方法文章

源自患者的三维肿瘤类器官模型 体外 嵌合抗原受体T细胞筛选

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DOI：

10.3791/69113

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2025年12月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

本文内容

摘要

本方案建立了一种 体外 利用患者来源的肿瘤类器官与嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）共培养模型评估CAR-T细胞对实体瘤细胞的特异性细胞毒活性。

摘要

嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中已取得令人瞩目的临床疗效，但针对实体瘤的CAR-T细胞疗法仍需进一步开发。患者来源的肿瘤类器官是 体外 保留患者异质性的疾病模型，已被用于评估化疗药物和靶向药物的有效性与安全性。该方法描述了一种 体外 CAR-T细胞与肿瘤类器官共培养的药效测试模型。将来自患者的结直肠癌样本在基底膜基质中构建为具有三维（3D）结构的肿瘤类器官。肿瘤类器官可稳定生长并连续传代。通过洗涤和离心将成熟的肿瘤类器官从基质中分离，按不同的效应细胞与靶细胞（E:T）比例加入CAR-T细胞，建立免疫类器官共培养体系。共培养6–24小时后，通过明场成像观察类器官的形态及细胞间结构。本实验进一步在共培养体系中进行死细胞染色，以反映类器官的存活状态，评估CAR-T细胞对肿瘤类器官的细胞毒性作用。该实验可有效观察CAR-T细胞与3D肿瘤类器官之间的相互作用，实验结果可用于评价CAR-T细胞的肿瘤杀伤活性。

引言

嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面已显示出显著的临床疗效1。然而，由于存在多个主要障碍，其在实体瘤中的应用仍受到限制，这些障碍包括肿瘤异质性和抗原丢失、肿瘤组织内部的物理和化学屏障，以及免疫抑制性的肿瘤微环境2,3。这些挑战导致CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗中的疗效有限。

体外评估CAR-T细胞的疗效是临床前研发过程中的关键步骤。最常用的模型是肿瘤细胞系，这些细胞系可能表达特定的肿瘤相关抗原，或经基因工程改造携带报告基因（如荧光素酶）4,5。因此，基于传统细胞系的检测结果往往难以预测临床疗效。患者来源的肿瘤模型为更准确地评估CAR-T细胞在实体瘤背景下的功能提供了有前景的替代方案。

尽管已有若干研究开始利用患者来源的肿瘤类器官（PDTO）进行CAR-T细胞评估，但在建立标准化、稳健且可及的共培养方案方面仍存在挑战，这些方案需有效平衡3D肿瘤结构的维持与免疫细胞-肿瘤细胞间的高效相互作用。患者来源的肿瘤类器官（PDTO）是由患者肿瘤组织或细胞建立的三维（3D）ex vivo疾病模型。PDTO已成功应用于多种肿瘤类型，包括结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌。这些结构保留了原始肿瘤的组织学结构、分子特征及功能异质性6。与原代肿瘤细胞和患者来源的异种移植模型（PDX）一起，PDTO代表了一种用于模拟患者特异性疾病特征的重要平台7。与传统的肿瘤细胞系或原代培养相比，PDTO更真实地再现了in vivo肿瘤微环境 ，表现出复杂的细胞组成和结构组织8。此外，PDTO在长期传代过程中保持基因组稳定性并保留基因表达模式，从而能够更准确地评估治疗反应9,10。PDTO已被成功应用于肿瘤生物学研究、药物筛选和精准医学，并因其在免疫治疗测试中的潜力而日益受到重视，包括用于发现新的CAR靶点、优化CAR设计以及评估细胞毒性6,11,12,13。类器官培养的一个常见局限性是其依赖细胞外基质（ECM）成分（如Matrigel，下文简称基底膜基质[BMM]）来维持3D结构，这可能阻碍共培养实验中免疫细胞的浸润。为确保共培养过程中的一致性和最佳细胞相互作用，通常选择处于特定尺寸范围（例如直径100–200 µm）内的类器官。

