衰老小鼠模型中的衰弱评估

摘要

本协议的目标是提供评估C57Bl / 6x129J实验室小鼠身体虚弱的说明和指南。解释了身体衰弱指数中使用的每项措施的具体细节。还介绍了几种报告虚弱结果的方法。

摘要

衰弱指数 （FI） 是评估衰老动物模型的有效方法，可作为生物年龄和健康寿命的替代衡量标准。虚弱代表了由于限制独立性的健康缺陷的积累而增加对不良后果的脆弱性。这个概念对于为人类老年科学提供信息的动物研究很有价值。例如，使用 FI 评分，可以通过其生物学年龄来区分具有相似实际年龄的动物。因此，FI 可用于临床前研究，以测量生物年龄、纵向跟踪虚弱情况并评估健康寿命。

最近使用 31 个与健康相关的缺陷开发了小鼠衰弱指数。然而，其长度和对专用设备的要求在实际使用中造成了限制。在这里，我们提出了一个经过调整的 16 项虚弱指数，该指数不包括需要特殊仪器或侵入性测试的参数。选定的缺陷易于观察或测量，并评估外皮、肌肉骨骼、神经肌肉、感觉、泌尿生殖系统和呼吸系统。测量体重用于纵向跟踪，但不包括在 FI 计算中。根据严重程度，每个缺陷的评分为 0、0.5 或 1，FI 计算为 16 个缺陷分数的平均值。

这种简化的 FI 可以快速评估大型队列，可以纵向应用于相同的动物，并且不需要专门的设备。我们在 C57BL/6×129 小鼠中证明了其可行性，显示了与年龄相关的虚弱增加、个体小鼠之间的差异以及检测多个系统缺陷的能力。该工具使实验室能够将虚弱纳入不同的实验设计中，为评估健康寿命提供了实用的方法，并增强了老年科学的转化相关性。该衰弱指数改编自先前验证的小鼠临床衰弱方法，旨在与正在进行的研究一起直接、纵向使用。

引言

虚弱包括对通常与高龄相关的不良健康结果的易感性增加 ^1,2,3。它表现为对压力源的恢复能力下降和正常生理功能的丧失，可能限制独立性并使老年人易患合并症和死亡率 ^3,4,5。虚弱可能有助于解释同一实际年龄的人之间常见的健康结果差异⁶.在人类中，虚弱评估包括虚弱表型 ^7,8 和虚弱指数 ^9,10,11，它们分别评估身体机能（例如虚弱、耐力或体重减轻）和跨器官系统的缺陷数量。动物研究纳入了五项身体标准虚弱评分以及 31 项虚弱指数^12、13、14。这两种方法都有其优点和缺点。虚弱表型可以很好地表征身体机能下降，对于对肌肉减少症、神经运动功能障碍或任何其他与衰老相关的身体机能变化感兴趣的项目具有价值。表型分析是非侵入性和非终末的。然而，这种量化虚弱的方法需要专门的设备（例如啮齿动物跑步机、旋转杆、跑轮和握力计）并且非常耗时。专注于身体机能的虚弱表型缺乏考虑各种身体系统虚弱的指数的稳健性。因此，为评估多个系统的缺陷而开发的衰弱指数创建了更全面的衰弱评级。它们通常也是非侵入性的，易于管理，并且不需要专门的设备或长时间。基于缺陷积累的虚弱指数不容易评估认知功能，并在评分缺陷中引入主观性，特别是在使用多个评估者的情况下，尽管可以通过讨论和完善评估技术来最大限度地减少这种主观性的影响¹⁵。

本方法的目标是使用简单实用的工具量化衰弱，允许将衰弱作为纵向结果添加到现有和未来的项目中。在制定适合这一目标的衰弱措施时，考虑了多种因素，其中之一是对专用设备的依赖。已经提出了几种衰弱表型分析方法，但它们需要的设备对于某些人来说可能无法使用或对于频繁使用来说不切实际。例如，一些虚弱表型研究中使用了开放场监测来测量探索行为和自愿身体活动^16,17。通过露天监测进行表型分析需要专门的相机和计算机设备，以及相当长的时间投入，因为小鼠单独经历适应和观察期。其他表型需要使用专门的设备，如啮齿动物跑步机和 Rotarods^13、18、19。对动物受试者进行一系列测试（包括这些和其他措施）的要求对于纵向研究设计中所需的频繁、重复的测试来说太大了，更不用说每个测试所需的动物适应和研究者培训了。因此，虽然不符合我们的目标，但衰弱表型和常用测试可以适用于需要横断面和不频繁纵向观察的实验。

