手追踪测量动物2在恐惧条件训练中电击开始点前后的二维运动。通过以下公式计算冲击反应性指数：
      震动时的运动——运动前震动/震动中的运动 + 运动前震动

Results

脑电电极的外科植入
小鼠在手术中应完全麻醉。如果出现麻醉失败的迹象，如挣扎，应将其从方案中移除。同样，如果出血持续超过10秒，可能会对小鼠大脑造成严重损伤，建议停止实验。手术后，大多数小鼠通常在1小时内醒来。他们的步态和眼球运动应恢复正常，类似于手术前的状况。

操控与习惯
如果小鼠在操作过程中表现出癫痫或疼痛的迹象，应将其从实验中移除。在习惯化过程中，老鼠通常在被抱着时变得不那么僵硬。这个习惯期通常在第^2天或 第^3天开始 时发生。连接脑电图线时，用柔软的布轻轻覆盖小鼠的眼睛，以保持其平静并减少运动（补充图1）。如果事先正确操作，鼠标通常会保持静止，直到你调整鼠标的头销以便连接线缆。

基线脑电记录
6小时内记录的REM睡眠总量应超过每只小鼠15分钟。至少一侧的脑电信号...

Discussion

该方案使使用有对照小鼠的小鼠实现选择性REM睡眠剥夺。与传统方法如花盆和旋转盘技术不同，该系统允许实现精细匹配的对照组，使动物在同一昼夜节律时间内获得相同的刺激。此外，这种方法最大限度地减少了刺激位置的变异性，这是传统轻柔操作和气吹方法的常见局限。因此，这种技术可能能够更精确地分离REM睡眠功能。

该方案中的关键步骤是在REM睡眠剥夺过程中对鼻子进行精准且温和的刺激。对身体其他部位施加刺激可能会带来刺激效应的变异性。此外，非特异性或过度刺激可能诱发急性压力，削弱后续行为评估的可靠性。

另一个考虑因素是地板材料的使用量。过多的垫层可能遮挡受试者的鼻子，从而干扰刺激的传递。如果老鼠鼻子似乎堵塞，应在习惯化和基线记录期间逐渐减少地面材料的量。最后，如图1C，G所示，一些小鼠表现出相对较高或较低的快速眼动睡眠。这种变异性，尤其是REM睡眠时间相对较低的小鼠，可能是解读群体差异...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5%葡萄糖	大冢	35061410
6针头部	广濑	172-0989
粘合剂	小西	16351
麻醉机	信浓清作所	SN-487-0T
压接壳体	广濑	688-9095
压接套筒	广濑	688-8982
冰焰4	医学联合公司	RRID：SCR_014429	版本 4.104
GraphPad 棱镜	GraphPad	RRID：SCR_002798	版本 10.5.0
布洛芬	东京化学工业	I0415
异氟醚	维亚特里斯	901036504
洛克泰特454	亨克尔	UFI： MAK2-7WRP-G202-F235
鼠标（C57BL/6J）	杰克逊实验室	RRID：IMSR_JAX：000664	11.0 - 13.0周龄，恐惧条件反射课程
画笔	村台生堂	4943668000448	SDflat No.8，尖端长度：8.2 毫米;宽度：18.8毫米
普罗维尼斯液体	少府	21400BZZ00451000	250毫升
普罗维尼斯粉末	少府	21400BZZ00451000	250克
睡眠信号记录器	机声COMTEC	RRID：SCR_018200	版本 1.2.10
不锈钢螺丝	山崎	无	φ1.0 & 次数;2.0
标准立体定向仪器	美国图书馆协会科学	68038
葵花籽油	西格玛-奥尔德里奇	S5007-250ML
白色凡士林	太阳制药	K09-TS