本方案描述了一种利用结直肠癌来源的患者来源类器官（PDTOs）评估CAR-T细胞毒性的共培养平台。患者肿瘤组织经酶解消化后，在BMM培养基中培养以生成三维类器官。待类器官成熟并扩增后，分离大小均一的类器官并进行荧光标记。 将PDTOs以不同的效应细胞与靶细胞（E:T）比例接种于多孔板中，并与CAR-T细胞共培养。该方法的一个关键特征是在共培养前有意识地将PDTOs从BMM中移除，从而在维持其三维结构完整性的悬浮状态下，使CAR-T细胞能够直接且无阻碍地接触肿瘤类器官。24小时后，明场显微镜观察显示PDTOs出现进行性解体，表现为三维形态破坏、肿瘤细胞皱缩以及活力丧失。活细胞成像和荧光显微镜进一步可视化了荧光标记的CAR-T细胞与肿瘤靶细胞之间的相互作用。通过定量细胞死亡检测评估细胞毒性。这种基于类器官的免疫共培养体系为评估CAR-T细胞的抗肿瘤疗效提供了一个稳健且患者特异性的平台 离体，从而实现治疗方案的优化并支持临床转化。

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方案

使用结直肠癌患者来源的类器官。肿瘤组织碎片取自未经治疗且经组织学确诊为原发性结直肠腺癌（CRC）的患者。所有组织均来自内镜活检标本 在深圳市前海蛇口自由贸易区医院的标准诊断过程中收集。所有供体组织均经机构病理学家通过组织病理学检查确认为结直肠癌（CRC）。本方案遵循机构指导原则。已获得书面知情同意 所有患者均签署了知情同意书。本研究已获得深圳前海蛇口自贸区医院伦理委员会批准（2024KY-009-01K）。

1. PDTO 培养

  1. 组织准备
    1. 将通过结肠镜活检获得的、经组织学确诊为原发性结直肠腺癌（CRC）的肿瘤组织碎片放入无菌的50 mL离心管中。
    2. 加入30 mL冷的组织洗涤液，该溶液由Hanks平衡盐溶液（HBSS）、1%牛血清白蛋白（BSA）、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素、50 µg/mL庆大霉素、5 µg/mL两性霉素B和10 µM Rho相关激酶抑制剂（Y-27632）组成。
    3. 将离心管置于冰上，轻轻摇动5分钟以洗涤组织。
    4. 使用新的组织洗涤液重复步骤1.1.3两次。
  2. 组织消化
    1. 去除坏死或脂肪组织，并将肿瘤切成 组织碎片。
    2. 将8 mL消化液（DMEM培养基、500 U/mL IV型胶原酶、1.5 mg/mL II型胶原酶、20 µg/mL透明质酸酶、0.1 mg/mL II型中性蛋白酶、10 µM Y-27632和1%胎牛血清）预热至37 °C。
    3. 将组织碎片转移至消化缓冲液中，在37 °C水浴中孵育。每5分钟用手轻轻旋转离心管约10秒，以促进酶的渗透。
      注意：根据组织块大小调整消化缓冲液体积。通常情况下，内镜活检样本使用8–10 mL即可。
    4. 15分钟后在显微镜下观察，检查解离状态。若仍有组织碎片存在，继续消化，最长不超过30分钟。
    5. 当可见细胞团时，使用10 mL移液器轻柔吹打5–10次进行机械解离。在350 × g条件下离心5分钟。
    6. 弃去上清液；将沉淀物重悬于10 mL洗涤液中，在350 × g条件下离心5分钟。重复洗涤两次。
      注意：PDTOs通常在培养后3–5天内开始形成致密的球形结构。类器官表现出良好的增殖能力，并在第10–14天达到适合实验的尺寸（直径约100–200 µm）。为维持健康生长并防止过度融合或中心坏死，每7–10天传代一次。通常每份活检样本（2 mm³组织碎片）使用8–10 mL消化液，确保TrypLE Express的终工作浓度为1×。