衰弱指数通常是非侵入性的，可以实际集成到项目中，并且可以节省时间^12,20。使用索引还可以从已被证明是可重复和可靠的现有方法中提取细节^15,21。与多位具有评估小鼠虚弱经验的兽医人员合作，从更大的列表¹² 中选择了标准/缺陷的简短列表，包括外皮标准（脱发、皮毛颜色损失、皮炎、皮毛状况）、肌肉骨骼标准（脊柱后凸、尾部僵硬、肿瘤、腹部膨胀、身体状况评分）、神经肌肉（步态障碍、震颤）、感觉（白内障、眼睛分泌物/肿胀）、 泌尿生殖系统（直肠和阴道/脱垂）和呼吸系统（呼吸频率/深度）。这些缺陷是专门选择的，因为它们涵盖了全面的系统，并且除了露天和手动检查之外，无需设备或专门检查即可进行评估。这些从中提取的具体列表已经过临床验证¹²，并被多个实验室组^15,21 证实具有很高的评估者间可靠性。考虑到许多所选缺陷的主观性质，这是一个重要的考虑因素。从缩写指数中排除缺陷的原因包括需要某种形式的设备（握力、温度）专业化超出该简单指数的所需范围（胡须脱落、前庭障碍、角膜混浊、视力和听力损失、小眼症、流鼻涕、立毛），以及避免机构人道终点（腹泻、咬合不正、小鼠鬼脸量表）。因此，本工具代表了经过验证的 31 项索引的一个实用子集，旨在最大限度地减少设备需求和时间负担，同时保持多系统覆盖。重要的是要注意，本协议描述了一种可以调整更大的衰弱指数以适应给定实验目标的方法，为对评估小鼠衰弱的简化或定制工具感兴趣的研究人员提供指南。体重也包括在评估中，但不包括在衰弱指数的估计中，因为相互矛盾的报告表明体重增加和减少对衰弱的影响各不相同 12,14,22,23。缩短用于确定衰弱指数的缺陷列表的目的是突出此类指数的灵活性和适应性，同时将测量工具简化为所选标准，并保留对 C57Bl/6x129J 小鼠衰弱的综合评估。这一变化允许对虚弱进行全面评估，而无需使用设备密集型方法或复杂的检查。通过一些培训，研究人员可以预期，对于单只小鼠来说，这种对身体虚弱的全面评估将花费不到 2 分钟的时间，而对于更长的 31 项指数¹² 则需要近 4 分钟。

方案

所有小鼠（C57Bl / 6x129J）都是在梅奥诊所维持的菌落中繁殖的。小鼠按性别与同窝仔一起分组饲养，在特定的无病原体条件下保持 12 小时的明暗时间表，并随意获得食物和水。每2周评估一次12至30个月大的小鼠（n = 46;36只雌性）的便利样本，持续8个月。所有方案和动物护理指南均已获得妙佑医疗国际机构动物护理和使用委员会的批准（方案 A00003349,2023 年 10 月 5 日批准），符合美国国立卫生研究院指南。