2. PDTO 的构建

  1. 基质胶包埋
    1. 将 200 µL 预冷至 4 °C 的 BMM 加入洁净离心管中，使用预冷的移液枪头反复吹打细胞沉淀至少 10–15 次，直至悬液均匀，无可见团块。
    2. 将约 30 µL 的悬液滴加至 24 孔板的每个孔中。于 37 °C 孵育 10 分钟以使其凝固。
    3. 每孔加入 500 µL 类器官培养基（Advanced DMEM/F12 培养基，含 50 µg/mL R-spondin 1、10 µg/mL Noggin、500 µg/mL EGF、100x HEPES、100x Glutamax、500x Normocin、500x 庆大霉素/两性霉素 B、50x N2、100x B27、500 mM N-乙酰半胱氨酸、1 M 烟酰胺、5 mM Alk 4/5/7 抑制剂、30 M p38 抑制剂、100 µM 胃泌素和 100 µM 前列腺素 E2）。
      注意：每滴使用约 30 µL BMM；根据细胞密度进行调整。
  2. 培养维护
    1. 在 37 °C、5% CO2 条件下培养类器官，每 3 天更换一次培养基。
    2. 每日观察类器官形成情况。预计第 3 天可见小型球状体。
    3. 在第 6 至 10 天评估类器官建立是否成功。形成时间（介于 3 至 14 天之间）取决于组织活性和干细胞特性。

3. PDTO 的传代

  1. 解离
    1. 将离心机预冷至 4°C。吸除培养基，加入 1 mL 冰冷的 HBSS，轻轻吹打 3–5 次以分散 BMM。
      注意：生长良好的类器官肉眼可见为微小的白色斑点。
    2. 将悬液转移至无菌的 15 mL 离心管中，在 350 × g 下离心 5 分钟。
  2. 酶解消化
    1. 弃去上清液，加入 1 mL TrypLE。置于 37 °C 水浴中孵育 2 分钟。
    2. 加入 2 mL HBSS 以中和 TrypLE；在 350 × g 下离心 5 分钟。
    3. 移除上清液，用 2 mL HBSS 重悬沉淀。再次在 350 × g 下离心 5 分钟。
  3. 重新包埋
    1. 按 1:3–1:6（类器官沉淀体积 : BMM 体积）的比例向沉淀中加入新鲜 BMM，轻轻重悬。每滴体积约为 30 µL。将液滴转移至新的 24 孔板中，在 37 °C 下孵育 10 分钟。
    2. 每孔加入 500 µL 培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。
    3. 每日观察各孔，约 48 小时内可见类器官三维结构重新组装。
    4. 经过 3–5 次传代后，选取健康的类器官用于后续实验或冻存。