1. 设置

注意：在身体虚弱评估期间，确保清洁无危险的工作空间来处理老鼠，并穿戴适当的个人防护设备。

1. 收集必要的设备——秤、用于记录数据的笔记本电脑或笔记本电脑，以及鼠标笼。

2. 身体虚弱评估

1. 考核分为三部分——露地检查、人工检查、称重。在一天中的一致地点和时间完成评估，以尽量减少焦虑或环境对缺陷的影响。
   1. 露天检查：将感兴趣的小鼠转移到开放环境中，检查一些身体特征，包括脱发、皮毛颜色脱落、皮炎、皮毛状况不佳、脊柱后凸、尾巴僵硬、步态障碍、震颤和呼吸异常。
   2. 手动检查：轻轻捶捶小鼠，让实验者进一步检查身体特征，包括脱发、皮毛颜色脱落、皮炎、肿瘤、腹部膨胀、白内障、眼分泌物、直肠脱垂、阴道/子宫/脱垂、身体状况评分不佳。
   3. 在露天和手动检查之后，称重小鼠。将每只动物之间的刻度归零，并将重量记录到最接近的 0.1 克。同样，确保评估的一天中的时间一致性，以尽量减少自然昼夜节律不一致。
2. 在评估每个小鼠笼后，通过用消毒剂或其他适当的清洁剂喷洒表面并用纸巾擦拭来清洁秤和空旷区域。

3、检查，包括以下17个特征和行为

1. 脱发-脱发和/或稀疏的迹象
   1. 在露天和手动检查期间评估脱发。脱发和稀疏的常见部位包括颈后/上背部、颈部和腋窝以及腹部。请注意，小鼠的下侧有天然的稀疏毛发区域，尤其是在关节附近。仅当脱发和稀疏超出在年轻、非虚弱小鼠中观察到的自然模式时，才计算脱发。
   2. 脱发评分如下：0 = 正常皮毛密度;0.5 ≤ 25% 的体表出现皮毛脱落;1.0 ≥ 25% 的体表显示皮毛脱落
2. 皮毛颜色损失 - 皮毛颜色发生变化，例如从黑色变为灰色、棕色或白色
   1. 评估露天和人工检查期间皮毛颜色的损失。皮毛颜色的变化通常从小鼠的下侧开始，但会随着虚弱的进行而发展为全身变化。
   2. 皮毛颜色损失评分如下：0 = 正常颜色;0.5 = 斑片状、焦点灰色、棕色或白色变化;1.0 = 体表 >25% 的灰色、棕色或白色皮毛
3. 皮炎-存在皮肤损伤
   1. 在露天和手动检查期间评估皮炎。存在任何表明皮炎的皮肤病变，大多数局灶性病变发现于颈部、侧腹和下巴下方。
   2. 皮炎评分如下：0 = 不存在;0.5 = 小尺寸局灶性病灶;1.0 = 多灶性或广泛性病变
4. 被毛状况-修饰不良的迹象
   1. 在露天检查期间评估皮毛状况。正常的皮毛状况通常存在于年轻、不虚弱的小鼠身上，包括光滑、光滑、有光泽的皮毛。荷叶边、乱七八糟和/或未修饰的皮毛是皮毛状况不佳的迹象，通常伴随着脱发和皮毛颜色的变化。
   2. 对涂层条件进行评分如下：0 = 光滑、光滑、有光泽的涂层;0.5 = 略带褶皱;1.0 = 蓬头垢面、未修饰、乱蓬蓬的外观
5. 脊柱后凸-脊柱弯曲或驼背姿势的存在
   1. 在露天检查期间评估脊柱后凸。脊柱后凸最常见于上背部，并且表现为明显的凹弯曲度，超出了任何年轻、非虚弱小鼠的弯曲。为了确认是否存在脊柱后凸，请触诊上脊柱以检查是否有后凸弯曲。寻找脊柱后凸后的永久驼背姿势，这种姿势将作为全身预感到明显，而不是更局部的脊柱后凸弯曲。
   2. 评分后凸如下：0 = 无颈椎至胸椎弯曲（约 180° 至 150°）;0.5 = 颈椎至胸椎轻微弯曲（约 150° 至 130°）;1.0 = 显着曲率 （<130°） 和相关的驼背姿势
6. 尾部僵硬——对轻触缺乏卷曲反应
   1. 在露天检查期间评估尾部僵硬情况。当鼠标自由移动时，用手指轻轻抚摸尾巴。健康老鼠的尾巴在触摸手指时会缠绕在手指上。当鼠标放松时，最好观察到这一点。
   2. 分数尾部硬化如下：0 = 无;0.5 = 尾巴反应灵敏但不卷曲;1.0 = 尾巴对触摸没有反应
7. 步态障碍-运动异常
   1. 在露天检查期间评估是否存在步态障碍。步态的常见变化包括拖拽四肢、盘旋、摇摆和宽站姿。使用攀爬能力来评估步态，方法是将鼠标放在一个大的笼子盖上，倾斜盖子，然后轻轻刷过鼠标的后部以激发攀爬的动力。
   2. 步态障碍评分如下：0 = 无;0.5 = 步态异常，但小鼠可以行走;1.0 = 明显的步态异常，损害自由移动的能力
8. 震颤 - 无端颤抖或颤抖
   1. 评估露天观察期间的震颤。在休息和运动期间监测小鼠是否存在震颤，通常表现为爪子颤抖。
   2. 震颤评分如下：0 = 无震颤;0.5 = 行走或高水平活动期间爪子颤抖或震颤;1.0 = 明显震颤，自由移动能力受损
9. 呼吸频率/深度-呼吸努力异常
   1. 评估露天检查期间的呼吸频率/深度。对在年轻、非虚弱小鼠中观察到的休息时正常、规律呼吸的任何变化进行评分。通常，变化包括呼吸频率增加和呼吸深度减少。
   2. 呼吸频率/深度评分如下：0 = 正常;0.5 = 速率/深度的适度变化;1.0 = 速率/深度的显着变化，或喘气。
10. 肿瘤-存在异常肿块
    1. 在手动检查期间评估肿瘤的存在。在给鼠标弄皱时，检查鼠标是否有可见的肿瘤，并用手指沿着鼠标的下侧移动以检查是否有可触及的肿瘤。可见的不对称是潜在肿瘤的征兆。如果可能的话，可以在 尸检后 确认肿瘤的存在。
    2. 对肿瘤进行评分如下：0 = 无;0.5 = 一个体积小于 1 cm³ 的肿瘤;1.0 = 体积大于 1 cm³ 的单个肿瘤或多个较小的肿瘤
11. 腹部膨胀 - 胸腔下方存在多余的隆起
    1. 在手动检查期间评估腹部扩张的情况。在给鼠标弄皱时，评估是否存在过多的膨胀或腹腔积液。寻找胸腔下方是否有轻微的隆起，腹部是否有明显的 W 形隆起，并且在检查时可触及。
    2. 对腹部膨胀进行评分如下：0 = 无;0.5 = 轻微凸起;1.0 = 明显膨胀，肋骨下方呈 W 形凸起
12. 白内障 - 存在眼睛混浊/白斑
    1. 在手动检查期间评估白内障。在颛遢时，评估小鼠的眼睛是否角膜混浊。至少一只眼睛完全混浊算作 1.0。
    2. 白内障评分如下：0 = 无;0.5 = 小的不透明斑点/一个或两个角膜的变化;1.0 = 两个角膜之一的明显混浊/斑点
13. 眼睛分泌物-眼睛周围体液积聚
    1. 在手动检查期间评估眼睛分泌物。在颛颈时，评估小鼠的眼睛是否有分泌物、结痂或眼睛边缘变色的证据。分泌物通常是干燥的，与肿胀有关，并会导致年轻、不虚弱的小鼠正常、光滑、黑色的眼睛颜色发生变化。
    2. 对眼部分泌物进行评分如下：0 = 正常;0.5 = 一只或另一只眼睛周围轻微肿胀和/或分泌物;1.0 = 一只或两只眼睛周围明显肿胀和/或分泌物
14. 直肠脱垂-直肠异常挤压
    1. 在手动检查期间评估直肠脱垂。在没有明显拉伤的情况下，检查是否有脱垂组织的迹象。对任何从肛门脱垂的直肠组织进行评分。
    2. 直肠脱垂评分如下：0 = 无脱垂;0.5 = 一些脱垂的组织，看起来很健康;1.0 = 显着脱垂的组织，不健康的组织。
15. 阴道/子宫/脱垂-生殖器异常挤压
    1. 在手动检查期间评估阴道/子宫/脱垂。在没有明显拉伤的情况下，检查是否有脱垂组织的迹象。对任何生殖器脱垂进行评分。
    2. 阴道/子宫/脱垂评分如下：0 = 无脱垂;0.5 一些脱垂的组织，看起来很健康;1.0 = 显着脱垂的组织，不健康的组织。
       注意：脱垂可能是由于处理造成的痛苦而发生的，因此如果怀疑存在缺陷，请将鼠标放回空旷的场地上，抬起尾巴以确认是否存在脱垂的组织。
16. 身体状况评分 - 存在过多或最少的脂肪以及肌肉质量损失的证据
    1. 在手动检查期间评估身体状况评分。在给鼠标牵颈时，注意覆盖下背部和耻骨的脂肪量;虚弱通常会导致该区域的脂肪减少。与年轻、非虚弱的小鼠相比，适度的脂肪减少导致骨骼更突出的评分为 0.5。一旦骨骼变得非常突出，甚至锋利，或者肌肉质量明显减少，分数将为 1.0。
    2. 对身体状况评分如下：0 = 骨骼可触及但不突出;0.5 = 骨头突出和/或几乎感觉不到;1.0 = 骨骼非常突出和/或感觉不到。
17. 在露天和手动检查后的一天中的一致时间（例如，在非活动期开始后的 2 至 4 小时内）进行体重评估。
    1. 在虚弱测量后评估体重。