4. CAR-T 细胞与 PDTO 的共培养

  1. 共培养基制备
    1. 在基础类器官培养基中添加 10 ng/L IL-2 和 0.05 mM β-巯基乙醇，以维持 CAR-T 细胞的存活能力。
      注意：基础培养基可支持 PDTO 的三维结构和存活。
  2. PDTO 制备
    1. 使用无菌细胞刮刀或移液器吸头，从培养板中取出含有成熟 PDTO（例如第 4–6 天）的 BMM 液滴。
    2. 将 BMM/PDTO 混合物转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
    3. 向管中加入 5–10 mL 冰冷的 HBBS 或组织洗涤液（如步骤 1.1.2 所述），轻轻倒置 5–10 次，使类器官从 BMM 中脱离。
    4. 将混合物置于冰上静置 5 分钟。BMM 将变为液态，而解离的 PDTO 保持悬浮状态。
    5. 小心吸除含有 BMM 的上清液，保留 PDTO 沉淀。避免扰动沉淀。
    6. 重复步骤 4.2.3 至 4.2.5 两次，以确保完全去除 BMM。
    7. 最后一次洗涤后，收集含有 PDTO 的上清液，在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
    8. 吸除上清液，将 PDTO 沉淀重悬于 1–2 mL 类器官培养基或共培养基中。
    9. （可选，用于计数）制备单细胞悬液。
      1. 如需精确计数，将重悬的类器官转移至新管中，加入预热的 TrypLE Express，在 37 °C 孵育 3–5 分钟，随后轻轻吹打以获得单细胞悬液。进行细胞计数（例如使用血细胞计数板或自动细胞计数仪）。
        注意：此步骤会解离类器官，仅用于重新铺板前的计数目的。
    10. 大小筛选与标准化：为确保共培养中类器官大小一致，将重悬的 PDTO（来自步骤 4.2.8）通过置于 50 mL 圆锥形离心管上的 70 µm 细胞筛。此步骤可去除大块类器官聚集体和碎片，获得适合均一化共培养的标准尺寸组分。
    11. 将标准化后的类器官悬液在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
    12. 吸除上清液，将标准化后的 PDTO 重悬于适量预热的共培养基中。
    13. 对标准化后的 PDTO 进行计数（例如在显微镜下使用血细胞计数板，统计每视野类器官数量）。
      注意：计数基于类器官数量，而非细胞数量。
    14. 将标准化后的 PDTO 以目标数量接种至所需的多孔板中（例如 96 孔 U 型底板）。
    15. 按所需的效应细胞与靶细胞（E:T）比例向各孔中加入 CAR-T 细胞。
  3. 标记 PDTO
    1. 将离心机预冷至 4 °C。吸除培养基，加入 1 mL HBSS 以脱离液滴。
    2. 转移至 15 mL 离心管，加入 4 mL HBSS，轻轻吹打。在 350 × g 下离心 5 分钟。
    3. 弃去上清液，加入 5 mL HBSS，轻轻吹打。再次在 350 × g 下离心 5 分钟。
    4. 配制 Hoechst 33342 工作液。
    5. 将沉淀重悬于 1 mL Hoechst 33342 溶液（终浓度 5 µg/mL）中，轻轻倒置 3–5 次以确保染料均匀渗透。用铝箔包裹管子避光。在 37 °C 孵育 10 分钟。染色后用 HBSS 洗涤两次，以去除过量染料。
  4. PDTO 铺板
    1. 按凝胶液滴与孔比例 1:5 估算类器官密度；将类器官重悬于共培养基中，浓度约为 1 × 103 个类器官/mL。
    2. 每孔加入 100 µL 至 96 孔板中；每种条件至少设置三个重复。
      注意：此阶段无需进行细胞计数；类器官应保持完整。
  5. CAR-T 共培养
    注意：本方案重点介绍 CAR-T 细胞与 PDTO 的共培养及疗效评估。本研究中所用 CAR-T 细胞的制备与表征详见第 8 节。
    1. 在对数生长期收获 CAR-T 细胞。用台盼蓝染色确认细胞活力 >95%。
    2. 在 350 × g 下离心 5 分钟；重悬于共培养基中。
    3. 调整浓度至 4 × 106/mL、2 × 106/mL 和 1 × 106/mL。
    4. 根据实验设计，每孔加入 100 µL CAR-T 悬液。对照孔中加入 100 µL 共培养基。
    5. 将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 6–24 小时。

5. 死细胞染色

  1. SYTOX Green 染色
    1. 对于每 1 × 105 个细胞，通过将 1 µL SYTOX Green（1000 倍浓缩液）加入 1 mL 检测缓冲液中，配制 100 µL 核绿色染色溶液。
    2. 在共培养 6 小时和 24 小时的时间点，每孔加入 100 µL SYTOX Green 染色溶液。在 37 °C 避光孵育 20 分钟。

6. 图像采集

  1. 吸弃上清液，加入 100 µL DMEM/F12 培养基。
  2. 使用显微镜（例如共聚焦显微镜）采集明场和荧光图像：
    Hoechst 33342（PDTOs）：激发（Ex）/发射（Em）= 350 nm/461 nm
    mCherry（CAR-T）：Ex/Em = 587 nm/610 nm
    SYTOX Green（死细胞）：Ex/Em = 504 nm/528 nm
  3. 每孔至少采集三个重复图像，聚焦于中央区域。

7. 数据分析

  1. 启动 ImageJ（版本 1.54，NIH，https://imagej.nih.gov/ij/）；导入 SYTOX Green 荧光通道图像。手动设置阈值以区分荧光信号与背景（图像 > 调整 > 阈值）。
  2. 使用 分析 > 测量 功能计算积分密度。将数据导出为 .csv 格式，用于后续在合适的统计分析软件（例如 GraphPad Prism）中进行统计分析。
  3. 设置阈值以分离荧光信号与背景。
  4. 选中整个视野；运行 分析 > 测量 以计算总荧光信号强度。
  5. 导出数据并进行统计分析，比较处理组与对照组在 24 小时时点的差异。

8. CAR-T 细胞的制备与表征

  1. CAR 构建体设计
    注意：本研究中使用的 CAR-T 细胞靶向 B7-H3（由 CD276 基因编码），该抗原在结直肠癌中常呈高表达14。CAR 构建体包括：
    胞外域：来源于抗 B7-H3 克隆 376.96 单克隆抗体的单链可变区片段（scFv）。
    铰链区和跨膜区：CD8α 铰链区和跨膜区。
    共刺激域：人源 CD28。
    ​信号传导域：人源 CD3ζ。
  2. CAR-T 细胞制备
    1. 分离：采用 Ficoll-Paque 密度梯度离心法从健康供体的血沉棕黄层中分离外周血单个核细胞（PBMCs）14。
    2. 激活：在含有 10 ng/mL IL-7 和 5 ng/mL IL-15 的 T 细胞培养基中，使用包被型抗 CD3/CD28 抗体激活人 PBMCs，持续 48 小时。T 细胞培养基的配制方法为：将等体积（各 250 mL）的 RPMI 1640 和 Click's 培养基混合，并添加 10% 胎牛血清（FBS）、1× GlutaMAX 和 1% 青霉素-链霉素（Pen/Strep）。
    3. 转导：如先前所述15，使用纤连蛋白（retronectin）包被的培养板，以逆转录病毒上清液对活化的 T 细胞进行转导。
    4. 扩增：转导后第 3 天收获 T 细胞，并在含 IL-7 和 IL-15 的完全人 T 细胞培养基中继续培养 7–9 天，随后进行表征和功能检测。
  3. CAR-T 细胞表征
    1. CAR 表达：转导后 5–7 天，使用重组 B7-H3-Fc 蛋白结合流式细胞术检测 CAR 表达，随后加入荧光标记的抗人 Fc 二抗进行检测14。典型的转导效率（CAR+ 细胞）为 80% 至 90%。
    2. 表型分析：使用抗 CD3、CD4、CD8、CD45RA、CCR7 等抗体，通过流式细胞术对 T 细胞亚群（如 CD4+、CD8+ 等）进行表型分析14。
    3. 功能验证（可选的共培养前检测）：在共培养实验前，通过将 CAR-T 细胞与 B7-H3 阳性和 B7-H3 阴性靶细胞系共培养，检测细胞因子释放（如 ELISA 检测 IFN-γ）或细胞毒性（如流式细胞术检测15），以验证其功能活性。
  4. 共培养前准备（PDTO 检测）
    1. 在 T 细胞对数生长期（通常为激活后第 10–14 天）进行共培养。使用前用 HBSS 洗涤细胞两次，以去除 IL-7/IL-15，并将细胞重悬于步骤 4.1 所述的共培养培养基中。
    2. 通过台盼蓝染色确认细胞活力 >95%。
    3. 形态学检查：在培养第 3–5 天观察是否存在直径为 50–100 µm 的小球形细胞簇，在第 10–14 天观察是否存在直径为 100–200 µm 的成熟类球体。

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结果

结直肠癌类器官成功地从内镜活检样本中建立（图1），其肿瘤特性经病理学诊断确认（图2）。肿瘤组织碎片在BMM培养基中培养后24小时内开始形成三维结构。第一代类器官（P0）在培养第7至14天之间进行传代。类器官表现出多种形态，包括球形、囊状和环形结构（图2A）。

采用荧光成像系统监测PDTOs与CAR-T细胞在24小时共培养期间的相互作用。肿瘤类器官用Hoechst 33342标记，CAR-T细胞表达mCherry。荧光显微镜观察显示，在6小时时，CAR-T细胞均匀分布在孔板底部；到24小时时，CAR-T细胞开始在肿瘤类器官周围聚集（图3）。

为评估CAR-T细胞密度对细胞毒性的效应，测试了三种不同剂量的效应细胞（1 × 105、2 × 105 和 4...