4. 实施身体虚弱评估

注意：该评估的大部分实施应根据实验者的需求及其实验目标进行定制。此处提供的详细信息可以作为如何实施虚弱评估的示例，并为一般目的提供一些有用的指导。

1. 频率：一旦确定了要评估的小鼠队列或群体，每 2 周进行一次身体虚弱评估。在评估期间保持评估的时间和日期一致。
2. 数据记录：在评估每只小鼠期间，评估每个衰弱测量值的分数（0、0.5 或 1.0）并记录体重;使用所有 16 个缺陷的平均值作为最终的虚弱分数。记录有关小鼠健康和行为的任何相关记录，包括在后续评估和异常后处理行为中需要更多关注的任何措施的更改。不对先前的分数进行重新评分。将虚弱指数计算为 16 个赤字分数 （0/0.5/1.0） 的算术平均值，明确将体重排除在计算之外。
   注意：在纵向评估期间，确保将正确的数据归因于正确的小鼠至关重要。

结果

使用此处描述的指数评估自然衰老的C57Bl / 6x129J小鼠的便利样本的虚弱程度。每只12个月以上的小鼠（n = 46;36只雌性）每2周进行一次评估，评估期持续约6个月。选择四个感兴趣年龄（12、18、24 和 30 个月）的横断面队列来评估年龄组的衰弱指数评分，分别代表 100%、95%、80% 和 30% 的生存率，²⁴。随着年龄的增长，虚弱率呈持续上升趋势（图 1）。18 个月和 24 个月组还用于检查不同年龄和性别的缺陷频率（图 2）。值得注意的是，在感兴趣的时间点，评估的 16 个缺陷中只有 10 个存在于特定时间点的特定小鼠中，其中 6 个不存在是皮炎、尾部僵硬、呼吸频率/深度、肿瘤、白内障和阴道/子宫/脱垂。脱发、后凸和皮毛颜色脱落是 18 个月时最常见的缺陷，身体状况评分和皮毛状况不佳在 24 个月时...

讨论

该衰弱指数成功的关键是评估缺陷可能存在的许多主观标准时的一致性。可以采取几个步骤来确保结果的质量和该指数的整体可靠性。在观察期间可以使用相同的研究者，确保在动物和时间点上给出相同的缺陷评分判断。如果实验设计或后勤工作阻止了这种一致性，则每个研究者在比较分数和注释之前都应独立熟悉该指数，以达成一致的类似判断缺陷的协议。研究人员使用基于缺陷累积的类似衰弱指数的可靠性已得到充分证明。多个实验室小组已经证实了 Whitehead 及其同事开发的衰弱指数的评估者间可靠性¹²，从中得出了该简化指数中使用的缺陷^18,21。对于建立可靠性至关重要的是对每个标准¹⁵ 的细化分数描述，这些标准已为为当前指数选择的 16 个标准提供了。因此，本手稿中对缺陷严重程度的评估反映了支持在计算衰弱指数时使用主观测量的现有数据。因此，根据特定研究所需的衰弱特征，可以定制衰弱指数，以简化横断面...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
数字秤（多单元）	树状结构	KHR3001
过氧化物甘 即用	Virox 科技公司	PRTU242101	消毒剂