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讨论

本文介绍了一种评估CAR-T细胞对PDTOs细胞毒性的方法，结合明场成像与荧光染色技术来检测类器官的存活状态。这种双模态方法能够在三维模型系统中有效可视化肿瘤细胞的死亡，并对CAR-T细胞的细胞毒性提供半定量评估。

该方案的一个关键组分是培养基。由于CAR-T细胞和肿瘤类器官具有不同的营养需求，首先评估了CAR-T细胞与类器官培养基的兼容性。与标准T细胞培养基相比，CAR-T细胞在类器官培养基中维持了更佳的存活率和增殖能力（补充 图1）。相反，类器官在T细胞培养基中迅速丧失存活率和结构完整性。因此，选择类器官培养基作为共培养的基础，并添加IL-2和β-巯基乙醇以促进T细胞活化。这些添加物常用于增强T细胞的增殖和功能。

维持三维肿瘤类器官结构的完整性对于准确模拟肿瘤微环境至关重要。然而，用于类器官包埋的基质凝胶可能抑制CAR-T细胞的迁移，从而限制其与肿瘤细胞的接触。在CAR-NK-92共培养模型中也已有类似报道，其中免疫细胞无法浸润凝胶基质16

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到中国国家重点研发计划（2022YFC2304400，2022YFC2304401）、南山区医疗卫生科技项目（NSZD2024046，NS2024105）和深圳市医学研究基金（D2401023）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 离心管SAINING3030100
24 孔板CORNING3524
50 mL 离心管SAINING3030000
96 孔板CORNING3599
Advanced DMEM/F12 培养基GibcoC11330500BT
Alk 4/5/7 抑制剂MCEHY-10432 
B27 添加剂Gibco17504044
生物安全柜（II 级）Thermo FisherN/A
牛血清白蛋白Sigma AldrichA9056
细胞培养皿BIOFILTCD010060
离心机Eppendorf5810R
Click's 培养基FUJI FILM9195
CO₂ 培养箱YamataIP610
胶原酶 IISolarbioC8150
胶原酶 IVSigma AldrichC9407
共聚焦激光显微镜ZeissLSM900
冷冻保存液ZENOAQCELLBANKERTM2
消化缓冲液实验室自制试剂N/A组分详见文稿
数字振荡器MIULABHS-25
Dispase II 型酶Sigma-aldrichD4693
DMEM 培养基GibcoC11995500BT
Dynabeads 人 T 细胞激活剂 CD3/CD28Thermo Fisher11131D
EGFPeproTechAF-100-15-500UG
胎牛血清Gibco1631389
胃泌素GlpBioGA20228
庆大霉素/两性霉素 BGibcoR0151
GlutamaxGibco35050061
Hanks 平衡盐溶液GibcoC14175500BT
HEPESGibco15630080
Hoechst 33342 BeyotimeC1027
透明质酸酶Solarbioh8030
IL-15Peprotech200-15-10UG
IL-2NovoproteinCK24-10
IL-7Peprotech200-07-10UG
ImageJNIH（开源软件）https://imagej.nih.gov/ij/
倒置 荧光显微镜MshotMF52-N
MatrigelCorning356231
N2 添加剂Gibco17502048
N-乙酰半胱氨酸Sigma AldrichA7250-5G
烟酰胺Sigma AldrichN0636-100G
NogginPeproTech120-10C-20
NormocinInvivoGenant-nr-1
类器官培养基实验室自制试剂N/A组分详见文稿
p38 抑制剂MCEHY-10295 
青霉素-链霉素Gibco15140122
前列腺素 E2MCEHY-101952 
Rho 相关激酶抑制剂 Stem cell72304
RPMI 1640 培养基HyCloneSH30809.01B
R-spondin 1PeproTech120-38-20UG
S1 移液器吸头Thermo Scientific9501
血清移液管BIOFILGSP-010-050
单通道移液器Eppendorf3123000063
单通道移液器Eppendorf3123000055
单通道移液器Eppendorf3123000098
单通道移液器Eppendorf3123000022
无菌一次性手术刀Tech-SSSD10
SYTOX GreenBeyotimeC1181S
TexMACS 培养基Miltenyi Biotec130-097-196
恒温水浴箱BluepardBWS-10
台盼蓝PhygenePH0519
TrypLE ExpressGibco12605028
β-巯基乙醇Gibco21985023

参考文献

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